כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.
מאמר שיטה
אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המחקר של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים, דינמיקה וויסות בתאים חיים השתנה באופן עמוק עם הופעתן של טכניקות המאפשרות תיוג של גנים אנדוגניים לייצר חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לדמיין את התנהגות החלבונים בזמן אמת, ומספקות תובנות חשובות לגבי תפקודיהם ואינטראקציות שלהם בסביבה התאית. מחקרים רבים כיום על תיוג גנים משתמשים בתהליך דו-שלבי שבו סמנים נראים לעין, כגון שינויים בצבע העיניים, משמשים לזיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית בשלב הראשון, והסמן הנראה נכרת בשלב השני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חד שלבי לביצוע תיוג גנים אנדוגני מדויק ומהיר ב - Drosophila melanogaster, המאפשר סריקה לקווים מהונדסים ללא סמן העין הנראה, ומציע יתרון משמעותי על פני שיטות קודמות. כדי לסנן אירועי תיוג גנים מוצלחים, אנו משתמשים בטכניקה מבוססת PCR כדי לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים על ידי ניתוח מקטע קטן מהרגל האמצעית שלהם. זבובים שעוברים את קריטריוני הסינון משמשים לאחר מכן לייצור מלאי יציב. כאן, אנו מפרטים את התכנון והבנייה של פלסמידים לעריכת CRISPR ושיטות לסינון ואישור של קווים מהונדסים. יחד, פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את יעילות תיוג הגנים האנדוגניים בדרוזופילה ומאפשר מחקרים של תהליכים תאיים in vivo.
מבוא
חלבונים פלואורסצנטיים התגלו ככלים רבי עוצמה להדמיית לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ואינטראקציות חלבון-חלבון בתאים בתוך אורגניזמים חיים 1,2. תיוג גנים אנדוגניים בחלבונים פלואורסצנטיים מאפשר הדמיה חיה ארוכת טווח של תהליכים תאיים ברזולוציה תת-תאית. יתר על כן, לטכניקות תיוג גנים אנדוגניות אלה יש מספר יתרונות בהשוואה לגישות ביטוי יתר וצביעת חיסון. לדוגמה, ביטוי יתר של חלבונים עלול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, אינטראקציות חלבון-חלבון לא ספציפיות וחוסר לוקליזציה3. עד כה, חוקרים הצליחו ליצור ספריות עצומות של גנים אנדוגניים המאוחים לחלבונים פלואורסצנטיים עבור כמה אורגניזמים לדוגמה, כגון שמרים ניצנים, אשר יכולים לעבור רקומבינציה הומולוגית יעילה4. במקרה של Drosophila melanogaster, כלים שונים כגון MiMICs5, מלכודות משפר מבוסס טרנספוזון6, ו fosmids7 פותחו כדי לתייג גנים פלואורסצנטית.
פיתוח כלים מבוססי CRISPR-Cas9 איפשר לבצע ביעילות עריכת גנום, כולל תיוג חלבונים אנדוגניים, במגוון רחב של אורגניזם מודל 8,9. Cas9 הוא אנזים מונחה רנ"א אשר חותך דנ"א דו-גדילי באופן יעיל וספציפיביותר 8, אשר לאחר מכן ניתן לתקן על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ) המוביל למוטציות נקודתיות או מחיקות. לחלופין, מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מאפשר שילוב של DNA הטרולוגי לתוך הכרומוזום.
שיטות קודמות לתיוג גנים מבוססי קריספר באורגניזם המודל, Drosophila melanogaster, הסתמכו על תהליך דו-שלבי 10,11,12. זה כרוך בשימוש בסמן צבע עיניים מובחן, Dsred, כדי לזהות אירועי HDR מוצלחים. לאחר מכן, סמן Dsred יוסר באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre/loxP. כדי לייעל ולזרז את התהליך, אנו מציגים כאן שיטה פשוטה ויעילה יותר. גישה זו עוקפת את הצורך בגנוטיפ קטלני ומאפשרת סריקה ישירה של זבובים בודדים. באופן ספציפי, אנו משתמשים בגישה מבוססת PCR כדי לחלץ דנ"א מקטע קטן של הרגל האמצעית של הזבוב, מה שמאפשר לנו לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים. יש לציין כי הליך זה אינו פוגע בחיוניות, בתנועה או ביכולות הרבייה של הזבוב שנדגם. רק האנשים המתאימים, המזוהים בשיטה זו, מתפתחים עוד יותר למניות יציבות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת חלבון פלואורסצנטי מתויג זבובים שבו גנים אנדוגניים מסומנים עם כתבים פלואורסצנטיים. טכניקה זו משתמשת בעריכת גנום CRISPR-Cas9 כדי להתיך כל תג פלואורופור רצוי למסוף N או C של גן אנדוגני. להלן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של פלסמידים gRNA ופלסמיד תורם, אסטרטגיית סינון בצעד אחד לבחירת זבובים חיוביים לקריספר, וצעדים ליצירת קווים יציבים. באופן ספציפי, אנו מתארים אסטרטגיות לתיוג שעון ליבה אנדוגני גן דרוזופילה , נקודה, עם פלואורופור במסוף C. אנו גם מתארים בקצרה את ניסויי הבקרה שיש לבצע כדי לאשר שהחלבון המתויג הוא פונקציונלי וטכניקות הדמיה חיה כדי לדמיין את חלבון המחזור בנוירונים של שעון חי בתוך מוחות דרוזופילה שלמים13. הפרוטוקול המתואר כאן חל באופן נרחב גם על מועמדים לסינון מחיקות והחדרות של פיסות DNA ספציפיות על ידי עריכת גנום CRISPR-Cas9.
פרוטוקול
1. תכנון ובנייה של ריאגנטים לעריכת גנים
הערה: כדי לבצע תיוג אנדוגני, חיוני לזהות את האיזופורמים השונים של הגן הרצוי. בהתאם למטרות הספציפיות של הניסוי, ניתן לשלב תג פלואורסצנטי באופן פנימי או במסוף N או C של איזופורמ(י) החלבון שנבחר. לעריכה אופטימלית בתיווך CRISPR, חיוני למקם את שני ה-sgRNA קרוב כראוי לאתר ה-knock-in המיועד. לאחר מכן, כדי לאפשר עריכה באמצעות רקומבינציה הומולוגית, יש להכין וקטור תורם הכולל רצפים הומולוגיים לגן המטרה, יחד עם התג הפלואורסצנטי. להלן מדריך שלב אחר שלב לתהליכים האלה (איור 1).
- תכנון sgRNA כמתואר להלן.
- עיצוב sgRNA עבור Drosophila באמצעות אתרי אינטרנט אלה: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ או http://www.flyrnai.org/crispr2/.
- עבור אתר flycrispr, הזן את הרצף ±100 bp המקיף את מיקום הדפיקה הרצוי (מסוף N, מסוף C, או כל מוקד גנומי מעניין). אם אתה משתמש ב- nos-Cas9 attP2 כרקע להזרקה, בחר באפשרות הגנום Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). מערכת Nos-Cas9 מבטיחה ביטוי Cas9 ספציפי לקו הנבט.
- כדי לשפר את יעילות ביטוי ה-sgRNA, בחרו באפשרות מטרות CRISPR עם 5' G , מכיוון ש-sgRNA שמתחיל בגואנין ישפר את פעילות העריכה. לאחר מכן, לחץ על הלחצן Find CRISPR Targets . תוצג רשימה של רצפי sgRNA אפשריים.
- עבור כל רצף, לחץ על הלחצן Evaluat . פעולה זו בודקת אם יש מטרות פוטנציאליות עבור כל רצף בהתבסס על הגנום שנבחר קודם לכן. מהרשימה המוצגת, בחר 2 sgRNA שיש להם 0 מטרות off. ודא ש-sgRNA אחד נמצא במעלה הזרם והשני נמצא במורד הזרם ביחס למיקום הדפיקה. באופן אידיאלי, המיקומים שלהם צריכים להיות קרובים ככל האפשר לאתר הנוק-אין (<200 bp), אולם אסור שהם יחפפו זה לזה (איור 2).
הערה: לפעמים קשה למצוא sgRNA מתאים לגן מטרה נתון. ניתן להגדיל את הפער בין sgRNA לבין מיקום הדפיקה ל-± 200 bp. שימוש ב-sgRNA שאינו מופעל עם G עשוי להפחית מעט את שיעור החיוביים.
- בצע בחירת תג פלואורסצנטי כמתואר להלן.
- תגי פלורסנט מציעים מגוון רחב של מאפיינים, שלכל אחד מהם יתרונות וחסרונות ייחודיים 1,2. בעת קביעת התג הפלואורסצנטי האידיאלי לסימון חלבון מסוים, שים לב לשיקולים המרכזיים המתוארים בשלבים הבאים שנכנסים לפעולה.
- בהתחשב בכך שרמות ביטוי החלבון הטבעיות הן בדרך כלל נמוכות בהרבה מאלה שנצפו בניסויי ביטוי יתר 1,2, התחל עם התגים שהם בהירים וניתנים לצילום ושמתאימים למערך הניסוי. תגים פלואורסצנטיים מסוימים, במיוחד RFPs מסוימים כמו tdTomato ו- DsRed, נוטים ליצור multimers14 ועלולים להוביל לצבירת חלבונים.
- לקבלת רב-תכליתיות משופרת, קשר תגי אפיטופ (לדוגמה, FLAG או V5) לסמן הפלואורסצנטי באמצעות מקשר גמיש, המאפשר ניתוחים ביוכימיים כגון Western Blot או Co-Immunoprecipitation.
- לעיצוב מקשר, בצע את השלבים המתוארים להלן.
- לקבלת פונקציונליות מיטבית, ודא שגם החלבון האנדוגני המעניין וגם התג הפלואורסצנטי מתקפלים בנפרד לצורותיהם הפונקציונליות. כדי להשיג זאת, השתמש בפפטיד מקשר באורך של 2-20 חומצות אמינו. לדוגמה, מקמו שתי שאריות גליצין בין חומצת האמינו האחרונה של חלבון המחזור לבין חומצת האמינו הראשונה של החלבון הפלואורסצנטי mNeonGreen.
- ודא שרצפי פפטידי קישור אלה מורכבים מחומצות אמינו כמו גליצין וסרין, המקנות גמישות למבנה15. זה מבטיח כי ההתנהגות הטבעית והמיקום של החלבון האנדוגני להישאר ללא שינוי.
- עיצוב וקטור תורם כמתואר להלן.
הערה: וקטור התורם מציג את התג הפלואורסצנטי למיקום האנדוגני הרצוי באמצעות תהליך של תיקון מכוון הומולוגיה, אשר מופעל על ידי מחשוף CRISPR. ככזה, מלבד התג הפלואורסצנטי, וקטור התורם חייב להיות בעל רצפים הומולוגיים משני צידי התג.- התחל את תכנון וקטור התורם על ידי ארגון רצף ה- DNA של הפפטיד המקשר והתג הפלואורסצנטי וודא שיש רצפים הומולוגיים משני הקצוות (זרועות הומולוגיה). לקבלת תוצאות מיטביות, ודאו שזרועות ההומולוגיה כוללות לפחות 800 נוקלאוטידים בכל צד של אתר הדפיקה המיועד (איור 2).
הערה: דיווחים אחרונים מצביעים על כך שזרועות הומולוגיה יכולות להיות קצרות יותר (100-200 bp)16. - ודא שכל רצפי PAM בתוך פלסמיד התורם משתנים באופן כזה שרצף חומצות האמינו של החלבון המתקבל יישאר ללא שינוי. אם רצף PAM ממוקם ב- UTR, הסר אותו לחלוטין.
- המיקום של קודון START ו- STOP תלוי במיקום התג. לתיוג פנימי, ודא שהתג הפלואורסצנטי נמצא במסגרת עם רצף הקידוד של גן היעד. לתיוג N-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון ההתחלה האנדוגני. לתיוג C-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון העצירה הטבעי והקפד לשמור על קודון התחלה אחד בלבד כדי למנוע בעיות תרגום פוטנציאליות.
- התחל את תכנון וקטור התורם על ידי ארגון רצף ה- DNA של הפפטיד המקשר והתג הפלואורסצנטי וודא שיש רצפים הומולוגיים משני הקצוות (זרועות הומולוגיה). לקבלת תוצאות מיטביות, ודאו שזרועות ההומולוגיה כוללות לפחות 800 נוקלאוטידים בכל צד של אתר הדפיקה המיועד (איור 2).
- לסנתז sgRNA ופלסמידים תורמים כמתואר להלן.
- ליצירת פלסמיד sgRNA, עקוב אחר הנחיות שיבוט U6-gRNA, שניתן למצוא flycrispr.org/protocols/grna/. השתמש בגישת השיבוט החלופית המבוססת על אנזים הגבלה (המכונה אסטרטגיה C במשאב שסופק) כדי להכניס רצף gRNA לפלסמיד pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).
- שינוי צורה ב-DH5a E. coli (NEB, C2987H) בהתאם לפרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים שסופקו על ידי היצרן. לצורך אימות, בצע ריצוף Sanger על השיבוטים המתקבלים באמצעות פריימרים סטנדרטיים לריצוף T3 או T7.
- ליצירת פלסמיד תורם, רכשו DNA דו-גדילי עם רצף התורם הרצוי מספקים מסחריים (למשל, IDT). שלב אותו באתר השיבוט המרובה pBlueScriptII SK(-). רצף את פלסמיד התורם כדי להבטיח שרצפי sgRNA או PAM משתנים כראוי ואין SNPs נוכחים בפלסמיד.
הערה: חלופה לשילוב באמצעות pBlueScriptII היא PCR את זרועות ההומולוגיה ואת קטעי התג הפלואורסצנטי בנפרד ולאחד אותם לתוך עמוד השדרה באמצעות טכניקות כמו Golden Gate Assembly או Gibson Assembly.
- השתמש בסכימת ההזרקה והחצייה הבאה.
- כדי לרכוש זבובים ערוכים על ידי נבט, הזריקו במשותף פלסמידים של gRNA ואת פלסמיד התורם לרקע המתאים של Cas9 (למשל, nos-Cas9 III, BDSC 78782). אם אתה משתמש בשירותי הזרקה מסחריים, עקוב אחר הוראות הספק לביצוע הכנת פלסמיד.
הערה: בדרך כלל, ריכוז פלסמיד gRNA צריך לעלות על 0.5 מיקרוגרם/μL, וריכוז פלסמיד התורם צריך להיות מעל 1.0 מיקרוגרם/μL. ציר זמן נפוץ משליחת דגימות פלסמיד לקבלת עוברים מוזרקים הוא כשבועיים. כאן מוצגת אסטרטגיה לסינון אירועי עריכת גנים בכרומוזום X באמצעות זן מאזן FM7/L. עבור גנים בכרומוזום השני או השלישי, השתמש בזני האיזון המתאימים. - לאיסוף זבובים מוזרקים (G0), מרדימים בפחמן דו חמצני ומפרידים בין זבובים זכרים לנקבות בתולות. קבע צלבי זבובים על ידי זיווג כל זכר G0 עם לפחות שתי נקבות בתוליות FM7/L בבקבוקוני מזון CT צרים בודדים. הניחו בקבוקונים מוצלבים באינקובטור מאוורר הנשמר בטמפרטורה של 25°C ו~60% לחות עד שזבובי F1 ייסגרו (FM7/L הוא מאזן כרומוזום X הנפוץ ביותר). באופן דומה, זיווג כל נקבת G0 עם זבובים זכרי FM7/Y.
- להרדים ולאסוף לפחות 10 צאצאים נקבות בתולות (F1) הן מצלב זכר G0 והן מצלב נקבה. מצלבי נקבות G0 אספו לפחות 10 זבובי F1 זכרים (איור 3A). ודא שכל זבוב F1 מתויג עם פרטי ההורות שלו ומאוחסן בנפרד. המשך לשלב ההקרנה.
- כדי לרכוש זבובים ערוכים על ידי נבט, הזריקו במשותף פלסמידים של gRNA ואת פלסמיד התורם לרקע המתאים של Cas9 (למשל, nos-Cas9 III, BDSC 78782). אם אתה משתמש בשירותי הזרקה מסחריים, עקוב אחר הוראות הספק לביצוע הכנת פלסמיד.
- השתמש בפרוטוקול PCR הבא על רגל אחת.
- יצירת פריימר: עיצוב זוג פריימר המקיף את אתר העריכה של גן המטרה. באופן אידיאלי, טמפרטורות ההתכה של הפריימרים צריכות להיות דומות, סביב 55 מעלות צלזיוס.
- הכנת חיץ ליזיס: הכינו 10 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לכל דגימת זבוב. החיץ מורכב מ 10 mM Tris (pH 8.2), 1 mM EDTA (pH 8.0), 25 mM NaCl, ו 400 מיקרוגרם / מ"ל פרוטאינאז K. להכין את חיץ ליזיס כמו תערובת אב, ולאחר מכן להפיץ 10 μL לתוך כל באר של צלחת PCR 96 באר. ודאו שהחיץ נשאר קר לאורך כל תהליך נתיחת הרגל (איור 3B).
- התקנת צינורות: הכינו צינורות נימי זכוכית, מלאו קצה אחד במזון סוכרוז-אגר (2% אגר ו-4% סוכרוז), והניחו אותם בצלחת בעלת 96 בארות עמוקות, שתיקרא מלון הזבובים (איור 3C).
- דיסקציה של הרגל: הניחו את כרית ההרדמה של פחמן דו חמצני מתחת למיקרוסקופ סטריאו, הרדימו זבוב מועמד אחד וקטעו את אחת הרגליים האמצעיות. הכניסו את הרגל למאגר הליזיס, והבטיחו טבילה מלאה. אין צורך לשרטט את הרגל, אלא להמשיך ישירות לשלב פרוטוקול הליזיס (איור 3B). אחזו בכנף הזבוב בעזרת זוג מלקחיים עדינים ממתכת, העבירו את הזבוב למלון הזבובים ואטמו מיד את הצינור בחוט.
- דגימות בקרה: שני זבובי בר עשויים לשמש כבקרות שליליות לאחר אותו הליך דיסקציה של הרגל. פלסמיד תורם מדולל משמש כבקרה חיובית.
- טיפול לאחר נתיחה: שכן את מלון הזבובים באינקובטור מאוורר המתוחזק ב 25 ° C ו ~ 60% לחות. בעוד שזבובים יכולים לשרוד לילה, מומלץ להשלים את השלבים הבאים ואת ההזדווגות באותו היום.
- פרוטוקול ליזיס: הניחו את הרגליים הכרותות בתמיסת חיץ הליזיס בתרמוסייקלר שנקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולבסוף הוחזק ב -4 מעלות צלזיוס. זה יחלץ מספיק דנ"א מהרגל היחידה של כל זבוב (איור 3B).
- תגובת PCR: ארגן את תגובת ה-PCR לפי הוראות היצרן, תוך שימוש ב-1.5 μL של הליזט של רגל הזבוב כמקור ה-DNA.
- אלקטרופורזה בג'ל: יש להכפיף את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. לפרש את התוצאות מהג'ל בהתבסס על גודל הרצועה. בדרך כלל, זבובי בקרה שליליים יציגו פס נמוך יותר, ובקרות פלסמיד חיוביות יציגו פס גבוה יותר. ודא שגדלי הרצועה הספציפיים תואמים את עיצוב הפלסמיד המקורי של התורם. נקבות זבובים חיוביים יציגו שתי להקות כיוון שהן הטרוזיגוטיות, וזכרים חיוביים יציגו רצועה אחת (איור 3B).
הערה: בדרך כלל, הקרנה של 70 זבובים ניתנת להשגה ביום אחד. הקפידו לזהות לפחות 10 זבובי F1 חיוביים על פני 4 עד 5 צלבי G0 שונים, מכיוון שמטוסי F1 מסוימים עשויים להיות סטריליים עקב מוטציות מחוץ למטרה.
- בצע את ההגדרה הצולבת הבאה לאחר PCR.
- בהתבסס על תוצאות הג'ל, בחרו את הזבובים החיוביים ממלון הזבובים והצליבו אותם בנפרד עם זבובי איזון (FM7/L לתיוג גנים של כרומוזום X) כדי לייצר את דור F2. ברגע שדור ה-F2 מגיח, הקימו צלבי אחים כדי ליצור מלאי הומוזיגוטי יציב (איור 3D).
- השתמש במניות הומוזיגוטיות לריצוף Sanger של אתר העריכה כדי להבטיח דיוק. הצלבה אחורית של קווי זבובים מאומתים עם זבובי בר כדי להסיר מוטציות רקע. סנן כל דור באמצעות פרוטוקול PCR על רגל אחת.
תוצאות
בניסויים שלנו, מצאנו בדרך כלל שיעור הצלחה של ~20%-30% בבדיקות סקר לגנים מתויגים אנדוגניים שונים על כל הכרומוזומים (X, II, III). יעילותו של תהליך זה יכולה להשתנות בהתאם למספר גורמים, כגון בחירת gRNA, אופי הגן ואיכות ההזרקה. כאן, אנו ממחישים את התוצאות מהאסטרטגיה שלנו לתייג את גן התקופה האנדוגנית עם mNeonGreen fluorophore13. גן המחזור , הממוקם על כרומוזום X של D. melanogaster, ממלא תפקיד מרכזי בשעון הצירקדי. דרוזופילה יש רשת שעון מאופיינת היטב המורכבת כ 150 נוירוני שעון המבטאים חלבוני שעון17.
תייגנו את חלבון המחזור עם החלבון הפלואורסצנטי הירוק mNeonGreen בקצה C-terminal שלו, המחובר על ידי מקשר גליצין כפול13. לאחר הזרקת פלסמיד, חצינו את זבובי ה-G0 עם מאזן FM7/L ולאחר מכן קצרנו את דור ה-F1. מתוך 126 זבובי F1 שנבדקו באמצעות פריימרים מיוחדים ל-PCR (טבלה 1), זיהינו 47 מקרים חיוביים, שהניבו שיעור הצלחה של 37.3%. מתוכם, בחרנו 5 אנשים בפורמולה 1 כדי להקים הצלבות נוספות כדי לייצר מלאי יציב. המגדר לא השפיע על שיעור התוצאות החיוביות במהלך בדיקה זו. לאחר אימות דיוק הרצף של הגן המתויג, ביצענו בדיקות בקרה, כולל הערכות התנהגותיות והערכות qPCR כדי להבטיח תנודות mRNA כדי לאשר את הפונקציונליות של החלבון המתויג (PERIOD-mNeonGreen)13.
כדי לבצע ניסויי הדמיה חיים, חצינו את זבובי PERIOD-mNeonGreen האלה עם Clock856-GAL4; זבובי UAS-CD4-tdTomato , כאשר Clock856-GAL4 מסמן את כל נוירוני השעון19 ו- CD4 הוא חלבון טרנסממברנה המסמן את קרום התא. עבור ניסויי הדמיה חיה, ניתחנו 3-4 מוחות בוגרים באמצעות מדיום דרוזופילה קר כקרח של שניידר. המוחות הותקנו וצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של Airyscan. איור 4 מראה את התמונות המייצגות המציגות את חלבון PERIOD בתוך נוירוני שעון במוחות דרוזופילה .
איור 1: סכמה של פרוטוקול עריכת גנים מבוסס CRISPR/Cas9. הפרוטוקול מתאר סדרה של צעדים לתכנון והרכבה של sgRNA ופלסמידים תורמים, ולאחר מכן סינון בשיטת PCR על רגל אחת וייצור קווים מהונדסים יציבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמה של עריכת גנום CRISPR/Cas9 ליצירת זבובים נקודתיים-mNeonGreen. (A) סכימה הממחישה הוספה של תג חלבון פלואורסצנטי למסוף C של גן אנדוגני. (B) הגן של התקופה האנדוגנית (per) מתויג עם mNeonGreen, חלבון פלואורסצנטי ירוק בהיר ומונומרי במסוף הקרבוקסיל. שני sgRNA נמצאים באקסון האחרון וב-3'UTR, בהתאמה. וקטור התורם מכיל שני רצפי הומולוגיה ~1 kb הצמודים לתג mNeonGreen. Stop codon מתווסף לסוף התג לסיום תרגום תקין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אסטרטגיה לסינון זבובים חיוביים לקריספר. (A) גישה להגדרת הצלבות גנטיות טרום סינון עבור גנים המיועדים לתיוג CRISPR על כרומוזומי X ו-II. G0 מציין את הזבובים המוזרקים בתחילה, בעוד F1 מייצג את צאצאיהם מהדור הראשון הדורשים בדיקה. (B) שיטת בדיקת PCR על רגל אחת ומשך הזמן לכל שלב בהליך מתוארים. (C) מוצגת כאן תמונה של מלון Fly. צינורות זכוכית מלאים במזון זבובים ואטומים בקצה אחד. זבובים בודדים נטענים לתוך צינורות בודדים. לאחר בדיקת הדנ"א המופק מהנורית האמצעית של זבובים בודדים, נלקחים הזבובים המתאימים ממלון הזבובים ונוצרים הקווים היציבים. (D) גישה להגדרת צלבים של זבובים לאחר הסינון (מוצגים כאן בכחול) שעברו את מבחן הסינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של חלבון PERIOD-mNeonGreen בנוירוני שעון. תמונות מייצגות מזבובי תקופת-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato מאומנים למחזורי אור-חושך. ZT מתייחס לזמן Zeitgeber ו-ZT0 מתייחס לזמן הדלקת האורות ו-ZT12 מתייחס לזמן כיבוי האורות. המעטפת הגרעינית של נוירון השעון מסומנת ב-tdTomato, מוצגת כאן באדום, וחלבון PERIOD מסומן ב-mNeonGreen ומוצג בירוק. חלבון PERIOD מאורגן במוקדים גרעיניים נפרדים לאורך שעות הלילה המאוחרות ושעות הבוקר המוקדמות. פסי קנה מידה, 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | רצף DNA (5' עד 3') |
| פריימר לסינון תקופתי קדימה | ATACTCGTCCATAGACCACG |
| פריימר להקרנת מחזור הפוך | ACATTATCCTCGGCTTGCAT |
| לכל gRNA1-sense | cttcACCAGACACAGCACGGGGAT |
| פר-gRNA1-אנטיסנס | aaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT |
| לכל gRNA2-sense | cttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG |
| per-gRNA2-antisense | aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC |
| זרועות הומולוגיה תקופתית ותוספת mNeonGreen | GAATTCCAAGCTGCTCCTGCCCATTGTCAGCAA GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGACAACAAGGAGC GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT ACAGAGTCTGTGGGCCAATTCCCTACGACGAGTT CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTTTCGATAT TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTACTTGTTCGGA TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGTGAT TCGAAGAActtgaagggaatggaagggggagttaggaataggaactggtgg gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTCCA GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTGTGCTGCTCGGATCATC CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTACAGTTCGT CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAGTAG CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTGTTCGCGCT GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC CATTTGAAAGTGGAAATAATAGTCTTATCATTGGGGTAG GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGTCAGCGGCAGTGAGC GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATGGCTACCT TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAGAT CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTCCGACCATATC GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC TTCACCCTTCGACACCTCCGCCGTCGCCGTGCTCT GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC TCTCAGATGTGCTCTctgcaaaagaacggaaatggatta cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTGTCCGGCGGACTCTC CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGGGGTCG GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA GGAGTCCGGCACCTCTCTTGCAGGGATCGGATA CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA TGCGCTCTGCGAGGAGGGACGCTGCACCTGGGC AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta tggagttggttggtaagacagttcggtgaggcaccaccggccactg acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT GGCCGTGGCCGCGGCCGCCGCCGGGTGTGTGTAG AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCCGCGGCA GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGC CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGGGGGGGA TGTAGTAGAAGGTCGGGAGGGGCCGGGGGGAGGA GAAGCTGCTGGGCCATGGCCGTGTGCGTGGGGAG TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA |
טבלה 1: רשימה של רצפי sgRNA לתיוג גן תקופתי אנדוגני במסוף C ופריימרים המשמשים לביצוע בדיקת PCR על רגל אחת.
דיון
התוצאות מדגימות אסטרטגיה יעילה ופשוטה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה. בפרוטוקול, אנו משתמשים בשני gRNA כדי לגרום לשבירת DNA דו-גדילי ורקומבינציה הומולוגית בצורה יעילה יותר. ה-gRNA והפלסמיד התורם מוזרקים לעוברים של זבובי פירות, המבטאים את האנזים Cas9 בקו הנבט שלהם. עוברים אלה מעובדים לאחר מכן בתנאים סטנדרטיים עד לבגרותם, ואז הם מוצלבים עם זבובי איזון כדי לייצר צאצאים מהדור הראשון (F1). גנוטיפ PCR מבוצע על הרגל האמצעית של כל דגימת F1 כדי לסנן זבובים מהונדסים גנטית. שיטה זו מעניקה יתרון משמעותי על פני שיטות הסינון הקיימות כיום המשתמשות בשני שלבי סינון, כאשר השלב הראשון מסתמך על שימוש בסמן גלוי כגון צבע עיניים לזיהוי הגנוטיפ המתאים והשלב השני כולל הסרת סמן צבע העיניים10. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת ב- PCR על דנ"א המופק מקטע קטן של הרגל האמצעית של זבוב בודד המאפשרת גנוטיפ לא קטלני של זבובים בודדים, ומציעה חלופה יעילה וחסכונית יותר לשיטות הקיימות. שיטה זו מאפשרת סינון של בעלי חיים מועמדים בזה אחר זה או בקבוצות עד לבידוד הגנוטיפ המתאים. מספר בעלי החיים שנבדקו לפני בידוד המלאי המתאים משתנה מניסוי לניסוי, בהתאם לגורמים רבים, כולל יעילות sgRNA שנבחר, יעילות ההזרקה, החדרות מחוץ למטרה שיכולות להשפיע על הכדאיות. לחלופין, דנ"א מכנפיים בודדות של זבובים בודדים יכול לשמש גם למטרות גנוטיפ18.
ייתכן שהוספת תג למסוף N או C של גן יכולה להשפיע לרעה על תפקוד הגן, מה שעלול להשפיע על יכולת הקיום של הזבובים. אם קיים מידע זמין על מבנה החלבון, ניתן להשתמש בו כדי לקבוע אם תיוג N או C-terminal עשוי לשמר טוב יותר את התפקוד ואת הלוקליזציה של החלבון הטבעי. מומלץ תמיד לבצע ניסויי בקרה, כולל בדיקה אם החלבון המתויג מראה דפוס לוקליזציה דומה לחלבון wildtype בשיטות צביעת נוגדנים. ניתן להשתמש באותה אסטרטגיית סינון כדי לסנן סוגים אחרים של החדרות או מחיקות גנטיות מבוססות קריספר. לסיכום, אסטרטגיית הסינון החד-שלבית מקלה מאוד על יצירת זבובים ערוכים בקריספר ופותחת אפשרויות רבות לחקר הלוקליזציה והדינמיקה התת-תאית של גנים אנדוגניים בהקשר הטבעי שלהם.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים לג'ורג' ווטאס וג'וזי קלוני על הדיונים בשלבים הראשונים של פיתוח הפרוטוקול. העבודה נתמכה על ידי קרנות מה-NIH (מענק מס' R35GM133737 ל-S.Y.), מלגת אלפרד פ. סלואן (ל-S. Y.) ו-McKnight Scholar Award (ל-S. Y).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli ( יעילות גבוהה) | NEB | C2987H | |
| צלחת באר עמוקה 96 בארות | ברנד 701354 | ||
| אגר | פישר סיינטיפיק | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-סוכרוז | פישר סיינטיפיק | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| חומצה הידרוכלורית | פישר מדעי | A142-212 | |
| להאריך זכוכית אנטי-דהייה הרכבה בינונית | Invitrogen | P36982 | |
| פרוטאינאז K | QIAGEN | 19131 | |
| שניידר Drosophila בינוני | Gibco | 21720001 | |
| נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | S271-500 | |
| T4 DNA ליגאז | NEB | M0202S | |
| טריס בסיס | פישר סיינטיפיק | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
מקורות
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068(2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539(2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077(2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה