מאמר שיטה

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64699

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר את השיטה לדמיין ולפתח מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של אוסטיאוציטים בתוך הרשת הלאקונרית-קנאליקולרית (LCN) לניתוח דינמיקת נוזלים חישובית (CFD). המודלים שנוצרו בשיטה זו מסייעים להבין אוסטיאוציטים mechanosensation בעצמות בריאות או חולות.

תקציר

אוסטיאוציטים הם תאי עצם שנחשבים כמגיבים לזנים מכניים וללחץ גזירה של זרימת נוזלים (FFSS) על ידי הפעלת מסלולים ביולוגיים שונים בתהליך המכונה מכנוטרנסדוקציה. מודלים קונפוקליים של רשתות אוסטיאוציטים הם כלי רב ערך לביצוע ניתוח Computational Fluid Dynamics (CFD) להערכת עומסי גזירה על קרום האוסטאוציטים, שלא ניתן לקבוע באמצעות מדידה ישירה. מודלים חישוביים באמצעות תמונות ברזולוציה גבוהה אלה של הארכיטקטורה המיקרו-מבנית של העצם שימשו כדי לדמות מספרית את העומס המכני המופעל על העצם ולהבין את הגירוי המושרה על ידי עומס של אוסטיאוציטים.

מחקר זה מרחיב את השיטות לפיתוח מודלים תלת-ממדיים של אוסטיאוציטים בודדים באמצעות תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של רשת Lacunar-Canalicular Network (LCN) לביצוע ניתוח CFD תוך שימוש בתוכנות מידול חישוביות שונות. לפני מיקרוסקופיה קונפוקלית, עצמות העכבר חתוכות ומוכתמות בצבע פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) כדי לסמן את LCN. ברזולוציה של 100x, תמונות Z-stack נאספות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומיובאות לתוכנת MIMICS (תוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית) כדי לבנות מודל פני שטח של תהליכי LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים.

לאחר מכן משטחים אלה מופחתים באמצעות פעולה בוליאנית בתוכנת 3-Matic (תוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת-ממדית) כדי למדל את החלל הנוזלי הלאקונרי סביב גוף התא האוסטיאוציטי ואת החלל הקנליקולרי סביב הדנדריטים המכילים נוזל לאקונוקנליקולרי. גיאומטריית נוזל נפחי תלת מימדית מיובאת לתוכנת ANSYS (תוכנת סימולציה) לניתוח CFD. ANSYS CFX (CFD תוכנה) משמשת להפעלת עומס פיזיולוגי על העצם כלחץ נוזלים, ונקבעים לחצים על האוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים. המורפולוגיה של LCN משפיעה על ערכי עקת הגזירה שחשים קרום התא האוסטיאוציטי ותהליכי התא. לכן, הפרטים על האופן שבו מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית מפותחים יכולים להיות בעלי ערך בהבנת אוסטיאוציטים מכנוסנסציה ויכולים להניח את היסודות למחקרים עתידיים בתחום זה.

מבוא

אוסטיאוציטים מניחים לווסת את מסת העצם בתגובה לפעילות גופנית1. עיוות ממברנה של אוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים שלהם עקב עומס מכני, חושף אותם ל- FFSS, אשר מזוהה על ידי האוסטיאוציטים ומפעיל איתות תוך תאי 2,3,4. מיקרו-מבנה העצם עובר הידרדרות או שינויים במורפולוגיה הלאקונרית-קנאליקולרית שלו עקב הזדקנות או מחלות עצם כגון אוסטאופורוזיס וסוכרת ובמצבים כגון מחסור בפרלקן הגורם לפגיעה בתגובת מכנו של אוסטיאוציטים 5,6. שינויים אלה בארכיטקטורת העצם גורמים לאוסטיאוציטים לחוות רמות שונות של FFSS וזנים 7,8. חשוב לציין, FFSS שחווים אוסטיאוציטים בתגובה לעומס מכני קשה לכימות in vivo מכיוון שהם מוטמעים במטריצת העצם המסוידת.

מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית היא טכניקה רבת עוצמה להתגבר על המגבלות של חקר אוסטיאוציטים בלתי נגישים בסביבתם הטבעית על ידי שכפול מודלים ממוחשבים של LCN 9,10. עיבוד ומידול הרשת המחוברת של LCN בתלת-ממד היה מאתגר. קיימות מספר טכניקות הדמיה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), חתך פנים של בלוקים טוריים ומיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת טורית (FIB/SEM)2,11,12. טכניקה רבת ערך פותחה כדי לדמיין עצם 13,14,15 וליצור מודלים תלת ממדיים של אוסטיאוציטים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). CLSM נבחרה כאן למידול חישובי ולא לטכניקות הדמיה אחרות בשל יכולתה לצלם את כל נפח הלקונה ואת רוב הקנליקולי בתלת מימד16,17. ניתן ליצור את גאומטריית LCN באמצעות CLSM עבור ניתוח אלמנטים סופיים של אוסטיאוציטים (FEA) לחיזוי זני עצם. עם זאת, ניתוח נוזלים כדי לחזות FFSS שחווים אוסטיאוציטים הוא מסובך יותר מכיוון שהוא דורש מידול של קרום התא של האוסטיאוציטים והדנדריטים שלו בתוך LCN כדי לאפשר מידול של החלל הלאקונרי-קנליקולרי הצר, שבו הנוזל הבין-תאי נע סביב18.

בפרוטוקול זה, צבע פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) מוחל על חלקי עצם עבים לא מסוידים לפני מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לתייג את LCN בתוך העצם, וממברנות אוסטיאוציטים-דנדריטיות מודלות על סמך נתוני הדמיה מה-LCN. המרחב הלאקונרי-קנליקולרי מדומה באמצעות מודלים חישוביים, ועומס פיזיולוגי כתוצאה מפעילות גופנית ממודל באמצעות גישת CFD. האוסטיאוציטים נתונים לשיפוע לחץ נוזל בתוכנת CFD כדי לנתח את פרופיל הנוזל בתוך ה- LCN ולמדוד FFSS על האוסטיאוציטים והקרומים הדנדריטיים. יתר על כן, גישת FEA יכולה למדוד זנים או לחצים של אוסטיאוציטים על ידי הפעלת עומס מכני דחוס.

טכניקת שינוי גיאומטריה פותחה גם כדי לשנות את המיקרו-מבנים הנגזרים מתמונות של עצם צעירה ובריאה על מנת לדמות את המורפולוגיה הלאקונרית-קנאליקולרית שהשתנתה בבעלי חיים זקנים או באלה עם מחלות עצם. שינויים במיקרו-מבנה העצם כללו הפחתת מספר הקנליקולי עם ההזדקנות, הקטנת שטח החלל הלאקונרי-קנליקולרי כדי למדל מה קורה במחסור בפרלקן והגדלתו להשפעות הזדקנות מודל, והקטנת שטח הדופן הקנליקולרית והדנדריטית למודל עצם סוכרתית 5,6. טכניקת שינוי הגיאומטריה מאפשרת לנו להשוות FFSS שחווים אוסטיאוציטים בעצמות עם מיקרו-מבנים שונים, כגון צעירים לעומת זקנים או עצמות בבעלי חיים בריאים לעומת חולים.

באופן כללי, מידול מבוסס תמונה קונפוקלית הוא כלי רב ערך להדמיית המורפולוגיה של אוסטיאוציטים בעצמות בריאות, כמו גם בשינויים הקשורים להזדקנות / מחלות במורפולוגיה של אוסטיאוציטים. יתר על כן, פרמטרים מורפולוגיים של אוסטיאוציטים, כגון שטח הפנים ונפח החלל הלאקונרי-קנאליקולרי, ניתנים למדידה ולהשוואה בעצמות שונות כדי לחזות תגובות תאיות למתח מכני.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיזורי, קנזס סיטי (UMKC), ותאמו את ההנחיות הפדרליות הרלוונטיות.

1. תהליך הכנת העצם

  1. אספו את עצם הירך מעכברות C57BL6 בנות 4 חודשים ו-22 חודשים וקיבעו אותן בפרפורמלדהיד קר 4% ב-PBS למשך 24 שעות ב-4°C עם נדנוד עדין, ואז שטפו אותן ב-PBS ואחסנו אותן באתנול 70% לפני ההטבעה.
    הערה: נפח קיבוע צריך להיות בערך פי 20 מנפח הרקמה
  2. יש להטמיע עצמות במהירות באקריליק מתפלמר מהיר (טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: חשוב להשתמש בשרף פילמור מהיר לשלב זה (~ 10 דקות). המטרה היא לתמוך ברקמת העצם במהלך החתך באמצעות מסור היהלום, אך מבלי שהשרף יחדור לתוך ה- LCN, מה שיחסום את כתם ה- FITC מלחדור פנימה.
  3. חתכו פרוסות רוחביות עבות בעובי 300 מיקרומטר מאתר סטנדרטי מעל הטרוכנטר השלישי באמצעות מסור יהלום ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C באתנול 70% לפני צביעת FITC.
  4. לטש את החלקים באמצעות 600, 800, ולאחר מכן 1200 grit נייר זכוכית לעובי סופי של ~ 90-100 מיקרומטר.
    הערה: השגת עובי מתאים הובטחה באמצעות קליפר דיגיטלי.
  5. שטפו את החלקים באתנול 70%, 95% ו-100% במשך 5 דקות כל אחד.
  6. הכתימו אותם ב-1% FITC ב-100% אתנול למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT) בחושך עם רעד מתון.
  7. שטפו את החלקים באתנול 100% במשך 30 דקות עם רעד עדין בחושך. לאחר מכן, יבשו אותם באוויר למשך הלילה בחושך.
  8. כדי להרכיב, מקם את החלק בטיפת מדיה להרכבה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. השתמש במלקחיים כדי למקם את החלק שטוח ככל האפשר כנגד המגלשה, הימנע מיצירת בועות אוויר ושימוש בשרף שמסביב כדי לתפעל את הדגימה. הרכיבו תלוש כיסוי על הדגימה.

2. מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיית פרוסות עצם מוכתמות ב- FITC.
  2. השתמש במטרה של שמן 100x 1.44NA עם זום דיגיטלי של 1.7 וגודל צעד של 0.126 מיקרומטר כדי לאסוף ערימות Z מפורטות של 400 מישורי Z ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים, רזולוציה של 0.089 מיקרומטר.
  3. השתמש בלייזר 488 ננומטר לעירור, עם חלון איסוף פליטה של 496-596 ננומטר. אסוף את אוספי התמונות באמצעות הגדרות פיצוי כדי לתקן אובדן אות עם הגדלת עומק ההדמיה.
  4. הגדל את הדיוק והרזולוציה של התמונות באמצעות טכניקות איסוף תמונות, כגון דגימת יתר והגדלת ממוצע הקו. כמו כן, אספו את התמונות ברזולוציה של 5x, 20x ו-100x של מקטעים רוחביים של מקטעי עצם הירך כפי שמוצג באיור 1.
    הערה: התמונה ברזולוציה נמוכה (5x) באיור 1 מציגה את אזור החתך המלא של עצם הירך, עם שלושה אזורים שנבחרו עבור שדות הדמיה של 100x.
  5. השתמש 100x Z-stacks עבור מודלים המחשב של אוסטיאוציטים.

3. דוגמנות מחשב

  1. ייבא את תמונות 100x שנאספו, בפורמט TIFF, לתוכנת ImageJ כדי לבנות רצף של תמונות של LCN בכיוון Z.
  2. ייבא את ערימות Z לתוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית כדי לבנות מסיכה של LCN לאחר הגדרת כיוון התמונה.
  3. סף התמונה המקורית של העכברים הצעירים והמבוגרים בין 30,012-45,677 יחידות Hounsfield ו 15,000-46,701 יחידות Hounsfield, בהתאמה, כדי להיות דומה מאוד LCN. התאימו את 'סף' בתפריט המקטעים כדי לשנות את מגבלות עוצמת הפיקסלים לצורך הכללה במסיכה.
  4. חתוך לאקונה אחת עם הקנליקולי שלה כאזור העניין (ROI) מהערימה באמצעות הפעולה מסיכת חיתוך . הגדירו את החזר ההשקעה כך שיקיף את הלקונה במרכז הקובייה, וכל הקנליקולי המחובר אליה יתרחב לדפנות הקובייה. עטפו את הלקונה בקובייה דמיונית גדולה יותר עם אורכי צד של 21 מיקרומטר, 14 מיקרומטר ו-19 מיקרומטר.
  5. מכיוון שהמודל נוצר ממספר חלקים, בצע פעולת הגדלת אזור כדי לבחור את אזורי הפיקסלים המחוברים, להסיר רעש ולהסיר כתמים כדי ליצור LCN אחיד.
  6. המר את המסיכה הלאקונרית-קנאליקולרית לאובייקט באמצעות הפעולה 'חלק מחושב' בתוכנת העיבוד מבוססת התמונה התלת-ממדית.
  7. בנה את האוסטיאוציטים ואת הממברנות הדנדריטיות על ידי הפחתת נפח LCN באמצעות פעולת החלקה. בצע פעולה זו מספר פעמים כדי להשיג עובי חלל לאקונרי ותעלות של 0.75 מיקרומטר ו 0.08 מיקרומטר, בהתאמה 9,18.
  8. יצא את האובייקטים (תבנית STL) כשלב האחרון בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית.
  9. ייבא שתי שכבות של הממברנות LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים לתוכנת אופטימיזציית הנתונים התלת-ממדית כדי ליצור רשת נפח.
  10. השתמש בכלי אשף התיקון בתוכנה כדי לזהות בעיות רשת בכל חלק. בדוק את איכות רשת השינוי במקטע האבחון של אשף התיקון לאחר כל פעולה.
  11. הסר את החלקים הרגילים ההפוכים, המשולשים המצטלבים וקווי המתאר הפגומים באמצעות פעולת התיקון האוטומטי באשף התיקון.
  12. החלף את המשולשים החופפים באופן ידני על-ידי הגדרת משולשים חדשים או באופן אוטומטי באמצעות הפעולה Fill Hole Normal .
  13. שפרו את איכות רשת השינוי באמצעות פעולות הכוללות סינון משולשים חדים, קצוות קטנים וקליפות קטנות.
  14. לאחר שיפור איכות הרשת, יש לשלב שני משטחים של ממברנות LCN ואוסטאוציטים-דנדריטים למשטח אחד (חלל נוזלי לאקונרי-קנליקולרי) השייך לשני החלקים באמצעות מכלול ללא סעפת.
  15. צור מודל נפחי של המרחב הלאקונרי-קנליקולרי באמצעות פעולת Remesh ולאחר מכן יצא אותו כקובץ STL. התאם את קנה המידה של האובייקטים כך שיהיה במיקרומטרים במקטע הייצוא.

