הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64690

⸱

11 בנובמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בשילוב עם זיהוי רב-תבניות של טביעות אצבע כימיות, המספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של הזנים האמיתיים של Clematidis Armandii Caulis וחומרי הניאוף שלו.

תקציר

שיטה לזיהוי חומרי מרפא סיניים וחומרי הניאוף הקשורים אליהם נבנתה על ידי לקיחת Clematidis Armandii Caulis (צ'ואנמוטונג, רפואה סינית מסורתית בשימוש אוניברסלי) כדוגמה. עשר אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים וחמש אצוות של ניאוף קשורים נותחו והושוו בהתבסס על טביעות האצבע של הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC) בשילוב עם כימומטריה, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח אפליה אורתוגונלית של ריבועים מינימליים (OPLS-DA). בנוסף, התוכן של β-sitosterol נקבע. טביעת האצבע הכימית של צ'ואנמוטונג הוקמה, וזוהו 12 פסגות נפוצות. הדמיון בין טביעת האצבע של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים לבין טביעת האצבע של הבקרה היה 0.910-0.989, בעוד שהדמיון בין חמש אצוות של ניאוף היה רק 0.133-0.720. בהתבסס על הפסגות הנפוצות בכרומטוגרמה, 15 אצוות של דגימות סווגו לשלוש רמות תוכן על ידי PCA, ונצברו לארבע קטגוריות על ידי CA, והשיגו הבחנה ברורה בין צ'ואנמוטונג אותנטי לבין ניאוף של צ'ואנמוטונג. יתר על כן, שבעה מרכיבים דיפרנציאליים שיכולים לזהות ביעילות צ'ואנמוטונג אותנטי וחומרי ניאוף של צ'ואנמוטונג נמצאו באמצעות OPLS-DA. תכולת β-סיטוסטרול של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים הייתה 97.53-161.56 מיקרוגרם/גרם, בעוד שתכולת β-סיטוסטרול של חמש קבוצות הניאוף הייתה שונה מאוד, ביניהן תכולת β-סיטוסטרול של Clematis peterae Hand.-Mazz. וקלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils. היה נמוך משמעותית מזה של זנים אותנטיים של Chuanmutong. תכולת רכיבי אינדקס HPLC ושיטת זיהוי טביעות אצבע כימיות מרובות תבניות שנקבעו במחקר זה מספקות אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחומרי ניאוף קשורים.

מבוא

צ'ואנמוטונג, קאולי יבש של קלמטיס ארמנדי פראנץ'. או Clematis מונטנה Buch.-Ham., היא רפואה סינית מסורתית המשמשת בדרך כלל במרפאות 1,2,3. הוא משמש לטיפול בבעיות במתן שתן, בצקת, פצעים על הלשון והפה, ירידה בהפרשת חלב, נוקשות במפרקים וכאבי שרירים הנגרמים על ידי חום לח4. Chuanmutong תמיד הושג מזני בר, המופצים בעיקר בדרום מערב סין, במיוחד בסצ'ואן, שם ניתן למצוא את האיכות הטובה ביותר 5,6. קשה להבחין בין זנים אותנטיים לבין ניאוף קרוב שלהם בשל המאפיינים הדומים שלהם 7,8,9,10. תקן האיכות של Chuanmutong במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית קובע רק את המאפיינים, הזיהוי המיקרוסקופי וזיהוי השכבה הדקה ללא קביעת תוכן, שאינם יכולים לזהות ביעילות ניאוף, ולכן יש סיכונים פוטנציאליים. יתר על כן, ישנם דיווחים מעטים המשווים ומזהים צ'ואנמוטונג וצמחים קשורים. כתוצאה מכך, שיטת בקרת איכות כדי להבטיח את האותנטיות של Chuanmutong ראוי למחקר נוסף.

המרכיבים הכימיים של צ'ואנמוטונג מורכבים בעיקר מטריטרפנואידים פנטציקליים מסוג אולנאן והגליקוזידים, הפלבנואידים והחומצות האורגניותשלהם 11,12,13,14. ביניהם, חומצה אולאנולית, β-סיטוסטרול, סטיגמסטרול וארגוסטרול יש השפעות משתנות בעוצמות שונות, אשר עשוי להיות חומרים פרמקודינמיים פוטנציאליים לקידום diuresis והקלה על חנק15,16. טביעות אצבע כימיות מתקבלות על ידי הפרדה וגילוי של רכיבים כימיים רבים הכלולים בדגימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), כרומטוגרפיית גז (GC) וכו '. אימוץ שיטות ניתוח סטטיסטיות מתאימות לניתוח המאפיינים של Chuanmutong יכול לקבוע את בקרת האיכות הכוללת ואת הזיהוי המדעי של הרפואה הסינית המסורתית17,18,19.

במחקר זה נאספו 10 אצוות של זנים אותנטיים של צ'ואנמוטונג וחמש אצוות של ניאוף. איכותם הושוותה ונותחה על ידי שיטת טביעת האצבע HPLC בשילוב עם זיהוי רב-תבניות, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), ניתוח אפליה אורתוגונלית חלקית של ריבועים לפחות (OPLS-CA), וקביעת תוכן של הרכיב הפרמקודינמי. פרוטוקול זה קובע שיטה לזיהוי זנים אותנטיים עם ספציפיות גבוהה, אסטרטגיה חדשה לזיהוי מדעי של זנים אותנטיים וניאוף של חומרי מרפא סיניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיטות לזיהוי טביעות אצבע כימיות

  1. תנאים כרומטוגרפיים
    1. מכינים את השלב הנייד אצטוניטריל (A)/מים (B). הגדר תוכנית הדרגתית באופן הבא בתוכנת HPLC: 0-20 דקות, 3% A-10%A; 20-25 דקות, 10% A-13%A; 25-65 דקות, 13% A-25%A; 65-75 דקות, 25% A-40%A; 75-76 דקות, 40% A-3%A; 76-85 דקות, 3% A-3%A.
    2. שמור על קצב הזרימה של השלב הנייד ב-1.0 מ"ל/דקה.
    3. בצע את ההפרדה הכרומטוגרפית על עמוד C18 (250 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) הנשמרת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. הגדר את נפח ההזרקה ל -10 μL.
    5. זהה את הדגימות באורך גל של 205 ננומטר.
      הערה: עבור ההגדרות הספציפיות של תנאים כרומטוגרפיים, עיין בנהלי ההפעלה של תוכנת העבודה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (טבלת חומרים).
  2. הכנת הפתרון לדוגמה
    1. טוחנים את חומרי הגלם לגודל חלקיקים אחיד על ידי העברתם דרך רשת ניילון בקוטר פנימי של 850 מיקרומטר ± 29 מיקרומטר.
