Method Article

ניתוח דגימות Rhizoma Cyperi גולמיות ומעובדות באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, ניתוח השוואתי של דגימות ריזומה גולמית ומעובדת של Cyperi rhizoma (CR) מוצג באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד - ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (UPLC-MS/MS) בחולדות עם דיסמנוריאה ראשונית. השינויים ברמות המטבוליטים בדם ומרכיבי הדגימה נבדקו בין חולדות שטופלו ב-CR ו-CR שעובדו בחומץ (CRV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyperi rhizoma (CR) נמצא בשימוש נרחב בגינקולוגיה והוא רפואה כללית לטיפול במחלות נשים בסין. מאז ההשפעה משכך כאבים של CR משופר לאחר עיבוד עם חומץ, CR מעובד עם חומץ (CRV) משמש בדרך כלל מבחינה קלינית. עם זאת, המנגנון שבו אפקט משכך כאבים משופר על ידי עיבוד חומץ אינו ברור. במחקר זה, טכניקת ספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה במיוחד (UPLC-MS/MS) שימשה לבחינת שינויים ברמות הדם של המרכיבים האקסוגניים והמטבוליטים בין חולדות שטופלו ב-CRV לבין חולדות שטופלו ב-CRV עם דיסמנוריאה. התוצאות חשפו רמות שונות של 15 מרכיבים ושני מטבוליטים בדמן של חולדות אלה. ביניהם, הרמות של (-)-myrtenol ו-[(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl] חומצה אצטית בקבוצת CRV היו גבוהות במידה ניכרת מאשר בקבוצת CR. CRV הפחית את הרמה של פרוסטנואידים מסדרה 2 ולויקוטריאנים מסדרה 4 עם פעילויות פרו-דלקתיות, צבירת טסיות דם והתכווצות כלי דם וסיפק השפעות משככות כאבים על ידי ויסות מטבוליזם של חומצה ארכידונית וחומצה לינולאית וביוסינתזה של חומצות שומן בלתי רוויות. מחקר זה גילה כי עיבוד חומץ משפר את אפקט משכך הכאבים של CR ותורם להבנתנו את מנגנון הפעולה של CRV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיסמנוריאה ראשונית (PD) היא המצב השכיח ביותר בגינקולוגיה קלינית. הוא מאופיין בכאבי גב, נפיחות, כאבי בטן או אי נוחות לפני או במהלך הווסת ללא פתולוגיה של האגן במערכת הרבייה1. דו"ח על שכיחותה הראה כי 85.7% מהתלמידים סובלים מפרקינסון2. גלולות למניעת הריון במינון נמוך הן הטיפול הסטנדרטי, אך תופעות הלוואי השליליות שלהן, כגון פקקת ורידים עמוקים, משכו תשומת לב גוברת3. השכיחות של פקקת ורידים עמוקים בקרב משתמשים בגלולות למניעת הריון היא >1 ל-1,000 נשים, והסיכון הוא הגבוה ביותר במהלך 6-12 החודשים הראשונים ובמשתמשות מעל גיל 404.

בשימוש ארוך ברפואה הסינית המסורתית (TCM), קנה שורש Cyperi (CR) נגזר מקנה השורש המיובש של Cyperus rotundus L. ממשפחת Cyperaceae. CR מסדיר הפרעות מחזור ומקל על דיכאון וכאב5. CR נמצא בשימוש נרחב בגינקולוגיה ונחשב לרפואה כללית לטיפול במחלות נשים6. CR מעובד עם חומץ (CRV) משמש בדרך כלל מבחינה קלינית. בהשוואה ל- CR, CRV מראה ויסות משופר של הווסת והקלה על כאבים. מחקרים מודרניים הראו כי CR מעכב cyclooxygenase-2 (COX-2) ואת הסינתזה הבאה של prostaglandins (PGs), ובכך להשיג השפעה אנטי דלקתית. בינתיים, CR מציג אפקט משכך כאבים ללא תופעות לוואי7, מה שהופך את CR לבחירה טובה עבור חולי דיסמנוריאה. עם זאת, המנגנון העומד בבסיס ויסות הווסת ומתן הקלה בכאב על ידי CRV אינו ברור. מחקר CR התמקד בעיקר בשינויים ברכיבים הכימיים הפעילים שלו ובפעילויות הפרמקולוגיות שלו, כגון ההשפעות האנטי דלקתיות, נוגדות הדיכאון ומשככי הכאביםשלו 8,9,10,11,12.

למרות המרכיבים של TCM הם מורכבים, הם נספגים לתוך הדם חייב להגיע ריכוז דם מסוים כדי להיות יעיל13. ניתן לצמצם את היקף בדיקת החומרים הפעילים של TCM על ידי שימוש באסטרטגיה של קביעת המרכיבים בדם. ניתן להימנע מעיוורון בחקר המרכיבים הכימיים במבחנה, ומחד-צדדיות בחקר המרכיבים הבודדים14. על ידי השוואת הרכבים של CR ו- CRV בדם, ניתן לזהות שינויים בחומרים הפעילים של CR המעובד ביעילות ובמהירות. יעילות התרופה היא התהליך שבו תרופה משפיעה על הגוף. שינויים במרכיבי התרופה עקב התגובה המטבולית של הגוף, אשר עשויים להיות קשורים למנגנון הפעולה של התרופה, ניתן לקבוע עם metabonomics. Metabonomics שואפת למדוד את התגובות המטבוליות הכוללות והדינמיות, אשר עולה בקנה אחד עם קביעת היעילות הכוללת של הרפואה הסינית המסורתית15. יתר על כן, מטבוליטים הם התוצר הסופי של ביטוי גנים, אשר קרוב ביותר לפנוטיפים16. לפיכך, מטבונומיה עשויה להתאים לחקר ההבדלים במסלולים המטבוליים בין CR ו- CRV בטיפול בפרקינסון. כרומטוגרפיה נוזלית - ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה (LC-MS/MS) - מבוססת מטבולומיקה לא ממוקדת מאופיינת בתפוקה גבוהה, רגישות גבוהה ורזולוציה גבוהה וניתן להשתמש בה למדידת רכיבים מולקולריים קטנים רבים ושונים17,18 . שיטה זו יכולה לקבוע בו זמנית את המטבוליטים האנדוגניים והמרכיבים האקסוגניים הנספגים בדם. Metabonomics כבר בשימוש נרחב במחקרים על TCM19, טוקסיקולוגיה סמים20, ניהול בריאות21, ספורט22, מזון23, ותחומים אחרים.

במחקר זה, ההבדלים בין המרכיבים האקסוגניים שנספגו בדם לבין המטבוליטים האנדוגניים נמדדו בין חולדות מודל דיסמנוריאה שטופלו ב-CRV לבין חולדות מודל דיסמנוריאה שטופלו ב-CRV באמצעות מטבולומיקה לא ממוקדת מבוססת LC-MS/MS כדי לחשוף את מנגנוני ההשפעות משככות הכאבים של CRV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים נערכו באישור ועדת האתיקה של הניסויים של מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית. בניסוי זה נעשה שימוש בעשרים וארבע נקבות חולדות מסוג Sprague Dawley (SD) שהיו בנות 8-10 שבועות ושקלו 200 גרם ±-20 גרם.

1. הכנת המיצוי

  1. חישוב
    1. תכננו לתת את תמצית CR או CRV לקבוצת טיפול של שש חולדות Sprague-Dawley (10 גרם / [kg∙day]) במשך 3 ימים. השתמש בריכוז תמצית CR או CRV של 1 גרם/מ"ל (1 מ"ל של תמצית מתקבל מ 1 גרם של עשבי תיבול).
      הערה: המינון של CR הוא 6-10 גרם. במחקר זה, המינון המרבי של 10 גרם שימש כמינון. מכיוון שהמשקל הממוצע של אדם מבוגר הוא 60 ק"ג, המינון למבוגרים הוא 0.1667 גרם / ק"ג. על פי אלגוריתם המרת המשקל24, מכיוון שמקדם המרת המינון בין בני אדם לחולדות הוא 6.3, המינון לחולדות הוא 1.05 גרם לק"ג. מינון התרופה הוגדל פי 10 ל-10.5 גרם לק"ג עבור חולדות. המינון נקבע כ-10 גרם/ק"ג לנוחות החישוב והניסוי עצמו. לדוגמה, על פי החישוב, אם יש צורך בסך הכל 36 גרם של CR או CRV, יש להכין את צמחי המרפא הסיניים לפחות פעמיים. לפיכך, נדרשו 200 גרם CR - 100 גרם CR שימשו כ- CR, ו- 100 גרם CR עובדו ל- CRV.
    2. חשב את נפח CR או CRV שיוחל לכל חולדה באמצעות משוואה (1):
      V = 10 גרם/(kg∙day) × 200 g/(1 g/mL) = 2 מ"ל (1)
  2. עיבוד של CRV
    1. מערבבים היטב 100 גרם CR ו-20 גרם חומץ (>5.5 גרם חומצה אצטית/100 מ"ל) ודגרים במשך 12 שעות.
      הערה: כדי להבטיח שהחלק הפנימי של CR נרטב בחומץ לאחר 12 שעות, ה-CR והחומץ עורבבו, עורבבו היטב ואז ערבבו שוב עד שהחלק הפנימי היה לח.
    2. מקפיצים את התערובת במחבת ברזל במשך 10 דקות בחום של 110-120 מעלות. לאחר מכן, מוציאים את התערובת, ומניחים לה להתקרר בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי למנוע חריכה של CR, יש צורך לערבב ברציפות בזמן החימום. אם ה-CRV המעובד רטוב מדי, ניתן לייבש אותו ב-60°C. כאשר פני השטח של CR הם ספיה, ניתן להפסיק את ההקפצה.
  3. חילוץ
    1. תמצית CR
      1. מוסיפים 10 פעמים (כמות CR) מים טהורים ל-CR, ומשרים למשך שעתיים. יש לוודא כי החומרים הרפואיים נמצאים מתחת לרמה הנוזלית בעת ההשריה.
        הערה: יש לחתוך את ה-CR רק לשניים לפני החילוץ. מטרת ההשריה היא לחלץ את המרכיבים הפעילים בצורה יעילה יותר. תהליך ההשריה הוא חיוני.
      2. מביאים את תערובת המים והתרופות לרתיחה על אש גבוהה, ושומרים אותה רותחת על אש נמוכה למשך 20 דקות. מסננים עם מטלית פילטר (100 רשת), ואוספים את התסנין.
        הערה: בעת מרתח השתמשו בחום גבוה לפני הרתיחה, ובחום נמוך השתמשו כדי לשמור על הרתיחה.
      3. חזור על שלב 1.3.1.2 פעם אחת, ושלב את התסנין.
      4. רכז את התמצית עם מאייד סיבובי ל 1 גרם / מ"ל (מבוסס על התרופה המקורית, טמפרטורת הריכוז חייבת להיות מתחת 60 ° C).
        הערה: הרכיבים הפעילים ב-CR הם נדיפים, ולכן טמפרטורת הריכוז לא צריכה להיות גבוהה מ-60°C.
    2. תמצית CRV
      1. בצע את אותם שלבים (1.3.1.1-1.3.1.3) כמו בשיטת חילוץ CR.
    3. תמצית CR לבדיקה
      1. פיפטה 500 μL של תמצית CR ו 500 μL של מתנול לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, ומערבולת במשך 30 s כדי לערבב.
        הערה: תערובת של מתנול ומים מחלצת טוב יותר את המרכיבים הפעילים. אין לסנן את התמצית ישירות לבדיקה.
      2. צנטריפוגה כל דגימה במשך 15 דקות ב 1,6502 × גרם ב 4 ° C. סנן את supernatant, ולאחר מכן להעביר אותו בקבוקון הדגימה לבדיקה.
        הערה: לאחר הצנטריפוגה המהירה של תערובת מתנול ותמצית, ניתן להעביר את הסופרנאטנט ישירות לבקבוק הדגימה לקביעה ללא סינון. בשל החום שנוצר בתהליך הצנטריפוגה, עדיף להשתמש בצנטריפוגה קריוגנית.
    4. תמצית CRV לבדיקה
      1. בצע את שלבים 1.3.3.1-1.3.3.2 כדי להכין את תמצית CRV לבדיקה.

2. בעלי חיים

  1. חישוב
    1. קח 50 מ"ג של אסטרדיול בנזואט, ולהוסיף אותו 50 מ"ל של שמן זית כדי להכין 1 מ"ג / מ"ל פתרון. קח 50 מ"ג של אוקסיטוצין, והוסף אותו ל 50 מ"ל של מלוחים רגילים כדי להכין תמיסת 1 מ"ג / מ"ל.
      הערה: המינון של הזרקה intraperitoneal של אסטרדיול בנזואט ואוקסיטוצין הוא 10 מ"ג / (kg∙day). אסטרדיול בנזואט מומס בשמן זית, ואוקסיטוצין מומס במי מלח רגילים. אסטרדיול בנזואט אינו קל להתמוסס בשמן זית וניתן לטפל בו באמצעות אולטרסאונד כדי להאיץ את ההתמוססות. הן אסטרדיול בנזואט והן אוקסיטוצין פתרונות חייב להיות מוכן מדי יום.
    2. חשב את נפח תמיסת אסטרדיול בנזואט שיש ליישם לכל חולדה (כלומר, V = 10 מ"ג / [kg∙day] × 200 גרם / [1 גרם / מ"ל] = 2 מ"ל). חשב את נפח תמיסת האוקסיטוצין שיש ליישם לכל חולדה (כלומר, V = 10 מ"ג / [kg∙day] × 200 גרם / [1 גרם / מ"ל] = 2 מ"ל).
  2. קיבוץ ואדמיניסטרציה של בעלי חיים
    הערה: עשרה ימים הוקצו לניהול25,26. במהלך הטיפול, לחולדות הייתה גישה בלתי מוגבלת לצ'או רגיל ולמים. בתוך 30 דקות ממתן אוקסיטוצין, בוצע מעקב אחר פעילות ההתפתלות של כל חולדה. מודל חולדות הפרקינסון פותח בהצלחה, כפי שמעידות תגובות הפיתול של חולדות המודל, שכללו התכווצות הרחם, סיבוב גפה אחת, הארכת גפה אחורית, גזע חלול והתכווצות בטן26.
    1. הקצו 24 נקבות חולדות Sprague-Dawley (חולדות SD, בנות 8-10 שבועות, במשקל 200 גרם ±-20 גרם) לארבע קבוצות בקבוצת ביקורת אקראית, מודל, CR ו-CRV – והאכילו אותן במשך 7 ימים.
    2. ניהול בעלי חיים
      1. הזרקה תוך-צפקית של חולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV עם 2 מ"ל של תמיסת אסטרדיול בנזואט מדי יום. תוך צפקית להזריק את החולדות בקבוצת הביקורת עם 2 מ"ל של מלוחים רגילים.
      2. מהיום השמיני, השלם את שלב 2.2.2.1. לאחר מכן, יש לתת באופן תוך-גסטרי 2 מ"ל תמצית CRV לחולדות בקבוצת CRV, 2 מ"ל תמצית CR לחולדות בקבוצת CR, ו-2 מ"ל מלח רגיל לחולדות בקבוצת הביקורת ובקבוצת המודל.
      3. ביום העשירי, השלם את שלב 2.2.2.2. לאחר מכן, הזריקו תוך צפקית את החולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV עם 2 מ"ל של תמיסת אוקסיטוצין ואת החולדות בקבוצת הביקורת עם 2 מ"ל של תמיסת מלח רגילה.
    3. תעד את זמני ההתפתלות של החולדות בתוך 30 דקות מהזרקת האוקסיטוצין.
  3. אוסף דוגמאות
    1. לאסוף דגימות דם של אבי העורקים הבטני, להוציא את הרחם במהירות ובשלמות, ולהפריד בזהירות את רקמת החיבור והשומן הנצמדים לדופן הרחם.
      הערה: הדם נאסף קרוב לשעה לאחר המנה הסופית.
    2. השתמש צינורות microcentrifuge כדי לשמר ולהעביר את רקמת הרחם לחנקן נוזלי. אחסן את דגימות הרקמה ב -80 ° C.
    3. צנטריפוגה את דגימות הדם במשך 10 דקות ב 4,125 × גרם. הסר את הסופרנטנט המכיל את הסרום, ואת הצנטריפוגה ב 16,502 × גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגר את הסרום, ולאחר מכן לשמור אותו בצינור ב -80 ° C לאחסון.
      הערה: יש להשאיר את דגימות הדם בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לצורך עיבוד מחדש.
  4. עיבוד דוגמאות
    1. דוגמיות סרום
      1. שים 400 μL של מתנול ו 200 μL של סרום לתוך צינור microcentrifuge, מערבולת במשך 30 s כדי לערבב. צנטריפוגה כל דגימה במשך 15 דקות ב-16,502 × גרם ב-4°C. מלאו את הבקבוקים לדוגמה בסופרנאטנט לאחר איסוף וסינון. ערבבו את כל הסופרנאטנטים מכל דגימה באותו נפח כדי להכין דגימות בקרת איכות לבדיקה.
    2. דגימות רקמת רחם
      1. קח 100 מ"ג של רקמת הרחם מן קטע ipsilateral ולטחון אותו עם נפח פי תשעה של מלוחים נורמליים. צנטריפוגות את ההומוגנט למשך 10 דקות במשקל 4,125 × גרם, ואוספות את הסופרנטנט. הכניסו את הסופרנאטנט למקרר בטמפרטורה של 4°C לבדיקה או בטמפרטורה של -80°C אם לא נבדקו באותו היום.
      2. מניחים כדורי מלח, רקמה ופלדה רגילים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, מכניסים את צינור המיקרוצנטריפוגה לחנקן נוזלי למשך 3-5 שניות, ולאחר מכן מכניסים את הרקמה למטחנת רקמות לטחינה.
  5. בדיקות לדוגמה
    1. השתמשו בבדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) כדי למדוד את תכולת PGF2α ו-PGE2 ברקמות הרחם של דגימות החולדות.
      הערה: ערכת החולדה PGE 2 ELISA שימשה למדידת תכולת PGE2, וערכת PGF 2α ELISA של החולדה שימשה למדידת רמת PGF2α. את השלבים המפורטים ניתן למצוא בהוראות היצרן. פרטי הערכה מופיעים בטבלת החומרים.
    2. הערך את דגימת הסרום, תמצית CR ותמצית CRV באמצעות UPLC-MS/MS.
      1. עבור UPLC, השתמש בטור C18 (2.6 מיקרומטר, 2.1 מ"מ x 100 מ"מ) ובשיטת שיפוע בינארית עם שלב A נייד המכיל 0.1% חומצה פורמית ושלב B נייד המכיל אצטוניטריל. הגדר את שיפוע elution כדלקמן: מ 0 דקות עד 1 דקה, 15% B; מ 1 דקות עד 8.5 דקות, 15% עד 85% B; מ 8.5 דקות עד 11.5 דקות, 85% B; מ 11.5 דקות עד 11.6 דקות, 99% עד 1% B; ומ-11.6 דקות עד 15 דקות, 15% B. הגדר את קצב הזרימה ל-0.35 מ"ל/דקה ואת נפח ההזרקה ל-2 מיקרוליטר.
      2. עבור MS, הגדר את הטמפרטורה ל- 600 ° C, את קצב זרימת גז המסך (CUR) ל- 0.17 MPa, ואת קצב זרימת הנדן וגז העזר ל- 0.38 MPa. הגדר את מתח ריסוס היונים של מצב היונים החיוביים ומצב היונים השליליים ל- 5.5 kV ו- -4.5 kV, בהתאמה, את מתח פוטנציאל פירוק האשכולות (DP) ל- 80 V או -80 V, את אנרגיית ההתנגשות (CE) ל- 40 eV או -25 eV, ואת סופרפוזיציית אנרגיית ההתנגשות (CES) ל- 35 eV ±- 15 eV.
      3. בצע את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות UPLC-MS/MS. בצע MS לטווח מסה של 50-1,000 m/z.
      4. השג את תוצאות UPLC-MS/MS באמצעות תוכנית תחנת העבודה התואמת בשילוב עם רכישה תלוית מידע של מצב האיתור, מסנן פגמי מסה מרובים וניכוי רקע דינמי. השתמש בדגימות בקרת האיכות של הסרום המשותף כדי לבדוק את החזרתיות והיציבות של ציוד UPLC-MS/MS כדי לאמת את הגישה הקונבנציונלית. לפני דגימות המחקר, הזריקו את דגימות בקרת האיכות במשך ארבע ריצות רצופות, ולאחר מכן הזריקו אותן לאחר כל חמש דגימות בסרום.

3. עיבוד נתונים

  1. הכנת נתונים
    1. השתמש בתוכנת המרה כדי להמיר את הנתונים הגולמיים לתבנית mzXML. נרמל את נתוני זרם היונים הכולל (TIC) של כל דגימה.
      הערה: יישום פנימי מבוסס R (www.lims2.com) שנבנה על XCMS שימש לניתוח המידע עבור אינטגרציה, יישור, חילוץ וזיהוי שיא27.
    2. בצע ביאור מטבוליטים באמצעות מסד נתונים קנייני של MS2 (www.lims2.com). הגדר את סף הביאור ל- 0.328.
      הערה: המטבוליטים האנדוגניים זוהו בכל קבוצה.
  2. ניתוח רכיבים עיקריים ואנליזה דיסקרימיננטית אורתוגונלית חלקית לפחות ריבועית
    1. השתמש בתוכנת ניתוח כדי לבצע את ניתוח הרכיבים העיקריים (PCA) ואת המידול. ייבא את הנתונים הסטנדרטיים של המטבוליטים לתוכנת הניתוח. לאחר מכן, השתמש בהתאמה אוטומטית כדי לבנות את מודל הניתוח. לבסוף, השתמש בניקוד כדי להשיג את תרשים פיזור הניקוד של PCA.
      הערה: האשכולות של כל קבוצה התקבלו עם תרשים פיזור הניקוד של PCA. PCA הוא מצב ניתוח ללא פיקוח שבעיקר מקבץ את הדגימות באמצעות הפחתת ממד ללא התערבות.
    2. השתמש בתוכנת הניתוח כדי לבצע את ניתוח הדיסקרימיננטה האורתוגונלית החלקית הכי פחות ריבועית (OPLS-DA).
      1. ייבא את הנתונים הסטנדרטיים על המטבוליטים בקבוצות CR ו- CRV לתוכנת הניתוח.
      2. יבא את הנתונים מקבוצת CR לקבוצת CR שנוצרה, וייבא את הנתונים מקבוצת CRV לקבוצת CRV שנוצרה.
        הערה: OPLS-DA הוא מצב ניתוח מפוקח, ויש צורך בקיבוץ של הדגימות.
      3. לאחר מכן, השתמש בהתאמה אוטומטית כדי לבנות את מודל הניתוח, והשתמש בניקוד כדי להשיג את תרשים פיזור הניקוד של OPLS-DA. לבסוף, השתמש ב- VIP כדי לקבל את משמעות המשתנה בערך ההקרנה ( VIP ) ב- OPLS-DA.
        הערה: משמעות המשתנה בערכי ההיטל (VIP) של המטבוליטים בקבוצות CR ו- CRV הושגה באמצעות OPLS-DA.
  3. זיהוי מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים
    1. סנן את המטבוליטים עם ערכי VIP גדולים מ- 1 בשלב 3.2.2.3.
    2. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לחשב את ערך P של המטבוליטים שהוקרנו בשלב 3.3.1 על ידי מבחן t של התלמיד.
      הערה: הבדלים משמעותיים במטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים בקבוצות CR ו- CRV נקבעו על ידי מבחן t של סטודנט. המטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים היו אלה עם ערך p של מבחן t של סטודנט < 0.05 ומובהקות משתנה בהיטל (VIP) גדול מ-1. הייצוג הושג באמצעות חלקה וולקנית.
  4. זיהוי המטבוליטים הדיפרנציאליים
    1. סנן את המטבוליטים הדיפרנציאליים הפוטנציאליים בשלב 3.3. השתמש בתוצאות שלב 3.1.2 כדי לזהות מטבוליטים דיפרנציאליים אלה.
      הערה: זוהו מספר קטן של מטבוליטים דיפרנציאליים פוטנציאליים, והם הפכו למטבוליטים הדיפרנציאליים המועמדים.
    2. סנן את המטבוליטים הדיפרנציאליים שיש להתאים במסד הנתונים של KEGG. הצג את השינויים במטבוליטים הדיפרנציאליים בקבוצות CR ו- CRV על ידי ציור מפת חום.
      הערה: מספר קטן של מטבוליטים דיפרנציאליים מועמדים הותאמו, והם הפכו למטבוליטים דיפרנציאליים.
  5. בחינת המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים
    1. העלה את המטבוליטים השונים למסד הנתונים Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. השתמש בניתוח מסלולים כדי להשיג את המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים.
      הערה: המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים התקבלו בקבוצות CR ו- CRV. ערך P וערך ההשפעה היו שני אינדיקטורים חשובים מאוד בבחירת המסלולים הקריטיים. ערך P היה חשוב יותר מערך ההשפעה. מובהקות הוגדרה על ידי ערך P < 0.05; ערכי השפעה גדולים יותר היו קשורים למתאמים טובים יותר.
    3. נתח את המסלולים המטבוליים הפוטנציאליים על ידי העלאת המטבוליטים השונים למסד הנתונים של KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      הערה: יש לשקול גם את הקשר בין תפקוד המסלול המטבולי לבין מחלת פרקינסון. המסלולים המטבוליים הקריטיים התקבלו.
  6. זיהוי המרכיבים הנקלטים בדם
    1. זהה את המרכיבים הכימיים בתמציות CR ו- CRV באמצעות מסד הנתונים הפנימי MS2 (www.lims2.com), מסד הנתונים של חילוף החומרים האנושי (HMDB) ומסדי הנתונים Massbank ו- Chemspider.
    2. קבע את המרכיבים שנספגו בדם בקבוצות CR ו- CRV, והשווה את המרכיבים בין קבוצות CR ו- CRV.
      הערה: המרכיבים הנספגים בדם חייבים להיות מזוהים בקבוצות CR או CRV, אך לא ניתן לזהות אותם בקבוצת הביקורת.
  7. ניתוח סטטיסטי
    1. נתח את הנתונים באמצעות ניתוח חד משתני (UVA) ושיטות סטטיסטיות מרובות משתנים, כולל ניתוח השונות (ANOVA) ומבחן t של התלמיד.
      הערה: המידע הניסיוני הוצג באמצעות תוכנה סטטיסטית כממוצע ± סטיית תקן (±SD). P < 0.01 נחשב להבדל משמעותי ביותר, ו - P < 0.05 ייצג הבדל משמעותי28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ניסוי מודל דיסמנוריאה
לא הייתה תגובה מתפתלת תוך 30 דקות בקבוצת הביקורת, כי לחולדות האלה לא הוזרקו אוקסיטוצין ואסטרדיול בנזואט תוך צפקית כדי לגרום לכאב. החולדות בקבוצות המודל, CR ו-CRV הראו תגובות התפתלות משמעותיות לאחר הזרקת האוקסיטוצין. תוצאות אלה מדגימות את היעילות של שילוב אסטרדיול בנזואט ואוקסיטוצין לגרימת דיסמנוריאה. ההבדלים ברמות PGF 2α, PGE 2 ו-PGF2α/PGE2 בין המודל לקבוצות הביקורת היו משמעותיים (P < 0.001, P <-0.05), והדגימו את יע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל המגוון הרחב והאופי השונה של TCMs, צמחי מרפא אלה לפעמים לא עובדים בפועל קליני, וזה יכול להיות בגלל עיבוד לא מתאים decocting של TCMs. המנגנונים של TCM הופכים ברורים יותר עם השימוש במדע וטכנולוגיה עכשוויים29,30. מחקר זה מראה כי הן ל-CRV והן ל-CRV יש השפעות טיפוליות בחולדות מודל פרקינסון וכי ההשפעה הטיפולית של CRV משמעותית יותר. מנגנון הפעולה של CRV יכול להיות קשור לעובדה שעיבוד חומץ עשוי להשפיע על המרכיבים של CR שנספגים בדם ויכול להיות קשור למטבוליזם של חומצה לי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות ותכנון המשפחה העירונית של צ'ונגצ'ינג פרויקט המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית (מספר פרויקט: ZY201802297), פרויקט כללי של קרן צ'ונגצ'ינג למדעי הטבע (מספר פרויקט: cstc2019jcyj-msxmX065), אזור ההר המודרני של צ'ונגצ'ינג מאפיין יעילות גבוהה תוכנית גיבוש צוות חדשנות של מערכת טכנולוגיה חקלאית 2022 [10], ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ'ונגצ'ינג של מטריה סינית עיבוד מדיקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אצטוניטריל פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב197164
בקמן קולטר מיקרופוג 20בקמן  קולטר בע"מ
אסטרדיול בנזואטשנחאי מקלין ביוכימיה ושות', בע"מC10042616
חומצה פורמיתפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב177799
מערכת LC 30AShimadzu, קיוטו, יפן228-45162-46
שמן זיתשנחאי Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
אוקסיטוצין סינתטיג'ה-ג'יאנג פפטיד ביולוגיה ושות', בע"מ 
חולדה PGF<תת>2<תת>ואלפא; < / sub> ערכת ELISAשנחאי lmai ביוהנדסה ושות', בע"מ202101
חולדה PGFE2< / sub> ערכת ELISAשנחאי lmai ביוהנדסה ושות', בע"מEDL202006217
SPF Sprague-Dawley חולדותהונאן SJA מעבדה בעלי חיים ושות', בע"ממספר תעודה SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, אוסטריה1510002987
מערכת Triple TOF 4600SCIEX, פרמינגהם, מסצ'וסטס, ארה"בBK20641402
מיםפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב152720
MRZ15K0472019092001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009(2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558(2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962(2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832(2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867(2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709(2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238(2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773(2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763(2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642(2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233(2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768(2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181(2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119(2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448(2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966(2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191(2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683(2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628(2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555(2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyperi RhizomaVinegar ProcessingPrimary DysmenorrheaLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryMetabonomics AnalysisDifferential MetabolitesKEGG PathwayPrincipal Component AnalysisOrthogonal Partial Least Squares

Related Articles