גישות תרגומיות חדשות לחקר מחלת כליות

Emma Laurence; Parveen Kumar; Tanecia Mitchell

doi:10.3791/64711

מאמר שיטה

גישות תרגומיות חדשות לחקר מחלת כליות

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64711

⸱

30 באוגוסט 2022

Emma Laurence¹ , Parveen Kumar¹ , Tanecia Mitchell¹

¹Department of Urology, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

קומאר, פ., בל, א., מיטשל, ט., אומדן ננו-גבישי שתן בבני אדם באמצעות תיוג סידן פלואורופור וניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. כתב העת לניסויים חזותיים. (168), e62192 (2021).

Doulamis, I. P. et al. מודל בעל חיים גדול לפגיעה כלייתית חריפה על ידי חסימה זמנית של עורק הכליה הדו-צדדי. כתב העת לניסויים חזותיים. (168), e62230 (2021).

Taguchi, K., Sugahara, S., Elias, B. C., Brooks, C. R. זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A. כתב העת לניסויים חזותיים. (177), e63178 (2021).

ינאי, ק. ואח'. הערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת של ביטוי מיקרו-RNA בכליות ובסרום של עכברים עם ליקוי כלייתי תלוי גיל. כתב העת לניסויים חזותיים. (182), e63258 (2022).

הולמס, ה. ל. ואחרים. שימוש באולטרסאונד רובוטי תלת מימדי לניתוח in vivo של כליות עכבר. כתב העת לניסויים חזותיים. (174), e62682 (2021).

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. העברת miRNA מסונתז מלאכותי אקסוגני לכליה באמצעות ננו-חלקיקי פוליאתילנימין במספר מודלים של עכברים למחלות כליות. כתב העת לניסויים חזותיים. (183), e63302 (2022).

וגנר, מ.ק., סנדובל, ר.מ., קמפוס-בילדרבק, ס.ב., מוליטוריס, ב.א. שימוש במיקרוסקופ דו-פוטוני כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכן חד צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63329 (2022).

מאמר מערכת

מבוא
מחקר בתחום הנפרולוגיה שיפר משמעותית את רווחתם של אנשים שנפגעו ממחלת כליות. עם זאת, מחלת כליות היא עדיין בעיה בריאותית מרכזית המשפיעה על יותר מ-10% מהאוכלוסייה ואחראית לעלייה בעלויות הבריאות ולתמותה ברחבי העולם¹. למרבה הצער, המנגנונים המדויקים המובילים למחלת כליות לא הובהרו במלואם. אוסף שיטות JoVE זה מדגיש אסטרטגיות עדכניות להגדרת פתופיזיולוגיה של הכליה. באופן ספציפי, קבוצות המחקר מציגות מודל חדשני של בעלי חיים ושיטות להערכה או לטיפול במחלות כליות באמצעות מודלים ניסיוניים או דגימות קליניות. העבודה המוצגת באוסף זה היא סדרה נוספת של תרומות מצוינות לתחום הנפרולוגיה ועשויה לספק דרכים חדשות למניעה, אבחון או טיפול במחלות כליות בעתיד.

מודל חייתי תרגומי של פגיעה כלייתית חריפה
פגיעה כלייתית חריפה (AKI) היא צורה נפוצה של מחלת כליות². מספר מודלים ניסיוניים שימשו לחקר פגיעה באיסכמיה כלייתית / רפרפוזיה (I/R) ^3,4,5. עם זאת, תרגום ממצאים אלה לשיפור הסביבה הקלינית הציב אתגרים רבים מכיוון שישנם הבדלים משמעותיים בין מינים⁶. Doulamis et al. פיתחו מודל I/R של כליות חזירים באמצעות קטטר בלון דו-צדדי כדי לטפל בבעיה זו⁷. המודל שלהם היה בעל יכולת שחזור גבוהה, גרם להפחתת תפוקת השתן ולקצב סינון גלומרולרי משוער, ולעלייה ברמות קריאטינין בפלזמה וחנקן אוריאה בדם בבעלי חיים. יתר על כן, רקמות גסות ובדיקה היסטולוגית חשפו אוטם ודימום בתוך הכליות. מודל חדש זה רלוונטי מבחינה קלינית ועשוי לסייע בהבנה נוספת של AKI בבני אדם.

אסטרטגיות לבחינת מנגנונים תאיים המעורבים במחלות כליות
ציטוקינים יכולים לתרום לפגיעה בכליות ולתיקון⁸. לפיכך, חשוב לזהות את המקור והתפקיד של ציטוקינים בתוך הכליה. Taguchi et al. פיתחו טכניקה להבנת הפרשת חלבון באמצעות ברפלדין A (BFA), מעכב הפרשת חלבון, במודלים של AKI ומחלות כליות כרוניות⁹. הם הזריקו BFA לווריד הזנב של עכברים ולאחר מכן העריכו את הכליות שלהם באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. הם קבעו כי BFA עיכב הפרשת חלבון וגרם להצטברות ציטוקינים בסוגי תאים מסוימים באמצעות סמנים ספציפיים לתא. פרוטוקול חדשני זה יכול לשמש לחקר הפרשת חלבון במספר פתולוגיות כליות.

מנגנון מוצע נוסף שנחשב כתורם למחלות כליות הוא microRNAs (miRNA)¹⁰, הידועים כמפרקים ומעכבים שעתוק mRNA. דווח כי יש מתאם בין ביטוי miRNA ברקמה ובסרום בבני אדם¹¹. עם זאת, אין שיטה לטהר ולכמת הן את כליות העכבר והן את ה-miRNA בסרום. ינאי ועמיתיו אופטימיזציה של שיטת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת כדי להעריך את ביטוי ה-miRNA בכליות ובסרום של עכברים עם ליקוי כלייתי תלוי גיל¹². הם גם קבעו מתאם בין שתי רמות ה-miRNA. פרוטוקול זה הוא בעל תפוקה גבוהה ויכול להיות ישים למצבים פתולוגיים רבים.

טכניקות הדמיה חדשות להערכת מחלת כליות
הדמיה לא פולשנית של הכליה יכולה להעריך פגמים מבניים ותפקודיים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בשיטות הנוכחיות. כדי לעקוף זאת, הולמס ועמיתיו פיתחו טכניקת הדמיה תלת מימדית פשוטה וחסכונית המבוססת על טכנולוגיית אולטרסאונד רובוטית (US) לכימות תפקודי הכליות, הכבד והלב¹³. הפרוטוקול שלהם סיפק תמונות באיכות גבוהה באופן עקבי ויכול לשמש למחקרים שבהם ניתן לעקוב אחר רקמות גולמיות, גדלי גידול או יתרונות הטיפולים. החוזק הגדול ביותר של שיטה זו הוא התפוקה הגבוהה של נתונים. לדוגמה, אפשר לדמות שלוש חולדות בבת אחת, או לדמות 20-30 עכברים בשעה. פרוטוקול זה מהווה אלטרנטיבה מהירה לשיטות הדמיה מסורתיות לא פולשניות.

קבוצת מחקר אחרת באוסף השתמשה בהדמיה כדי לחקור חסימת שופכן חד צדדית (UUO), מודל פגיעה הגורם לגלומרולי פני השטח. וגנר ועמיתיו השתמשו במיקרוסקופ דו-פוטוני תוך-חיוני כדי לנטר UUO בחולדות המפתחות גלומרולי פני השטח וכאלה שאינן מפתחות גלומרולי פני השטח¹⁴. מיקרוסקופיה דו-פוטונית מספקת עומק חדירה מוגבר ובדיקה של אזורים שונים בכליה. המחברים מצאו כי UUO גרם לדלקת ופיברוזיס, וגם הפחית את זרימת כדוריות הדם האדומות בכליות של חולדות. כימות זרימת הדם, התכווצות כלי הדם והתרחבות בתגובה לתרופות ודלקת הם כמה יתרונות ששיטה זו מספקת. באופן קולקטיבי, מחקרים אלה מספקים אסטרטגיות הדמיה חדשות לחקר רקמות שונות.

הערכת ננו-קריסטלוריה כמנבא למחלת כליות
הוצע כי הערכת גבישי שתן יכולה להיות שימושית לחיזוי הסיכון לאבנים בכליות¹⁵. פיתחנו פרוטוקול לכימות ננו-גבישי שתן (≤1 מיקרומטר) ממבוגרים בריאים לפני ואחרי שצרכו עומס אוקסלט תזונתי הידוע כגורם לרמות אוקסלט בשתן¹⁶. בודדנו וניתחנו ננו-גבישי שתן המכילים סידן באמצעות ניתוח מעקב אחר סידן פלואורופור וננו-חלקיקים (NTA). קבענו ש-NTA יכולה לזהות באופן ספציפי ננו-גבישים המכילים סידן בשתן, והתוצאות היו עקביות עם הממצאים הקודמים שלנו¹⁷. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר ננו-גבישי שתן ביוצרי אבנים או בתחומי מחקר שונים שבהם מתרחשות קריסטלופתיות.

גישות טיפוליות לטיפול במחלת כליות
חיקויי miRNA מסונתזים באופן מלאכותי הוצעו כטיפול אפשרי למחלת כליות. עם זאת, RNAase בסרום יכול לפרק miRNA אקסוגני^{מחקה 18}. ינאי ועמיתיו ייצרו וקטורים לא ויראליים המבוססים על פולימר ליניארי, ננו-חלקיקי פוליאתילנימין (PEI-NPs), כדי להעביר בבטחה חיקוי miRNA לכליות של עכברים¹⁸. הם הוכיחו שהחיקוי היה יעיל בביטוי יתר של ה-miRNA הממוקד. המגבלות של שיטה זו כוללות את הכמות המשמעותית של PEI-NPs הנדרשת למודלים גדולים יותר של בעלי חיים וחוסר ספציפיות לכליות. עם זאת, בהתבסס על ההצלחה של חיסוני RNA, חיקוי miRNA יכול להיות אופציה טיפולית אידיאלית למחלות כליות.

הערות לסיכום
המחקר המקיף המוצג כאן מציג מודל וטכניקות חדשים של בעלי חיים לחקר סוגיות נפוצות סביב נפרולוגיה. חשוב לציין שחלק מהשיטות הללו יכולות לחול על תחומים אחרים מחוץ לנפרולוגיה. הצעדים ההגיוניים הבאים יהיו לחקור כיצד ניתן לבחון את השיטות הללו במודלים גדולים יותר של בעלי חיים ובניסויים קליניים. אנו מקווים ששיתוף הפרוטוקולים הללו ירחיב את הידע שלנו על פתופיזיולוגיה של הכליות ויולידת רעיונות חדשים להפחתת מחלת כליות אצל אנשים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים למחברים ולסוקרים על תרומתם לאוסף זה. אנו מכירים גם במימון מה-NIH (DK106284 ו-DK123542) וקרן Oxalosis & Hyperoxaluria - האגודה האמריקאית לנפרולוגיה KidneyCure Transition to Independence Grant.

מקורות

Kovesdy, C. P. Epidemiology of chronic kidney disease: An update 2022. Kidney International Supplements. 12 (1), 7-11 (2022).
Bellomo, R., Kellum, J. A., Ronco, C. Acute kidney injury. Lancet. 380 (9843), 756-766 (2012).
Malek, M., Nematbakhsh, M. Renal ischemia/reperfusion injury; From pathophysiology to treatment. Journal of Renal Injury Prevention. 4 (2), 20-27 (2015).
Saba, H., et al. Manganese porphyrin reduces renal injury and mitochondrial damage during ischemia/reperfusion. Free Radical Biology and Medicine. 42 (10), 1571-1578 (2007).
Mitchell, T., Saba, H., Laakman, J., Parajuli, N., MacMillan-Crow, L. A. Role of mitochondrial-derived oxidants in renal tubular cell cold-storage injury. Free Radical Biology and Medicine. 49 (8), 1273-1282 (2010).
Liu, K. D., Humphreys, B. D., Endre, Z. H. The ten barriers for translation of animal data on AKI to the clinical setting. Intensive Care Medicine. 43 (6), 898-900 (2017).
Doulamis, I. P., et al. A large animal model for acute kidney injury by temporary bilateral renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (168), e62230(2021).
Cantero-Navarro, E., et al. Role of macrophages and related cytokines in kidney disease. Frontiers in Medicine. 8, 688060(2021).
Taguchi, K., Sugahara, S., Elias, B. C., Brooks, C. R. Identification of the source of secreted proteins in the kidney by brefeldin A injection. Journal of Visualized Experiments. (177), e63178(2021).
Wei, Q., Mi, Q. S., Dong, Z. The regulation and function of microRNAs in kidney diseases. IUBMB Life. 65 (7), 602-614 (2013).
Cui, C., Cui, Q. The relationship of human tissue microRNAs with those from body fluids. Scientific Reports. 10, 5644(2020).
Yanai, K., et al. Quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microRNA expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment. Journal of Visualized Experiments. (182), e63258(2022).
Holmes, H. L., et al. Use of 3D robotic ultrasound for in vivo analysis of mouse kidneys. Journal of Visualized Experiments. (174), e62682(2021).
Wagner, M. C., Sandoval, R. M., Campos-Bilderback, S. B., Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to quantify the effects of chronic unilateral ureteral obstruction on glomerular processes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63329(2022).
Daudon, M., Hennequin, C., Boujelben, G., Lacour, B., Jungers, P. Serial crystalluria determination and the risk of recurrence in calcium stone formers. Kidney International. 67 (5), 1934-1943 (2005).
Kumar, P., Bell, A., Mitchell, T. Estimation of urinary nanocrystals in humans using calcium fluorophore labeling and nanoparticle tracking analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e62192(2021).
Kumar, P., et al. Dietary oxalate loading impacts monocyte metabolism and inflammatory signaling in humans. Frontiers in Immunology. 12, 617508(2021).
Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Morishita, Y. Delivery of exogenous artificially synthesized miRNA mimic to the kidney using polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. Journal of Visualized Experiments. (183), e63302(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Urinary Nanocrystals Calcium Fluorophore Labeling Nanoparticle Tracking Analysis Acute Kidney Injury Renal Artery Occlusion Secreted Proteins Brefeldin A Injection MicroRNA Expression Renal Impairment 3D Robotic Ultrasound Exogenous MiRNA Mimic Polyethylenimine Nanoparticles Chronic Unilateral Ureteral Obstruction 2 photon Microscopy