    2. מניחים 2 גרם של חומר גלם הקרקע (שוקל במדויק) בתוך בקבוק חרוטי 50 מ"ל עם פקק ולהוסיף 50 מ"ל של מתנול. מניחים את הפקק על הבקבוקון ואולטרה סאונד (600 W, 40 קילוהרץ) למשך 30 דקות.
    3. לאחר מכן, מצננים את הבקבוקון לטמפרטורת החדר (RT). שקלו שוב את הדגימות, ופצו על המשקל ההתחלתי על ידי החלפת חומר המיצוי שאבד.
    4. יוצקים 4 מ"ל מתמיסת המתנול המכילה את התמציות הרפואיות לתוך בקבוק נפחי של 10 מ"ל. מוסיפים 6 מ"ל של H2O, מערבבים, ומניחים לו להסתפק במשך 10 דקות.
    5. לבסוף, סננו את הסופר-נטנט דרך קרום מסנן של 0.45 מיקרומטר והניחו אותו במצב המתנה.
  3. אימות שיטות זיהוי טביעות אצבע
    1. הכן את הדגימה כמתואר לעיל (שלב 1.2) והכפיף אותה לניתוח HPLC (שלב 1.1) שש פעמים ביום. כדי להעריך את הדיוק, חשב את סטיית התקן היחסית (RSD) של זמן השמירה היחסי ואזורי השיא היחסיים כמתואר בשלב 1.3.5.
    2. הערך את היציבות של פתרון המדגם על-ידי ניתוח אותו פתרון מדגם המאוחסן ב- RT עבור 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו- 24 שעות, וחשב את ה- RSD של זמן שמירה יחסי ואזורי שיא יחסיים כמתואר בשלב 1.3.5.
    3. קח שישה שכפולים של אותה דגימה (CMT-4), הכן את פתרון הדגימה בהתאם להליך לעיל (שלב 1.2), וזהה את טביעת האצבע שלו ב- HPLC לאחר שלב 1.1. חשב את ה- RSD של זמן השמירה היחסי ואזורי השיא היחסיים, והערך את יכולת החזרה שלו כמתואר בשלב 1.3.5.
    4. לאחר מכן השתמש בשיא מספר 10 באיור 1B כשיא הייחוס וחשב את ה- RSD של זמן השמירה היחסי ושטח השיא היחסי של כל שיא משותף כמתואר בשלב 1.3.5.
    5. השתמש בנוסחאות המוזכרות להלן כדי לחשב את זמן השמירה היחסי ואת שטח השיא היחסי של כל שיא משותף:
      T re = מאפיין T/Tהפניה
      A re = הפניהאופיינית/A
      כאשר T re = זמן שמירה יחסי, מאפיין T = זמן שמירת שיא אופייני, הפניה T = זמן שימור שיא ייחוס, Are = אזור שיא יחסי, מאפיין = אזור שיא אופייני, ו- A הפניה = אזור שיא ייחוס.
      הערה: הקמת טביעות אצבע של רפואה סינית מסורתית דורשת בדרך כלל בחירת שיא כרומטוגרפי קל להשגה ובעל רזולוציה גבוהה. זה משמש כשיא ייחוס לזיהוי טביעות האצבעות ולבחינת יציבותן ושכפולן.

2. הקמת טביעת אצבע צ'ואנמוטונג וניתוח דמיון

  1. השתמש ב-10 אצוות של דגימות אותנטיות ו-5 אצוות של ניאוף כגון Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), קלמטיס פטרה יד.-מאז. (DE), קלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils (XS), ו Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) כדגימות לניתוח טביעות אצבע.
  2. הכן את הפתרונות לדוגמה כמתואר בשלב 1.2. בצע ניתוח טביעות אצבע של כל פתרונות הדגימה על ידי HPLC בהתאם לתנאים המתוארים בשלב 1.1.
  3. ייבא את הנתונים הרלוונטיים למערכת הערכת הדמיון של טביעות אצבע כרומטוגרפיות של הרפואה הסינית המסורתית (SESCF-TCM, גרסת 2012). המערכת תגדיר את הפסגות עם גובה סביר ורזולוציה טובה בכרומטוגרמות של כל הדגימות כפסגות נפוצות.
    הערה: ניתן להוריד את תוכנת SESCF-TCM לאחר הרישום באתר האינטרנט של ועדת הפרמקופיאה הסינית (http://114.247.108.158:8888/login).
    1. בתוכנה, לחץ על הגדר ספקטרום הפניה כפתור בתפריט.
    2. לאחר מכן, בחלון הגדרות פרמטרים, הגדר את רוחב חלון הזמן ל- 0.5 ובחר שיטת יצירת ספקטרום בקרה כשיטה החציונית.
    3. לחץ על כיול מרובה נקודות בתפריט הראשי, ולאחר מכן בחר התאמת שיא כהתאמת שיא ספקטרום מלאה.
    4. לבסוף, לחץ על צור שליטה כדי ליצור את טביעת האצבע הכרומטוגרפית של המין האותנטי של Chuanmutong.
  4. יבא את זמן השמירה ואזור השיא של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש אצוות של ניאוף לתוך SESCF-TCM לניתוח. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
    1. בתוכנה, לחץ על הגדר ספקטרום הפניה כפתור בתפריט הראשי.
    2. בחלון הגדרות פרמטרים , הגדר את טביעת האצבע הכרומטוגרפית של הייחוס של המין האותנטי של Chuanmutong כהפניה, בחר בשיטת יצירת ספקטרום הבקרה כשיטה החציונית והגדר את רוחב חלון הזמן ל- 0.5.
    3. לחץ על כיול מרובה נקודות בתפריט הראשי, ולאחר מכן בחר התאמת שיא כהתאמת שיא ספקטרום מלאה.
    4. לבסוף, לחץ על חשב דמיון כדי לחשב את הדמיון בהתבסס על טביעות האצבעות הכרומטוגרמיות של צ'ואנמוטונג. לבסוף, חשב את הדמיון בין טביעות אצבע באמצעות מערכת הערכת טביעות האצבע הכרומטוגרפית של הרפואה הסינית (גרסת 2012).
      הערה: עבור הפעולות הספציפיות, עיין במפרטי ההפעלה של מערכת הערכת טביעות האצבע הכרומטוגרפית של הרפואה הסינית (גרסת 2012).

3. ניתוח זיהוי תבניות מרובות של טביעת אצבע של צ'ואנמוטונג

  1. ניתוח אשכולות (CA)
    1. השתמש באזורי השיא של 12 פסגות נפוצות בטביעות האצבע של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש אצוות הניאוף שלהן כמשתנים, והזן אותן לתוכנת ניתוח סטטיסטית לניתוח אשכולות שיטתי (CA).
    2. בחר בשיטה ' בין קבוצות ' והשתמש במקדם המתאם של פירסון כבסיס הסיווג כדי לצייר דיאגרמת ניתוח אשכולות של צ'ואנמוטונג והניאוף שלה. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת הניתוח הסטטיסטי, לחץ על קובץ כדי לייבא נתונים.
      2. לחץ על ניתוח בתפריט ולאחר מכן לחץ על אשכולות מערכת בסיווג.
      3. בחר את אזור השיא המשותף כמשתנה, והגדר את מספר האשכולות לארבעה.
      4. לחץ על שיטה, בחר את שיטת האשכולות כחיבור בין קבוצות, בחר את מרווח המדידה כמתאם פירסון ולחץ על אישור כדי לצייר את מפת CA.
  2. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)
    1. ייבא את אזור השיא המשותף יחסית של הזנים האותנטיים והניאוף שלהם לתוכנת הניתוח לניתוח PCA, והשתמש במפת ציוני PCA כדי להעריך את מפת מטריצת הניקוד של הבדלי הדגימה. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים, לחץ על קובץ בתפריט וצור פרויקט רגיל חדש. יבא את אזור השיא של 12 פסגות נפוצות בגיליון אלקטרוני (לדוגמה, תבנית Excel) ממערכת HPLC. לאחר מכן לחץ על סיום כדי להשלים את ייבוא הנתונים.
      2. לחץ על חדש כדי ליצור דגם חדש כדי להגדיר את סוג הדגם עם PCA. לחץ על התאמה אוטומטית והוסף כדי להתאים לנתונים, ולאחר מכן לחץ על ניקוד כדי לקבל את מפת ציוני PCA.
  3. ניתוח אפליה אורתוגונלית חלקית בריבועים הפחותים (OPLS-DA)
    1. השתמש בשיטת ניתוח ההבחנה החלקית הפחותה-ריבועית האורתוגונלית עם מצב פיקוח כדי לנתח עוד יותר את פסגות אזור השיא המשותף יחסית של זני צ'ואנמוטונג האותנטיים וחומרי הניאוף ולצייר מפת ציוני סיווג OPLS-DA של כל הדגימות. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת ניתוח נתונים, לחץ על קובץ בתפריט כדי לייבא קובץ וליצור פרויקט רגיל חדש. יבא את אזור השיא של 12 פסגות נפוצות בגיליון אלקטרוני ממערכת HPLC, ולאחר מכן לחץ על סיום כדי להשלים את ייבוא הנתונים.
      2. לחץ על חדש כדי ליצור דגם חדש כדי להגדיר את סוג הדגם עם PCA. לחץ על התאמה אוטומטית והוסף כדי להתאים לנתונים. לאחר מכן לחץ על ציונים כדי לקבל את מפת הציונים של PCA.
      3. לחץ על חדש ובחר חדש כמודל 1 כדי להגדיר את סוג הדגם עם OPLS-DA.
      4. לחץ על קנה מידה והגדר סוג עם Par for All. לחץ תחילה על התאמה אוטומטית ולאחר מכן לחץ על ניקוד כדי לקבל את מפת הניקוד OPLS-DA.
    2. על מנת לקבוע את ההשפעה של כל פסגה משותפת בצ'ואנמוטונג על תוצאות הסיווג שלה ואת ההבדל בין חומרי צ'ואנמוטונג אותנטיים לבין ניאוף קשור, השתמש בחשיבות המשתנה בהקרנה (VIP) לניתוח.
    3. צייר את מפת ה- VIP של המרכיבים השונים של צ'ואנמוטונג. השתמש במפת ה- VIP המתקבלת כדי להעריך את ההשפעה של כל משתנה על הסיווג ולסנן רכיבים התורמים באופן משמעותי להבדלים בין הקבוצות. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת ניתוח הנתונים, לחץ על נתח בתפריט ולחץ על תמורות, הגדר את מספר התמורות ל -200, וקבל את R 2 ו- Q 2 של מפת הניקוד OPLS-DA.
      2. לחץ על VIP ובחר VIP חיזוי כדי לקבל את מפת ה- VIP.

4. קביעת β-סיטוסטרול בצ'ואנמוטונג על ידי HPLC

  1. תנאים כרומטוגרפיים (עיין בשלב 1.1)
    1. הכינו את השלב הנייד: מתנול-מים (97:3).
    2. הגדר את קצב הזרימה של השלב הנייד ל-1.0 מ"ל/דקה.
    3. בצע את ההפרדה הכרומטוגרפית על עמוד C18 (250 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) הנשמרת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. הגדר את נפח ההזרקה ל -10 μL.
    5. זהה את הרכיב באורך גל של 204 ננומטר.
  2. הכנת הפתרון לדוגמה
    1. הכינו את התמיסה הסטנדרטית של β-סיטוסטרול (0.1 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת כמות שנשקלה במדויק של תקן הייחוס המתאים במתנול.
    2. טוחנים את דגימת הניתוח של חומר הגלם לגודל חלקיקים אחיד על ידי העברת הדגימה דרך רשת הניילון בקוטר פנימי של 180 מיקרומטר ± 7.6 מיקרומטר.
    3. מניחים 2 גרם של חומר גלם הקרקע (במשקל מדויק) בתוך בקבוק עם תחתית עגולה ולהוסיף 50 מ"ל של כלורופורם אליו.
    4. חברו את הבקבוקון למעבה ריפלוקס וחממו אותו באמבט מים רותחים (הרתחה מתונה) למשך 60 דקות. סנן את תמיסת החילוץ באמצעות נייר סינון של 15-20 מיקרומטר.
    5. מאדים את התסנין עד כמעט יובש באמבט מים רותחים (הרתחה מתונה) למשך כ-10 דקות.
    6. ממיסים את השאריות ומרכיבים את עוצמת הקול ל-5 מ"ל באמצעות מתנול. לבסוף, להעביר את supernatant דרך קרום מסנן 0.45 מיקרומטר, והניח אותו על המתנה.
  3. אימות שיטה
    1. קח את תמיסת המלאי של β-סיטוסטרול שהוכנה בתת-שלב 4.2.1, דילל אותו עם 100% מתנול, והכן פתרונות עם 100 מיקרוגרם / מ"ל, 80 מיקרוגרם / מ"ל, 60 מיקרוגרם / מ"ל, 50 מיקרוגרם / מ"ל, 40 מיקרוגרם / מ"ל, 30 מיקרוגרם / מ"ל, ו 20 מיקרוגרם / מ"ל ריכוזים.
    2. להזריק את הדגימות בתנאים הכרומטוגרפיים המתוארים בשלב 4.1 כדי לקבוע את אזור השיא, לבצע ניתוח רגרסיה עם אזור השיא לנפח ההזרקה, ולקבל את משוואת הרגרסיה ואת מקדם המתאם כדי להעריך את הלינאריות שלה.
    3. הכן את הדגימות כמתואר לעיל (שלב 4.2) והכפיף אותן לניתוח HPLC (שלב 4.1) שש פעמים באותו יום. לאחר מכן חשב את ה- RSD של אזורי השיא כדי להעריך את הדיוק.
    4. הערך את היציבות של פתרון המדגם על-ידי ניתוח אותם פתרונות לדוגמה המאוחסנים ב- RT עבור 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו- 24 שעות, כמתואר בשלב 4.1. לאחר מכן חשב את ה- RSD של אזורי שיא כמתואר בשלב 1.3.5.
    5. בחן את יכולת החזרה על-ידי המסת אותה דגימה (CMT-4) ב-sextuplicate, שהוכנה כמתואר בשלב 4.2, והכפפתם לניתוח HPLC כמתואר בשלב 4.1. לאחר מכן חשב את ה- RSD של תוכן β-סיטוסטרול בשש דגימות.
    6. הערך את דיוק השיטה על ידי שימוש בשיטת התוספת הסטנדרטית. לשם כך, הוסף תמיסות ייחוס β-סיטוסטרול לדגימות ב- 80%, 100% ו- 120% מתכולת β-סיטוסטרול וחזור על כל מצב שלוש פעמים כמתואר בשלב 4.1. הערך את דיוק השיטה על-ידי חישוב ההתאוששות הממוצעת וה-RSD.
      הערה: נוסחת החישוב של קצב ההתאוששות (RR) היא כדלקמן:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      כאשר M t = איכות β-סיטוסטרול לאחר הוספת התקן, M 0 = איכות תמיסת הדגימה, ו- Ms = איכות β-סיטוסטרול נוסף.
  4. קביעת תכולת β-סיטוסטרול של דוגמאות
    1. קח 10 אצוות של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחמש אצוות של ניאוף קשור כדי להכין פתרונות לדוגמה על פי שלב 4.2.
    2. לאחר מכן להזריק כל תמיסת דגימה ותמיסת ייחוס β-סיטוסטרול כדי לקבוע את אזור השיא בתנאים המתוארים בשלב 4.1, ולחשב את תכולת β-סיטוסטרול של כל דגימה באמצעות השיטה הסטנדרטית החיצונית של נקודה אחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טביעת אצבע כרומטוגרפית של צ'ואנמוטונג וניתוח דמיון (SA)
ערכי ה-RSD של זמן השמירה היחסי של דיוק, חזרתיות ויציבות היו מתחת ל-0.46%, 1.65% ו-0.53%, בהתאמה; ערכי ה-RSD של אזור השיא היחסי היו נמוכים מ-4.23%, 3.56% ו-3.96%, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיורים 1A,B, היו 12 פסגות משותפות שונות (משיא 1 עד שיא 12) בטביעות האצבע של HPLC ב-10 דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות. מכיוון ששטח השיא של מס '10 היה גדול יחסית, הרזולוציה הייתה טובה; מכיוון שהוא היה רכיב נוכח בכל דגימה,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

איסוף הדגימות למחקר הוא צעד המפתח הראשון לבניית זיהוי רב-תבניות בזיהוי האותנטיות של חומרי מרפא סיניים. באמצעות מחקר שוק, מצאנו כי סצ'ואן יאן, ליאנגשאן ולשאן הם אזורי הייצור העיקריים של משאבי הבר של צ'ואנמוטונג. גם לזנים הקשורים של אותו סוג יש אותה תפוצה גיאוגרפית 6,20; CC, DC, DE, XS ו- SMT משמשים לעתים קרובות לרעה כצ'ואנגמוטונג 16,21; לכן, במחקר זה, 10 אצוות של Chuanmutong אותנטי וחמש קבוצות של דגימות מע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מינהל הרפואה הסינית המסורתית של סצ'ואן (מס' 2020JC0088, מס' 2021MS203).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., טיאנג'ין, סין2017381038
AcetonitrileSigma-Aldrich  מסחר ושות', בע"מ, שנחאי, סיןWXBD5243V
ובטא;-SitosterolMeisai ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מ, צ'ונגצ'ינג, סין20210201
  C18 עמודYuexu חומר טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סיןWelch האולטימטיבי LP
ChuanmutongGuoqiang חתיכות צמחים סיניות ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין 19020103CMT-1
ChuanmutongHongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין 200701CMT-2
ChuanmutongHongpu פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין 200701CMT-3
ChuanmutongHongpu פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין 200901CMT-4
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין 210701CMT-5
ChuanmutongHaobo פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין 210401CMT-6
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין 200901CMT-7
ChuanmutongWusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., סצ'ואן, סין 201201CMT-8
ChuanmutongLimin חתיכות צמחים סיניות ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין 201001CMT-9
ChuanmutongYuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין210501CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) גשר W. T. WangMadzi, Sanlang Township, מחוז Tianquan, סצ'ואן, סין -CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.הכפר היילין, העיירה צ'יליפינג, מחוז הונגיה, סצ'ואן, סין -DC
זלזלת פטרה יד.-מאז.כפר הואנגמו, העיירה הואנגמו, מחוז הניואן, סצ'ואן, סין -DE
זלזלת gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et WilsMixedang הר, העיירה הואנגוואן, מחוז אמיי, סצ'ואן, סין -XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot.כפר ווניאן, העיירה הואנגוואן, מחוז אמיי, סצ'ואן, סין -SMT
איזון אלקטרוניHaozhuang Hengping מכשיר מדעי ושות', בע"מ, שנחאי,   סין FA1204
ErgosterolMeisai Biological Technology Co., Ltd, צ'ונגצ'ינג, סין20210201
אתנולKelon Chemical Co., Ltd., צ'נגדו, סין2021112602
אתיל אצטטZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., טיאנג'ין, סין2017042043
חומצה פורמיתKelon Chemical Co., Ltd., צ'נגדו, סין2016062901
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהיםAgilent, ארה"ב.1260
IBM SPSS סטטיסטיקה גרסה 26.0International Business Machines Corporation, ארה"ב-מתנול
סיגמא-אולדריץ'  מסחר ושות', בע"מ, שנחאי, סיןWXBD6409V
מתנולקלון כימית ושות', בע"מ, צ'נגדו, סין202010302
n-בוטיל אלכוהולZhiyuan Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין2020071047
אתר נפטZhiyuan Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין2020090125
חומצה זרחתיתComeo Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין20200110
SESCF-TCM גרסה 2012ועדת הפרמקופיאה הלאומית, סין-http://114.247.108.158:8888/login
StigmasterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., צ'ונגצ'ינג, סין20210201
TrichloromethaneSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., שנחאי, סין20200214
Umetrics גרסת SIMCA 14.1.0.2047Umetrics, שוודיה-https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
מכונת מים טהוריםYoupu Ultrapure Technology Co., Ltd., סצ'ואן, סיןUPH-II-10T
מנקה אולטרסאונדKunshan Hechuang מכשיר אולטרסאונד ושות', בע"מ, ג'יאנגסו, סיןKH3200E

מקורות

  1. Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116(1935).
  2. Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
  3. Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
  4. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38(2020).
  5. Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696(2007).
  6. Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
  7. Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
  8. Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
  9. Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
  10. Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
  11. Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
  12. Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
  13. Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
  14. Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245(2021).
  15. Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
  16. Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
  17. Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
  18. Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
  19. Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281(2021).
  20. Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
  21. Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
  22. Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
  23. Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
  24. Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
  25. Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
  26. Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HPLCChuanmutongOPLS DABeta Sitosterol
HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.