4. טכניקת שינוי גיאומטריה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת ממדית ובתוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת ממדית

הערה: טכניקת שינוי הגיאומטריה משמשת למדל שינויים במורפולוגיה של אוסטיאוציטים, כגון צפיפות וקוטר של תעלה ועובי לאקונר-קנליקולרי עקב הזדקנות או מחלת עצמות.

  1. בחר את האוסטיאוציטים הצעירים כמודל הבסיס ושנה אותו כדי לבנות מודלים אוסטיאוציטים מובחנים אחרים על ידי החלת שינויים מורפולוגיים.
  2. צור מודל אוסטיאוציטים עם צפיפויות קנאליקולריות שונות ממודל הבסיס על ידי שינוי סף התמונה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית.
    1. בחרו סף נמוך יותר כדי להפחית את עוצמת האור של התמונה ולקבל לאקונה עם פחות קנאליקולי. היתרון של טכניקת הסף הוא שצורת הלקונה וגודלה נשארים זהים, ורק השפעת צפיפות התעלה נלמדת. איור 2 מראה את מודל הגיל המדומה שנוצר מהאוסטיאוציטים הצעירים באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה.
  3. פיתוח מודלים של אוסטיאוציטים עם עובי חלל לאקונרי-קנליקולרי שונה או קוטר דנדריט/תעלה בתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת-ממדית ובתוכנת אופטימיזציה לנתונים תלת-ממדיים. בנה מודלים גדולים או קטנים יותר של אוסטיאוציטים על-ידי פעולות עטיפה או החלקה , בהתאמה. איור 3 מראה שישה מודלים של אוסטיאוציטים עם שינוי בגיאומטריה שפותחה מהאוסטיאוציטים הצעירים.

5. ניתוח CFD

הערה: לאחר יצירת המודלים של אוסטיאוציטים נפחיים, מתבצעים מספר שלבים, כולל גיאומטריה, רשת והתקנה, במודול CFX של תוכנת הסימולציה.

  1. צור זרימה זורמת בתוכנת הסימולציה כדי להכין את המודלים לניתוח CFD.
  2. ייבא את הגיאומטריות מבוססות התמונה הקונפוקלית שפותחו לאזור הגיאומטריה של CFX, המכונה ANSYS SpaceClaim (כלי מידול תלת-ממדי). הגדר את מידות היחידה לננומטרים בהגדרה.
  3. גאומטריה מופיעה כשני היבטים של תהליך LCN ותהליכים אוסטיאוציטים-דנדריטיים. לחץ על פאה בתפריט העליון והסר את השגיאות הגיאומטריות כגון הצטלבויות, קצוות חדים או מחוברים יתר על המידה, וקודקודים, פתחים או חורים עבור כל פאה.
  4. לחץ על חיסור בתפריט פאה כדי להפחית את הפאה הקטנה יותר ואת התהליכים הדנדריטיים של אוסטאוציטים מהפן הגדול יותר, LCN, כדי להשיג גוף יחיד של מרחב לאקונרי-קנליקולרי. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית על הפאה שנוצרה והמיר אותה מפאות לתחום מוצק מבלי למזג פרצופים. איור 4 מתאר את אזור החתך של מודל האוסטיאוציטים הצעירים, המייצג את החלל הלאקונרי-קנליקולרי.
  5. לחץ על רשת שינוי ובחר אלמנטים טטרהדרליים ליניאריים באמצעות גודל אלמנט של 0.06 מיקרומטר. עדכנו את הרשת באמצעות מחקר התכנסות רשת כדי שיהיו מספיק אלמנטים במערכת הדנדריטית הזעירה כדי להבטיח שהתוצאות יהיו בלתי תלויות בגודל הרשת.
  6. בחר את פני השטח ובחר את canaliculi בצד העליון של הקובייה הדמיונית כמו פתחי נוזל. בחרו את canaliculi בחמשת הפאות האחרות כשקעי נוזל באמצעות Box select.
  7. יצא את רשת השינוי (תבנית קובץ שוטפת) כשהיא נטענת מהר יותר בהגדרה בשלב הבא.
  8. צור Fluid Flow נוסף בתוכנת הסימולציה וייבא את הרשת השוטפת לאזור ההתקנה של CFX. הגדר שני תנאי גבול של כניסות ושקעים למשטחים שנבחרו מראש ככניסות/שקעים בעזרת האפשרות 'הוסף גבול '.
  9. כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים, הפעילו לחץ כניסת נוזל של 300 Pa ו- 0 Pa על הכניסות והשקעים, בהתאמה19,20. התייחסו למשטחים הנותרים כאל קירות עם מצב ללא החלקה באותו נוזל שיש לו מהירות אפס בממשק של קירות. נוזל זורם מהפתחים סביב הדנדריטים וגוף התא האוסטיאוציטים ויוצא מהקנליקולי האחרים שהוקצו כשקעים.
  10. התייחסו לנוזל הלמינרי הבין-תאי כאל מים9, שנבחרו מספריית החומרים. הגדר את המקטעים העברת חום, בעירה וקרינה תרמית לללא, מכיוון שלא מוגדרת העברת חום בבעיה. בחר את מצב Turbulence כמאפיין הנוזל ב- LCN, שהוא נוזל למינרי9.
  11. הפעל את התוכנה באמצעות דיוק כפול והתחלה ישירה כסוג השליחה. עקוב אחר המסה והתנע עד שהשאריות יורדות והופכות קבועות. לאחר התכנסות הפתרון, מדוד נתוני FFSS באמצעות מקטע CFD-post של תוכנת CFD.

6. עיבוד פוסט CFD

  1. כדי לתאר FFSS שחוו אוסטיאוציטים והדנדריטים שלהם, הכנס קווי מתאר חדשים בסעיף התוצאות של תוכנת CFD. צור מתאר FFSS על ידי בחירת גזירת הקיר על קרומי אוסטאוציטים-דנדריטים כמשתנה בתחום.
    הערה: כדי להציג טוב יותר FFSS גבוה בממברנות דנדריטיות, טווח ה- FFSS מוגדר כ - User Specified כדי לשנות ערכי מינימום/מקסימום של FFSS.
  2. הוספת קו מתאר מייעל של מהירות בתוך התחום הלאקונרי-קנליקולרי החל מהמפרצונים. הגדר את הדגימה למרווח שווה ובחר את מספר הנקודות כ- 2500. קטע אנימציה בתוכנת CFD מציג במדויק בתלת מימד כיצד חלקיקי הנוזל זורמים בתוך המרחבים הלאקונריים-קנאליקולריים באמצעות גרף קו הזרימה של המהירות.
  3. השתמש בכלי מחשבון הפונקציות בתוכנת CFD לניתוח גודל FFSS או מהירות בהתבסס על פרמטרים גיאומטריים, במיוחד כאשר ישנם מודלים שונים של אוסטיאוציטים (כלומר, צעירים לעומת זקנים). מדוד את הנפח ואת שטח הפנים של המרחב הלאקונרי-קנליקולרי כפרמטרים גיאומטריים יחד עם ערכי FFSS מרביים, מינימליים או ממוצעים.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפתח מודלים של אוסטיאוציטים שמקורם בקונפוקליים כדי לחקור את כמות זרימת הנוזלים, לחץ הגזירה שאוסטיאוציטים והתהליכים הדנדריטיים שלו נתונים לו עקב עומס מכני. עכבר C57BL6 זקן ועכבר צעיר נבחרו לבנות מודלים אוסטיאוציטים מבוססי תמונה קונפוקלית צעירה ומבוגרת. שישה מודלים אחרים של אוסטיאוציטים מדומים נוצרו מאותו מודל אוסטיאוציטים צעיר תוך שימוש בטכניקת שינוי הגיאומטריה כדי לחקור את השינוי במורפולוגיה LCN עקב הזדקנות או מחלת עצם. פרמטרים ששונו על ידי גיאומטריה כללו את העובי הלאקונרי-קנאליקולרי, צפיפות התעלה והקוטר. מודלים של אוסטיאוציטים מותאמים פותחו על ידי שינוי פרמטר אחד בכל פעם תוך שמירה על הפרמטרים האחרים זהים. לכן, ההשפעה של כל אחד מהפרמטרים המורפולוגיים על FFSS נבחנת בבידוד. התוצאות הראו כי כמות ה-FFSS שחווה אוסטאוציטים הייתה שונה במודלים אלה של אוסטיאוציטים, והראו את התלות של FFSS במורפולוגיה של LCN. ערכי FFSS נחזו בחלקים שונים של מודל האוסטיאוציטים, כגון גוף התא האוסטיאוציטי או קרומים דנדריטיים. דנדריטים בכל המודלים חוו ערכי FFSS גדולים יותר מאשר קרום גוף התא האוסטיאוציטים.

איור 5 מראה את קווי המתאר של FFSS עבור מודלים של אוסטיאוציטים צעירים לעומת זקנים שנוצרו ישירות מערימות תמונות קונפוקליות של FITC ושישה מודלים אחרים של אוסטיאוציטים שפותחו מ-Model 1 באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה. ה-FFSS הממוצע על אוסטיאוציטים וקרומים דנדריטיים במודל האוסטיאוציטים הצעירים (מודל 1) היה 0.42 Pa, שהוא משמעותי יותר מה-FFSS הממוצע של 0.13 Pa במודל האוסטיאוציטים המיושנים (מודל 2). הנתונים שהתקבלו מראים עלייה ב-FFSS הממוצע באוסטיאוציטים עם מרחב לאקונר-קנליקולרי גדול יותר (מודל 7 ומודל 8) וירידה ב-FFSS באוסטיאוציטים עם צפיפות תעלה נמוכה יותר (מודל 3 ומודל 4), בעוד ש-FFSS לא השתנה באופן משמעותי עם שינוי קוטר הדנדריטים במודל 5 ובמודל 6. לדגמים 2 ו-Model 4 היו ערכי ה-FFSS הנמוכים ביותר של 0.19 Pa ו-0.13 Pa, בהתאמה. עוצמת ה-FFSS במודל 8 גדולה יותר מאשר במודלים אחרים של אוסטיאוציטים. לא רק שרוב הדנדריטים בצבע אדום במודל 8, אלא שגוף התא האוסטיאוציטי גם חווה FFSS גבוה יותר מאשר בדגמים אחרים.

FFSS שחוו אוסטיאוציטים הוצג גם בהתבסס על נפח החלל הלאקונרי-קנליקולרי ושטח הפנים, שהתקבלו על ידי עיבוד לאחר ב- ANSYS CFX כדי לגלות את המתאם בין FFSS לבין המבנה המשתנה של LCN. ניתן היה גם למדוד את שטח הפנים של כל דגם שנחשף ל-FFSS גדול מ-0.8 Pa, שנחשב לרמת ה-FFSS שגורמת להיווצרות עצם21,22. מידול האוסטיאוציטים הראה מתאם בין ה-FFSS הממוצע לבין נפח החלל או שטח הפנים הלאקונרי-קנאליקולרי עבור כל המודלים של אוסטיאוציטים, כפי שמוצג בטבלה 1. האוסטיאוציטים המיושנים (Model 2) והאוסטיאוציטים המדומים בגיל העמידה (Model 4) בעלי צפיפות התעלה הנמוכה ביותר היו בעלי שטח הפנים הלאקונר-קנליקולרי הנמוך ביותר של 1372.7 מיקרומטר2 ו-1122.6 מיקרומטר2. לדגמים 2 ו-Model 4 היה גם נפח החלל הלאקונרי-קנליקולרי הנמוך ביותר של 229.4 מיקרומטר3 ו-203.5 מיקרומטר3, בהתאמה, שניתן לקשר אותו לכמויות הנמוכות של FFSS. דגם 6, עם קוטר הדנדריט הגדול ביותר, היה בעל שטח הפנים הלאקונר-קנליקולרי הגדול ביותר. דגם 8 היה בעל נפח החלל הלאקונרי-קנאליקולרי הגדול ביותר וערכי ה-FFSS הגדולים ביותר.

figure-results-1
איור 1: תמונות קונפוקליות במישור Z יחיד של חתך רוחבי של עצם הירך המוכתמת ב-FITC שצולמו עם מטרות שמן של 5x, 20x ו-100x. הרשת הלאקונרית-קנאליקולרית נראית בתמונה שצולמה עם המטרה 100x. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית של אוסטיאוציטים צעירים (Model 1) וזקנים (Model 2) שנוצרו מעצם הירך המוכתמת ב-FITC של עכבר C57BL6 בן 4 חודשים ו-22 חודשים. התמונה המוגדלת מראה את עובי הלאקונר-קנליקולרי (LC) עבור אוסטיאוציטים צעירים וזהה עבור אוסטאוציטים זקנים. תמונת מודל 1 שונתה באישור Niroobakhsh et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שישה מודלים של אוסטיאוציטים שפותחו ממודל 1 באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה. צפיפות התעלות הופחתה כדי ליצור מודל 3 (סימולציה בגיל העמידה) ומודל 4 (סימולציה מיושנת), בעוד שקוטר הדנדריט ועובי LC היו זהים למודל 1. מודל 5 ומודל 6 פותחו באותה צפיפות תעלה ועובי LC כמו מודל 1, בעוד שקוטר הדנדריט שלהם היה גדול פי שניים וארבעה ממודל 1. עובי הלאקונר-קנאליקולרי של מודל 7 ומודל 8 היה גדול פי שניים ופי ארבעה, בהתאמה, בעוד צפיפות התעלות וקוטר הדנדריט נותרו זהים לאלה שבמודל 1. תמונת מודל 1 שונתה באישור Niroobakhsh et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תצוגה תלת-ממדית של מודל אוסטיאוציטים צעירים מבוסס תמונה קונפוקלית. מבט תלת-ממדי על אזור החתך של מודל האוסטיאוציטים הצעירים מבוסס התמונה הקונפוקלית המתאר את מידול החלל הלאקונרי-קנליקולרי, המשמש לניתוח נוזלים סביב האוסטיאוציטים והדנדריטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: התפלגות FFSS עבור כל המודלים של אוסטיאוציטים מראה את התלות של גודל FFSS במורפולוגיה של אוסטיאוציטים. אזורים אדומים מראים את ערכי ה-FFSS הגבוהים ביותר, במיוחד על הממברנות הדנדריטיות ולא על גוף התא האוסטאוציטים. תמונה זו שונתה באישור Niroobakhsh et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מודליםשטח פנים לאקונרי-קנאליקולרי (μm2)נפח חלל לאקונרי-קנאליקולרי (μm3)Ave FFSS (Pa)
מודלים אוסטיאוציטים מבוססי תמונה קונפוקליתדגם 12652.92610.42
צעיר (בן 4 חודשים)
דגם 21372.7229.40.19
גיל (בן 22 חודשים)
מודלים מדומים של אוסטיאוציטים שנוצרו באמצעות טכניקת שינוי גיאומטריהדגם 31530.4242.60.27
(מדומה בגיל העמידה)
דגם 41122.6203.50.13
(מיושן מדומה)
דגם 53724.9302.90.49
(2 x קוטר דנדריט)
דגם 647913370.57
(4 x קוטר דנדריט)
דגם 73116.3440.61.17
(2 x עובי LC)
דגם 83542.2658.21.89
(עובי 4 x LC)

טבלה 1: השוואה בין מודלים של אוסטיאוציטים. השוואה בין FFSS ממוצע, נפח מרחב לאקונרי-קנליקולרי ושטח פנים בשמונה מודלים שונים של אוסטיאוציטים, כולל שני מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית ושישה מודלים מדומים שנוצרו מ-Model 1 באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית להדמיה ומידול חישובי של האוסטיאוציטים. לפני הדמיה קונפוקלית מתבצע תהליך הכנת העצם לחתך והכתמת דגימות עצם. תמונות קונפוקליות בהגדלה של פי 100 מיובאות לתוכנות שונות כדי לפתח מודלים ממוחשבים של אוסטיאוציטים והמרחב הלאקונרי-קנליקולרי. ניתוח CFD נערך לבסוף על מודלים מבוססי תמונה קונפוקלית כדי למדל FFSS סביב אוסטיאוציטים וממברנות דנדריטיות עקב פעילות גופנית, אשר מאתגר מבחינה טכנית in vivo בשל חוסר הנגישות של אוסטיאוציטים במטריצת העצם. הפרוטוקול המסופק מועיל גם בקביעת מתח או זנים אחרים באמצעות גישה של אלמנט סופי או אינטראקציית מבנה נוזל (FSI) במידול מולטיפיזיקלי.

הדמיה קונפוקלית שימשה כדי להמחיש את LCN 7,9,24,25 בשל תמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשיג באמצעות צביעת FITC של העצם. למרות הקוטר של canaliculi קרוב לגבול הרזולוציה של המיקרוסקופ, תמונות קונפוקליות אמינות של canaliculi ניתן להשיג, אשר יכול ללכוד את רוב canaliculi. בשל הקוטר הקטן יותר של הדנדריטים האוסטיאוציטים, זה מאתגר יותר מבחינה טכנית ללכוד במדויק תמונות של הדנדריטים. לכן פותחה טכניקה מועילה למדל את האוסטיאוציטים והדנדריטים מתמונות קונפוקליות של LCN על ידי הקטנת נפחם באמצעות פעולת החלקה בתוכנה. כמה מחקרים אחרים שפורסמו השתמשו בגישה דומה כדי לקזז את LCN כדי ליצור את הממברנה אוסטאוציטים-דנדריטיים9. היתרון הנוסף של טכניקת ההחלקה הוא בשיפור חלק משגיאות ההדמיה ב-CLSM, כגון התארכות קוטר התעלה המתרחשת בציר Z עקב רזולוציית ההדמיה הנמוכה יותר בציר Z, שהיא תכונה של הדמיה אופטית. דה-קונבולוציה נחשבת גם לשיטה חלופית להקטנת המתיחה האופטית בכיוון Z מכיוון שהיא משפרת את האות לרעש במערך הנתונים המקורי. החלל הלאקונרי-קנליקולרי מעוצב מ-LCN ומממברנות אוסטיאוציטים-דנדריטיות כדי לנתח את פרופיל הנוזל בתוך ה-LCN.

יש לציין כי טכניקה חדשה הוצגה ביחס לשיטות קיימות לפיתוח מודלים של אוסטיאוציטים בעלי שינוי גיאומטרי מבלי להקריב עכבר נוסף. טכניקת שינוי הגיאומטריה מסייעת גם לדמות את השינוי של מיקרו-מבנה העצם עקב הזדקנות או מחלות עצם כגון אוסטאופורוזיס, סוכרת ומצבים כגון מחסור בפרלקן וכו '. בטכניקה זו, מודל אוסטיאוציטים מבוסס תמונה קונפוקלית של עכבר צעיר שימש כדי למדל את המורפולוגיה של אוסטיאוציטים זקנים או חולי עצם אחרים על ידי שינוי פרמטרים כגון צפיפות התעלה, החלל הלאקונרי-קנליקולרי וקוטר הדנדריט). גישה זו אוששה על ידי הדמיון בין שני מודלים של אוסטיאוציטים מיושנים, האחד ממודלים מבוססי תמונה קונפוקלית של אוסטיאוציטים אמיתיים מעכבר בן 22 חודשים והשני ממודלים של שינוי גיאומטריה של אוסטאוציטים שצולמו במקור מעכבר בן 4 חודשים על ידי הפחתת צפיפות התעלה שלו. שני מודלים אלה של אוסטיאוציטים מיושנים הראו גודל FFSS דומה, שהיה הנמוך ביותר מבין כל דגמי האוסטיאוציטים. לטכניקת שינוי הגיאומטריה יכולים להיות יישומים רבים בתחומים ביולוגיים שונים מכיוון שהיא יכולה לחזות תוצאות דומות למודלים של אוסטיאוציטים שנוצרו באמצעות אוסטיאוציטים אמיתיים מבעל חיים. חלק מהמגבלות של עבודה זו כוללות איבוד חלק מהפרטים של חספוס פני השטח עקב טכניקת ההחלקה והעובדה שהקטרים הקנאליקולריים נמצאים בגבול הרזולוציה של המיקרוסקופים הקונפוקליים, מה שעלול להוביל לחוסר דיוק מסוים עבור קנליקולי בקטרים קטנים יותר, וגם אידיאליזציה של זרימת נוזלים במקום מידול באמצעות זרימה תנודתית.

כדי להדגים את הפונקציונליות של הטכניקה, ערכי אוסטיאוציטים FFSS נמדדו עבור מודלים שונים של אוסטיאוציטים שנוצרו מעכבר צעיר וזקן או באמצעות טכניקת שינוי הגיאומטריה. אחד הממצאים הראויים לציון באמצעות מודלים ממוחשבים אלה היה שנפח החלל הלאקונרי-קנליקולרי עומד ביחס ישר ל-FFSS הממוצע שחוו האוסטיאוציטים. לממצא חדש זה, שלא נחקר קודם לכן, עשויים להיות יישומים שונים בקביעת תגובתיות המכנו של אוסטיאוציטים, שכן הוא יכול להתאים את המורפולוגיה של רשת האוסטיאוציטים ל- FFSS שזוהה על ידי האוסטיאוציטים והתהליכים שלהם.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לקרן הלאומית למדע (NSF, מספר פרס NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), המכון הלאומי לבריאות (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) ו- (NIH/SIG S10OD021665 ו- S10RR027668 PI: SL Dallas), ולתוכנית מענקי המחקר של בית הספר ללימודים מתקדמים של אוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,200 נייר זכוכית חצץBuehler30-5170-012-100
תוכנת 3-MaticMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-maticתוכנת אופטימיזציה של נתונים תלת מימדיים
600 נייר זכוכית חצץBuehler30-5118-600-100
800 נייר זכוכית חצץBuehler30-5170-800-100
תוכנתANSYSתוכנתסימולציה
https://www.ansys.com/ פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)Sigma-AldrichF7250
תוכנתhttps://imagej.net/ij/
שמן טבילה למיקרוסקופיםLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II מיקרוסקופ קונפוקלי Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Leitz 1600 מסור יהלום חור פנימיLeica 
תוכנת חבילת החדשנות של MIMICSMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suiteתוכנת עיבוד מבוססת תמונה תלת מימדית
Permount הר בינוניפישר מדעיSP15-500
Sampl-Kwick ערכת אקריליק לריפוי מהירBuehler20-3560
פלטפורמה אחת מעבדה שייקראמין מדעי INCדגם 55S
ANSYS ImageJ

מקורות

  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים