כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בשילוב עם זיהוי רב-תבניות של טביעות אצבע כימיות, המספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של הזנים האמיתיים של Clematidis Armandii Caulis וחומרי הניאוף שלו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה לזיהוי חומרי מרפא סיניים וחומרי הניאוף הקשורים אליהם נבנתה על ידי לקיחת Clematidis Armandii Caulis (צ'ואנמוטונג, רפואה סינית מסורתית בשימוש אוניברסלי) כדוגמה. עשר אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים וחמש אצוות של ניאוף קשורים נותחו והושוו בהתבסס על טביעות האצבע של הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC) בשילוב עם כימומטריה, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח אפליה אורתוגונלית של ריבועים מינימליים (OPLS-DA). בנוסף, התוכן של β-sitosterol נקבע. טביעת האצבע הכימית של צ'ואנמוטונג הוקמה, וזוהו 12 פסגות נפוצות. הדמיון בין טביעת האצבע של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים לבין טביעת האצבע של הבקרה היה 0.910-0.989, בעוד שהדמיון בין חמש אצוות של ניאוף היה רק 0.133-0.720. בהתבסס על הפסגות הנפוצות בכרומטוגרמה, 15 אצוות של דגימות סווגו לשלוש רמות תוכן על ידי PCA, ונצברו לארבע קטגוריות על ידי CA, והשיגו הבחנה ברורה בין צ'ואנמוטונג אותנטי לבין ניאוף של צ'ואנמוטונג. יתר על כן, שבעה מרכיבים דיפרנציאליים שיכולים לזהות ביעילות צ'ואנמוטונג אותנטי וחומרי ניאוף של צ'ואנמוטונג נמצאו באמצעות OPLS-DA. תכולת β-סיטוסטרול של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים הייתה 97.53-161.56 מיקרוגרם/גרם, בעוד שתכולת β-סיטוסטרול של חמש קבוצות הניאוף הייתה שונה מאוד, ביניהן תכולת β-סיטוסטרול של Clematis peterae Hand.-Mazz. וקלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils. היה נמוך משמעותית מזה של זנים אותנטיים של Chuanmutong. תכולת רכיבי אינדקס HPLC ושיטת זיהוי טביעות אצבע כימיות מרובות תבניות שנקבעו במחקר זה מספקות אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחומרי ניאוף קשורים.
מבוא
צ'ואנמוטונג, קאולי יבש של קלמטיס ארמנדי פראנץ'. או Clematis מונטנה Buch.-Ham., היא רפואה סינית מסורתית המשמשת בדרך כלל במרפאות 1,2,3. הוא משמש לטיפול בבעיות במתן שתן, בצקת, פצעים על הלשון והפה, ירידה בהפרשת חלב, נוקשות במפרקים וכאבי שרירים הנגרמים על ידי חום לח4. Chuanmutong תמיד הושג מזני בר, המופצים בעיקר בדרום מערב סין, במיוחד בסצ'ואן, שם ניתן למצוא את האיכות הטובה ביותר 5,6. קשה להבחין בין זנים אותנטיים לבין ניאוף קרוב שלהם בשל המאפיינים הדומים שלהם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שיטות לזיהוי טביעות אצבע כימיות
- תנאים כרומטוגרפיים
- מכינים את השלב הנייד אצטוניטריל (A)/מים (B). הגדר תוכנית הדרגתית באופן הבא בתוכנת HPLC: 0-20 דקות, 3% A-10%A; 20-25 דקות, 10% A-13%A; 25-65 דקות, 13% A-25%A; 65-75 דקות, 25% A-40%A; 75-76 דקות, 40% A-3%A; 76-85 דקות, 3% A-3%A.
- שמור על קצב הזרימה של השלב הנייד ב-1.0 מ"ל/דקה.
- בצע את ההפרדה הכרומטוגרפית על עמוד C18 (250 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) הנשמרת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
- הגדר את נפח ההזרקה ל -10 μL.
- זהה את הדגימות באורך גל של 205 ננומטר.
הערה: עבור ההגדרות הספציפיות של תנאים כרומטוגרפיים, עיין בנהלי ההפעלה של תוכנת העבודה של כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טביעת אצבע כרומטוגרפית של צ'ואנמוטונג וניתוח דמיון (SA)
ערכי ה-RSD של זמן השמירה היחסי של דיוק, חזרתיות ויציבות היו מתחת ל-0.46%, 1.65% ו-0.53%, בהתאמה; ערכי ה-RSD של אזור השיא היחסי היו נמוכים מ-4.23%, 3.56% ו-3.96%, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיורים 1A,B, היו 12 פסגות משותפות שונות (משיא 1 עד שיא 12) בטביעות האצבע של HPLC ב-10 דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות. מכיוון ששטח השיא של מס '10 היה גדול יחסית, הרזולוציה הייתה טובה; מכיוון שהוא היה רכיב נוכח בכל דגימה,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
איסוף הדגימות למחקר הוא צעד המפתח הראשון לבניית זיהוי רב-תבניות בזיהוי האותנטיות של חומרי מרפא סיניים. באמצעות מחקר שוק, מצאנו כי סצ'ואן יאן, ליאנגשאן ולשאן הם אזורי הייצור העיקריים של משאבי הבר של צ'ואנמוטונג. גם לזנים הקשורים של אותו סוג יש אותה תפוצה גיאוגרפית 6,20; CC, DC, DE, XS ו- SMT משמשים לעתים קרובות לרעה כצ'ואנגמוטונג 16,21; לכן, במחקר זה, 10 אצוות של Chuanmutong אותנטי וחמש קבוצות של דגימות מע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מינהל הרפואה הסינית המסורתית של סצ'ואן (מס' 2020JC0088, מס' 2021MS203).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצה אצטית | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., טיאנג'ין, סין | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich מסחר ושות', בע"מ, שנחאי, סין | WXBD5243V | |
| ובטא;-Sitosterol | Meisai ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מ, צ'ונגצ'ינג, סין | 20210201 | |
| C18 עמוד | Yuexu חומר טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין | Welch האולטימטיבי LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang חתיכות צמחים סיניות ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo פרמצבטיקה ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., סצ'ואן, סין | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin חתיכות צמחים סיניות ושות', בע"מ, סצ'ואן, סין | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., סצ'ואן, סין | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) גשר W. T. Wang | Madzi, Sanlang Township, מחוז Tianquan, סצ'ואן, סין | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | הכפר היילין, העיירה צ'יליפינג, מחוז הונגיה, סצ'ואן, סין | - | DC |
| זלזלת פטרה יד.-מאז. | כפר הואנגמו, העיירה הואנגמו, מחוז הניואן, סצ'ואן, סין | - | DE |
| זלזלת gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang הר, העיירה הואנגוואן, מחוז אמיי, סצ'ואן, סין | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | כפר ווניאן, העיירה הואנגוואן, מחוז אמיי, סצ'ואן, סין | - | SMT |
| איזון אלקטרוני | Haozhuang Hengping מכשיר מדעי ושות', בע"מ, שנחאי, סין | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, צ'ונגצ'ינג, סין | 20210201 | |
| אתנול | Kelon Chemical Co., Ltd., צ'נגדו, סין | 2021112602 | |
| אתיל אצטט | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., טיאנג'ין, סין | 2017042043 | |
| חומצה פורמית | Kelon Chemical Co., Ltd., צ'נגדו, סין | 2016062901 | |
| כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים | Agilent, ארה"ב. | 1260 | |
| IBM SPSS סטטיסטיקה גרסה 26.0 | International Business Machines Corporation, ארה" | ב-מתנול | |
| סיגמא-אולדריץ' מסחר ושות', בע"מ, שנחאי, סין | WXBD6409V | ||
| מתנול | קלון כימית ושות', בע"מ, צ'נגדו, סין | 202010302 | |
| n-בוטיל אלכוהול | Zhiyuan Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין | 2020071047 | |
| אתר נפט | Zhiyuan Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין | 2020090125 | |
| חומצה זרחתית | Comeo Chemical Reagent ושות', בע"מ, טיאנג'ין, סין | 20200110 | |
| SESCF-TCM גרסה 2012 | ועדת הפרמקופיאה הלאומית, סין-http://114.247.108.158:8888/login | ||
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., צ'ונגצ'ינג, סין | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., שנחאי, סין | 20200214 | |
| Umetrics גרסת SIMCA 14.1.0.2047 | Umetrics, שוודיה-https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download | ||
| מכונת מים טהורים | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., סצ'ואן, סין | UPH-II-10T | |
| מנקה אולטרסאונד | Kunshan Hechuang מכשיר אולטרסאונד ושות', בע"מ, ג'יאנגסו, סין | KH3200E |
מקורות
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116(1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
