ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

Summary

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

Abstract

טכנולוגיית הדמיה מרובת משתתפים באמצעות ברקוד נוגדנים עם אוליגונוקלאוטידים, המזהה ברצף אפיטופים מרובים באותו חתך רקמה, היא מתודולוגיה יעילה להערכת הגידול המשפרת את הבנת המיקרו-סביבה של הגידול. ההדמיה של ביטוי חלבונים ברקמות קבועות פורמלין, משובצות פרפין מושגת כאשר פלואורופור מסוים מחושל לברקוד הקשור לנוגדנים באמצעות אוליגונוקלאוטידים משלימים ולאחר מכן מבוצעת הדמיית דגימה; ואכן, שיטה זו מאפשרת שימוש בפאנלים הניתנים להתאמה אישית של יותר מ -40 נוגדנים בתגובת צביעה רקמה אחת. שיטה זו תואמת לרקמות קפואות טריות, רקמה קבועה פורמלין, משובצת פרפין, תאים בתרבית ותאי דם מונוגרעיניים היקפיים, כלומר חוקרים יכולים להשתמש בטכנולוגיה זו כדי להציג מגוון סוגי דגימות ברזולוציה של תא יחיד. שיטה זו מתחילה בפרוטוקול צביעה ותיקון ידני, וכל ברקודי הנוגדנים מיושמים באמצעות קוקטייל נוגדנים. מכשיר הפלואורופולוגיה המכתימה הוא אוטומטי לחלוטין ומבצע מחזורים איטרטיביים של תיוג, הדמיה והסרה של פלואורופורים מובחנים ספקטרלית עד שכל הסמנים הביולוגיים צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. לאחר מכן התמונות נאספות ומורכבות על פני כל מחזורי ההדמיה כדי להשיג רזולוציה של תא בודד עבור כל הסמנים. הצביעה בצעד אחד והסרת פלואורופור עדינה לא רק מאפשרים ניתוח סמנים ביולוגיים מרובים מאוד, אלא גם משמרים את הדגימה לניתוח נוסף במורד הזרם במידת הצורך (למשל, המטוקסילין וצביעת אאוזין). יתר על כן, תוכנת ניתוח התמונה מאפשרת עיבוד תמונה - פיצוי סחף, חיסור רקע, פילוח תאים ואשכולות - כמו גם ויזואליזציה וניתוח של התמונות ופנוטיפים התא ליצירת מפות רשת מרחבית. לסיכום, טכנולוגיה זו משתמשת במערכת מיקרופלואידיקה ממוחשבת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבצע הכלאה איטרטיבית, תמונה והסרה של בדיקות DNA המסומנות באופן פלואורסצנטי המשלימות נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים הקשורים לרקמות.

Introduction

המיקרו-סביבה של הגידול (TME) היא הטרוגנית ביותר, ומורכבת מתאי גידול, תאי סטרומה סרטניים, תאים חיסוניים, רכיבים לא-תאיים של המטריצה החוץ תאית, ומולקולות רבות המיוצרות ומשוחררות על ידי תאי גידול, סטרומה ומערכת החיסון ^1,2. ראיות מצטברות מראות כי ל- TME יש תפקיד מרכזי בתכנות מחדש של התמיינות גידולים, גדילה, פלישה, גרורות ותגובה לטיפולים³.

הבנת האופן שבו סוגי תאים שונים ב-TME מתקשרים ומתקשרים זה עם זה באמצעות רשתות איתות חיונית לשיפור אבחון סרטן, אופטימיזציה של אימונותרפיה ופיתוח טיפולים חדשים⁴. טכניקות מסורתיות של מיקרוסקופ רקמות, כולל אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואימונופלואורסנציה (IF), שימשו במשך עשרות שנים לחקר סוגי התאים, השפע והתקשורת בדגימות גידול. למרבה הצער, טכניקות אלה בדרך כלל יכולות להעריך רק סמן חלבון אחד או שניים במקטע רקמה ואינן יכולות לחשוף את היחסים המרחביים והמבניים המורכבים בין תאים אלה ^5,8,7.

במהלך שני העשורים האחרונים הוקמו מספר טכנולוגיות הדמיה מרובות⁸. טכנולוגיות אלה מספקות תצוגות משופרות בהרבה של הרכב, תפקוד ומיקום של תאי מערכת החיסון בתוך ה-TME, מה שמוביל להתקדמות מהירה ביכולת לזהות וליצור פרופיל מרחבי של TMEs מורכבים ברמת התא הבודד ^9,10. היחסים המרחביים והמבניים של תאים סרטניים וחיסוניים שונים ב-TME נמצאים כיום בחזית המחקרים הביולוגיים והקליניים המשתמשים בטכנולוגיות הדמיה מרובות אלה^11,12.

טכנולוגיית ההדמיה המרובבת שפותחה לאחרונה באמצעות ברקוד נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים היא פלטפורמת מחקר ביולוגית משפיעה של תא בודד המבוססת על זיהוי נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים בדגימות^13,14 מקובעות פורמלין^, משובצות פרפין (FFPE). כיום, טכנולוגיית הדמיה מרובת משתתפים זו מאפשרת הדמיה בו זמנית של יותר מ -100 סמנים בקטע רקמה אחד¹⁵, אשר הגדיל את מספר סוגי התאים הניתנים להבחנה באתרם. זה מאפשר רמה של ניתוח מרחבי של תאי הגידול ומערכת החיסון שאינה אפשרית באמצעות גישות אימונופנוטיפ מסורתיות¹⁶.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי להצמדת נוגדנים מטוהרים לאוליגונוקלאוטידים ואימות צימוד זה באמצעות פלטפורמת הדמיה מרובת משתתפים והליך הדמיה רב-מחזורי עם רקמת FFPE. בנוסף, אנו מתארים את תהליכי עיבוד התמונה וניתוח הנתונים הבסיסיים המשמשים בטכנולוגיה זו.

Protocol

מחקר רטרוספקטיבי זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של מרכז הסרטן MD Anderson באוניברסיטת טקסס. דגימות רקמת FFPE נאספו ממטופלים ב- MD Anderson כחלק מטיפול סטנדרטי שגרתי. לא בוצעו התערבויות אבחוניות או טיפוליות. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לשימוש בדגימות שנאספו למחקר ולפרסום.

1. מקורות נוגדנים המשמשים לעיצוב לוח הנוגדנים

1. צור פאנל נוגדנים להדמיה מרובת משתתפים לאחר ששקל בקפידה את איכות הרקמות והחלבונים המעניינים. שלושה מקורות נוגדנים נלקחים בחשבון עבור תכנון פאנל הנוגדנים: 1) נוגדנים מאומתים באופן מסחרי מלא, 2) נוגדנים מרובי מולקולות המוקרנות בטכנולוגיית הדמיה מרובה, ו -3) נוגדנים המשותפים למשתמש הקצה.
   הערה: נוגדנים המוקרנים בטכנולוגיית הדמיה מרובבת הוכחו כיעילים והם זמינים מספקים. נוגדנים מוקרנים אלה יכולים להיות מיושמים על צביעת תמונה מרובבת לאחר הצמדה אוליגונוקלאוטיד על ידי המשתמש.
2. אם לא ניתן למצוא חלבון מעניין במקורות שהוזכרו לעיל, השתמש בשיבוטים של נוגדנים הידועים כעובדים עם IHC. בנוסף, איזוטיפים של IgG ולא שיבוטים של IgM מומלצים לטכנולוגיית הדמיה מרובת משתתפים זו בשל שיעור הכשל הגבוה יותר עם IgM מאשר עם שיבוטים של IgG.

2. לפני הצמדת נוגדנים

1. בעת זיהוי שיבוטים של נוגדנים לצמידות באמצעות ברקודי הדמיה מרובה, שקול לרכוש נוגדנים ללא נשא במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או במאגר דומה. חלבונים נשאים, כולל BSA, גלוטן, גליצרול ותוספי חלבון אחרים, ידועים כמפחיתים את יכולת הצמידות.
2. בחר את שיבוט הנוגדנים המתאים ביותר, ותמיד מטב את תנאי הצביעה (כלומר, שליפת אנטיגן וטיטרציה) לפני הצמידה. עשה זאת על ידי החלת שיבוט נוגדנים לא מצומד על רקמה חיובית ושלילית עבור נוגדן זה באמצעות תקן IF או IHC.
   הערה: אם נוגדן מטוהר אינו זמין מסחרית, יש לבצע תהליך טיהור נוגדנים לפני הצמידה. הליך הטיהור המשמש עם ערכות טיהור נוגדנים אינו נדון כאן.

3. צימוד נוגדנים

1. להשיג את ריאגנטים צימוד נוגדנים. ערכות צימוד זמינות מסחרית מכילות פתרון חסימת מסנן, פתרון הפחתה 2, תמיסת צימוד, תמיסת טיהור, תמיסת אחסון נוגדנים (כולם מאוחסנים ב- 4 ° C) ותמיסת הפחתה 1 (מאוחסנים ב -20 ° C).
2. צימוד
   הערה: נוגדן מטוהר מטופל בחומר מחזר, המאפשר למאדים המופחתים של הנוגדן להגיב עם ברקוד ההדמיה המרובב המשמש בטכנולוגיה זו, ובכך ליצור קשר קוולנטי. תהליך זה לוקח בערך 4.5 שעות ומביא בערך 120 μL של נוגדן מצומד, אשר קיימא במשך 1 שנה. כל הספין דאון מתבצע בטמפרטורת החדר (RT), והזרימה מושלכת למעט בשלב האחרון (3.2.9), שבו צינור איסוף מכיל את הנוגדן המצומד.
   1. יש לשאוף ולמרוח 500 μL של תמיסת חסימת המסנן באמצעות פיפטה על עמודות מסנן חיתוך המשקל המולקולרי של 50 kDa ולהסתובב כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 2 דקות כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
      הערה: אם ניתן להבחין בתמיסה שיורית בראש העמודה, הפוך את המסנן בצינור האיסוף וסובב כלפי מטה במהירות של 3,000 x גרם למשך 2 דקות.
   2. פיפטה 50 מיקרוגרם של הנוגדן בנפח 100 μL של תמיסה לעמודת המסנן, וסחרור כלפי מטה ב 12,000 x גרם במשך 8 דקות.
      הערה: השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז הנוגדן המטוהר ולחשב את נפח התמיסה המתאים ל- 50 מיקרוגרם של הנוגדן. אם נפח תמיסת הנוגדנים הוא פחות מ -100 μL, התאם את עוצמת הקול ל -100 μL על ידי הוספת 1x PBS. שמור 1 מיקרוגרם של נוגדן לא מצומד לאישור הצמדה (שלב 4.4).
   3. פיפטה 260 μL של תערובת מאסטר הפחתה (20 μL של תמיסת הפחתה 1 מעורבב עם 825 μL של תמיסת הפחתה 2, אשר מספיק עבור שלוש תגובות צימוד נוגדנים) לכל עמודת מסנן. מערבבים בעדינות את תערובת האב במשך 2-3 שניות, או פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה עם הנוגדן. יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות.
   4. לאחר הדגירה, סובבו את עמודות המסנן כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 8 דקות. הוסף 450 μL של תמיסת צימוד לעמודות המסנן, וסובב כלפי מטה ב- 12,000 x גרם למשך 8 דקות.
   5. השהה מחדש את הברקוד הרצוי ב- 10 μL מים ללא נוקלאז ו- 210 μL של תמיסת צימוד.
      הערה: יש להכין תג נוגדן מיד לפני השימוש להכתמה. אין לעשות שימוש חוזר ב- aliquots של ברקוד נוגדנים.
   6. לאחר השלמת הספין דאון בשלב 3.2.4, הוסף את תג הנוגדן המושעה מחדש (כ- 220 μL) לכל עמודת מסנן מתאימה. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב את ריאגנטים. סגור את מכסי עמודות המסנן ודגר על תגובת הצמידות ב- RT למשך שעתיים. לאחר שעתיים, סובב את עמודות המסנן כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 8 דקות.
      הערה: מומלץ להפריש 5 μL של התמיסה המצומדת בצינור תגובת שרשרת פולימראז ואחסונו, בטמפרטורה של 4°C, לפרוטוקול האישור (ראה להלן).
   7. פיפטה 450 μL של תמיסת הטיהור לתוך כל עמודת מסנן, ולהסתובב למטה ב 12,000 x גרם במשך 8 דקות. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
   8. פיפטה 100 μL של פתרון האחסון לתוך עמודות המסנן. בעדינות פיפטה את התערובת למעלה ולמטה יותר מ 10 פעמים, בזהירות לשטוף את הצדדים של מסננים בעמודה.
      הערה: יש להמיס 50 מיקרוגרם נוגדנים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת האחסון. אם תגובת הצמידות מתחילה עם יותר מ -50 מיקרוגרם של נוגדן, הוסף תמיסת אחסון נוספת ביחס זה.
   9. הפוך את עמודות המסנן בצינור איסוף חדש. סובב כלפי מטה ב- 3,000 x גרם למשך 2 דקות ב- RT. שמור את התמיסה שנאספת. פיפטה תמיסת נוגדנים מצומדת לתוך צינורות בורג סטריליים, ולאחסן עד 1 שנה ב 4 ° C.
      הערה: נוגדן מצומד צריך להיבדק עם טכנולוגיית הדמיה מרובת לאחר יומיים. בדיקות לפני כן עלולות לגרום להכתמה גרעינית ברקע גבוה.

4. אישור צימוד

הערה: לפני ביצוע ניסויי צביעה עם נוגדן מצומד המשתמש באמצעות טכנולוגיית הדמיה מרובה, יש לאשר את הצמידות באמצעות אלקטרופורזה בג'ל עם 5 מיקרוליטר של הנוגדן המצומד (ראה שלב 3.2.6) יחד עם 1 מיקרוגרם של נוגדן לא מצומד (בדרך כלל ב -2 מיקרוליטר של התערובת) כבקרה. צימוד נוגדנים מוצלח יודגם על ידי עלייה במשקל המולקולרי של הנוגדן. עם זאת, פרוטוקול אישור זה רק מעריך את הצלחת התגובה הכימית לצמידות ואינו מתייחס לאימות הנוגדנים המשמש להדמיה מרובה.

1. פיפטה 8 μL ו 11 μL של מים ללא nuclease לתוך נוגדן מצומד שמור לשלוט נוגדן unconjugated, בהתאמה, כדי לקבל נפח סופי של 13 μL.
2. פיפטה 5 μL של LDS (או מערכת אלקטרופורזה אחרת של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל) חיץ דגימה ו 2 μL של חומר מקטין דגימה לתוך כל דגימה של נוגדן מצומד שמור, ו denature את הדגימות באמבטיה יבשה 95 ° C במשך 10 דקות.
3. בזמן שהדגימות עוברות דנטורציה, יש לדלל 40 מ"ל של חיץ ריצה MOPS SDS ב-760 מ"ל מים טהורים במיוחד, להניח ג'ל במיכל של מערכת אלקטרופורזה ולשפוך את חיץ הריצה המדולל על הג'ל.
4. לאחר השלמת תקופת הדה-נטוריזציה בת 10 הדקות, טען באר אחת של הג'ל בתקן חלבון מוכתם מראש, באר אחת עם נוגדן לא מצומד (משלב 3.2.2), ואת הבארות הנותרות עם דגימות נוגדנים מצומדות. לאחר מכן, הפעל את הג'ל ב 150 V עד תקן החלבון מופיע בסוף הג'ל.
   הערה: הג'ל נצמד בקלות למיכלים בטוחים לשימוש במיקרוגל, ולכן עלול להיקרע, ולכן יש לטפל בג'ל בזהירות בשלבים הבאים.
5. לאחר סיום הריצה, העבירו את הג'ל למיכל בטוח למיקרוגל שמולא מראש במים טהורים במיוחד, וחממו אותו במיקרוגל עד להדמיה של הבועה הראשונה במים.
   הערה: זמן היווצרות הבועות משתנה מאוד בהתאם למיקרוגל שבו משתמשים.
6. מסננים את המים מהמיכל, יוצקים כ 250 מ"ל של כתם Coomassie G-250 על הג'ל, ומחממים את הג'ל במיקרוגל עד הבועה הראשונה הוא דמיין. לאחר מכן, הוציאו את המיכל עם הג'ל וכתם Coomassie G-250 מהמיקרוגל, והניחו אותו על שייקר למשך 10 דקות.
7. לאחר ניעור, בזהירות לנקז את הכתם, להחליף אותו עם כ 200 מ"ל של מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן להניח את המיכל על שייקר לשטוף את הג'ל.
8. מסננים את המים האולטרה-טהורים, ומחליפים אותם במים אולטרה-טהורים חדשים חמש פעמים או עד ששאריות הכתם אינן ניכרות באמבט המים. השאירו את הג'ל לשטיפה למשך הלילה על השייקר עד שהרצועות גלויות, במידת הצורך, לפני צילום הג'ל (איור 1).
   הערה: הנוגדנים המשמשים בהדמיה מרובבת צריכים להיות בעלי דפוסי צביעה דומים לאלה של נוגדנים מצומדים. חלקי רקמות עם אנטיגנים ידועים חיוביים לנוגדנים מצומדים יכולים להיות מוכתמים בנוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים ונוגדנים מצומדים. בעבודה זו, בכל מקרה, מורפולוגיות הרקמה של שני סוגי הנוגדנים היו שקולות והרמוניות זו עם זו, כמו גם התפלגות התאים הצפויה, בהתבסס על הביולוגיה של החלבונים המעניינים ודגימות רקמת הבדיקה. תוצאה זו מדגימה את היעילות של שימוש בנוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים עבור גישות מבוססות צביעת רקמות באמצעות רקמת FFPE.

5. צביעת נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטיד

1. הכינו כיסויים למיקום רקמות.
   1. השרו את החלקות בתמיסת פולי-L-ליזין 0.1% למשך 24 שעות ב-RT כדי לשפר את היצמדות הרקמות.
   2. לאחר ההשריה, מסננים את תמיסת הפולי-L-ליזין ושוטפים את הכיסויים במים טהורים במיוחד למשך 30 שניות. חזרו על הכביסה ארבע עד שש פעמים. הסירו את הכיסויים מהמים האולטרה-טהורים המשמשים לכביסה, והניחו אותם על מגבת ללא סיבים לייבוש למשך הלילה.
      הערה: על היסטולוג לחתוך את הרקמה שנבחרה למקטעים בעובי 5 מיקרומטר, להניח אותם במרכז מכסה טעון פולי-L-ליזין, ולאפשר להם להתייבש למשך הלילה. לאחר הייבוש, יש לאחסן את הכיסויים עם חלקי הרקמה ב -4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ -6 חודשים. לוח הצביעה בפרוטוקול זה הכיל 26 סמנים. הרקמה ששימשה בפרוטוקול זה הייתה רקמת שקדים אנושית רגילה. זמן ההשריה בתלוש הכיסוי לא יעלה על שבוע. ניתן לאחסן כיסויים מצופים פולי-L-ליזין ב-RT ויש להשתמש בהם תוך חודשיים מההכנה.
2. יום לפני הכתמה, יש להכניס את מחזיק הכיסוי לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך הלילה.
3. למחרת, הניחו את דוגמת הכיסוי במחזיק כיסוי שחומם מראש בתנור בטמפרטורה של 60°C. לאחר אפייה של 30 דקות, בודקים שהפרפין נמס מהרקמה.
4. מקם במהירות את מחזיק הכיסוי/הדגימה בסדרת הפתרונות הבאה: שני סבבים של חומר להסרת שעווה למשך 6 דקות כל אחד; שני סבבים של 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד; סיבוב אחד של 90% אתנול במשך 5 דקות; סיבוב אחד של אתנול 70% במשך 5 דקות; סיבוב אחד של אתנול 50% במשך 5 דקות; סיבוב אחד של 30% אתנול במשך 5 דקות; ושני סבבים של מים אולטרה-טהורים שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט (DEPC) במשך 5 דקות כל אחד.
   הערה: כל הדילולים של אתנול מוכנים עם מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. אם קסילן משמש להסרת שעווה, יש להשתמש בו במכסה מנוע.
5. בעת חשיפת מחזיק הכיסוי/הדגימה לסדרת התמיסות, בצע את הפעולות הבאות:
   1. הכינו תא לחות על ידי הנחת קופסת טיפים פיפטה ריקה עם מגבת נייר ספוגה במים בתחתית.
   2. מלאו סיר לחץ בכמות מספקת של מים כדי לכסות בחצי הדרך של 50 מ"ל.
   3. מניחים 5 מ"ל מתנול לדגימה בכד ב 4 ° C.
   4. יש לדלל את חיץ AR9 במים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC עד פי 1; יש צורך בכ-50 מ"ל של החיץ המדולל לכל מחזיק כיסוי.
6. לאחר השלמת סדרת התמיסות, מלאו זכוכית בנפח 50 מ"ל בכ-40 מ"ל של חיץ AR9 אחד, השקיעו את מחזיק הכיסוי/הדגימה בכד וכסו לחלוטין את מחזיק הכיסוי/הכיסוי ברדיד אלומיניום.
   1. הניחו את המשקוף/מחזיק הכיסוי המכוסה ברדיד אלומיניום בסיר הלחץ המלא במים, ובשלו בלחץ גבוה (כ-15 psi) במשך 20 דקות.
   2. לאחר הבישול, הסירו את מחזיק הכד/כיסוי, הסירו בזהירות את נייר הכסף מאלומיניום והניחו למחזיק הכוסית/מכסה להתקרר ב-RT למשך כ-10 דקות.
   3. הסר את מחזיק הכיסוי/הדגימה ממאגר AR9 1x, והשקע אותו בשני סבבים של מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC, תוך ביצוע דגירה של הדגימות בשני הסבבים במשך 2 דקות כל אחד.
   4. במהלך הדגירה, יש לאחזר את מאגר ההידרציה, את ה-N החוסמ, לחסום את G, לחסום J ולחסום את תמיסות S, ואת דילול/חסימת הנוגדנים מערכת צביעת ההדמיה המרובבת. עבור שתי דוגמאות כיסוי, תייגו לוחות בעלי 6 בארות עבור הפתרונות באמצעות התצורות המוצגות באיור 2.
   5. הניחו את דגימת הכיסוי בשני סבבים של 5 מ"ל של חיץ ההידרציה למשך 2 דקות כל אחד.
   6. לאחר שני סבבי ההשמה במאגר ההידרציה, הניחו את דגימת הכיסוי ב-5 מ"ל של דילול/בלוק נוגדני ההדמיה המרובבים, ודגרו במשך 20-30 דקות ב-RT (אין לחרוג מ-30 דקות).
   7. במהלך הדגירה, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי הכנת תערובת מאסטר של 200 μL של מדלל/בלוק נוגדני הדמיה מרובה, חוסם N, חוסם G, חוסם J ותמיסות חוסם S.
      הערה: חשב את כמות הנוגדנים הכוללת בהתבסס על מספר הסמנים והטיטרציה המאומתת של כל סמן, והפחת את כמות הנוגדנים הכוללת מתערובת האב. לדוגמה, עבור שישה סמנים, כל אחד עם טיטרציה של 1:200, המשוואה תהיה 200 μL של תערובת מאסטר - 6 μL של קוקטייל נוגדנים = 194 μL של תערובת מאסטר.
7. לאחר הדגירה בדילול/בלוק נוגדני ההדמיה המרובבים, הניחו את דגימת הכיסוי בתא הלחות שהוכנה בשלב 5.5.1, פיפטה 190 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים על דגימת הכיסוי, ודגרו על דגימת הכיסוי ב-RT למשך 3 שעות.
   1. לאחר הדגירה, שטפו את דגימת הכיסוי בשני סבבים עם 5 מ"ל של נוגדן הדמיה מרובה/בלוק למשך 2 דקות כל אחד.
   2. כדי לתקן את הנוגדנים הקשורים לרקמה על הכיסוי, בצע שלבים 5.7.3-5.7.5 בתא הלחות.
   3. יש לדגור על החלקות במשך 10 דקות עם 16% פורמלדהיד מדולל ל-1.6% בתמיסת אחסון, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS אחד.
   4. לדגור את הכיסויים במשך 5 דקות עם מתנול 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS.
   5. לדגור על הכיסויים במשך 20 דקות עם 5 מ"ל של מגיב קיבוע מדולל עם 1x PBS, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS.
   6. אחסנו את דגימות הכיסוי המוכתם במאגר האחסון בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים

6. לוחית כתב הדמיה מרובבת

הערה: צלחת בת 96 בארות, המכונה לוחית כתב, המכילה פלואורופורים ברקודים בבארות בודדות מוכנה על פי ניסויי הדמיה מרובי תרבבים שתוכננו במיוחד ומתואמת עם כל דגימת כיסוי מוכתמת. השלבים הבאים הם להכנת צלחת הכתב.

1. הכינו תערובת מאסטר לכתב על ידי שילוב של 4,880 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 600 מיקרוליטר של חיץ הדמיה מרובב פי 10, 500 מיקרוליטר של מגיב בדיקה ו-20 מיקרוליטר של תמיסת כתמים גרעיניים. זה יספיק ל -20 מחזורים של כל הבארות.
2. בכל מחזור של ניסוי הדמיה מרובת ריבובים שתוכנן בהתאמה אישית, מלא באר עם 245 μL של תמיסה המכילה את תערובת המאסטר של הכתב ואת הפלואורופורים המקודדים הספציפיים עבור מחזור זה.
   הערה: ראה איור 3 עבור תצורת לוחית הכתב המשמשת בפרוטוקול זה עבור לוח קרצינומה.
3. כדי להגן על הפלואורופורים המקודדים, הדביקו כיסוי צלחת רדיד אלומיניום מעל לוחית הכתב, והניחו את הצלחת בתוך מכשיר ההדמיה המרובב.
4. אחסנו את צלחת הכתב בקופסה חשוכה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.

7. כיול והפעלה של מכונת ההדמיה המרובבת

הערה: מיקרוסקופ ההדמיה הפלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה לוכד ארבע תעלות פלואורסצנטיות שונות בכל מחזור הדמיה מרובב במהירות של 20x, 100% עירור אור, ועם הלבנה נמוכה.

1. כיול מוקד ההדמיה באמצעות ערוץ DAPI על ידי הנחת כיסוי דגימה על במת המיקרוסקופ, תוך הזרמה ידנית של 700 μL של טיטרציה של 1:1,500 של תמיסת כתמים גרעיניים על הרקמה.
   הערה: הכיסוי נשמר בשלב המיקרוסקופ במהלך שטיפת הדגימה והדמיה.
2. כדי להכין את מכשיר ההדמיה המרובב, יש לדלל את מאגר הדימות המרובב 10x ל-1x באמצעות מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC, ולמלא בקבוקי ריאגנטים בתמיסות/ממסים מתאימים, כולל מאגר הדמיה מדולל 1x מרובב, מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC ודימתיל סולפוקסיד (DMSO).
3. לאחר מילוי בקבוקי המגיב כראוי, הזן את התכנון הניסיוני בתוכנת מנהל מכשירי ההדמיה המרובבים; לציין את המחזור הנכון, מספרי בארות, מקומות מחסנית z, שם סמן, מחלקה וזמן חשיפה עבור כל מחזור (איור 4); הגדר את כל הפרמטרים של המיקרוסקופ; ובחר את אזורי העניין בתלוש הכיסוי לדוגמה שברצונך לצלם.
   1. לחצו על כפתור הניסוי בתוכנת הבקרה (איור 4A). בחלון Experiment Setup and Management , לחצו על הלחצן New Template (איור 4B).
   2. הקלד את שם הפרויקט בשטח שליד לחצן פרוייקט (איור 4C). הקלד או בחר את מספר המחזורים הכולל (איור 4D).
   3. לחצו על כפתור הקצאת הערוץ , הקלידו את המידע עבור כל מחזור בעמודות (איור 4E) ולחצו על הלחצן ' שמור תבנית' . התחל את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור התחל ניסוי .
      הערה: במהלך ניסוי הדמיה מרובה, המכשיר שולף את הפלואורופורים המקודדים מבאר אחת של לוחית הכתב (מקסימום ארבעה פלואורופורים לכל באר, כולל DAPI), מפזר אותם ישירות על מכסה הדגימה, ומצלם את אזורי העניין עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. לאחר כל ההדמיה של אותו מחזור, המכשיר שוטף את הפלואורופורים המקודדים ומחלק את המחזור הבא של הכתבים (מהבאר הבאה על צלחת הכתב). ההדמיה נמשכת עד להשלמת כל המחזורים באמצעות 26 סמנים.

8. אוסף תמונות

הערה: ניתן לאסוף תמונות מרובבות באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מותאם המוגדר עם ארבע תעלות פלואורסצנטיות (DAPI, Cy3, Cy5 ו- Cy7) ומצויד בעדשת Plan Fluor 20x. הדמיה ושטיפה של דגימות הכיסוי מבוצעות באופן איטרטיבי באופן אוטומטי באמצעות מערך פלואידיקה שפותח במיוחד. התמונות נרכשות באמצעות תוכנת מעבד (v1.8.0.7) בפורמט QPTIFF.

1. בחלון המעבד, לחץ על כפתור הקלט ובחר את שם הניסוי.
2. במקטע אפשרויות עיבוד , בחר וסמן את חיסור רקע, ביטול פיתול, עומק שדה מורחב ותיקון הצללה. לחץ על לחצן התחל .

9. ניתוח תמונות

הערה: ניתן להעלות את התמונות שנרכשו לתוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המוגנת בפטנט או לתוכנת קוד פתוח (איור 5) לצורך ניתוח במורד הזרם.

1. לחץ על סמל QuPath במחשב ופתח את התוכנה. גרור את קובץ ה- QPTIFF לחלון מציג .
2. לחץ על כפתור בהירות וניגודיות, שיפתח את החלון בהירות וניגודיות. סמן או בטל את הסימון של הסמן בעמודה נבחר כדי להציג או לסגור את אות הסמן.
3. לחץ על כפתור Zoom to fit כדי להגדיל או להקטין את אזור העניין.
   הערה: תצוגה חזותית של נתוני תמונה מרובבים מספקת למשתמש מבט מעמיק לתוך המיקרו-סביבה של הרקמות. ניתן להמחיש סמנים בודדים בדגימות FFPE בתבנית פלואורסצנטית (איור 6 ואיור 7) או בתצוגת פתולוגיה. ניתן להשתמש במספר פלטפורמות חישוביות כדי לעבד את התמונות המרוכבות ולנתח את נתוני התמונה של הרקמה המרובבת. באמצעות תוכנה זו, ניתן לבצע פנוטיפ מרחבי, כמו גם גילוי תאים נדירים וחישוב שכונתי תאים, עם תמונות שקופיות שלמות של רקמה מרובבת גבוהה במיוחד הנוצרת באמצעות טכנולוגיית הדמיה מרובבת. ראו איור 6 עבור 26 הנוגדנים בלוח הקרצינומה ובדגימת השקדים (איור משלים 1).

Results

השתמשנו בדגימות שקדים של FFPE כדי לפתח פאנל אונקולוגי חיסוני של 26 סמנים כדי להמחיש את המצב החיסוני של רקמת FFPE באמצעות מערכת ניתוח תמונות ברקוד. בסך הכל, 19 נוגדנים משמשים כיום במחקרי הדמיה מרובבים אחרים במעבדה שלנו. כל הסמנים נבדקו באמצעות רקמת FFPE עם IHC כרומוגני. כל הנוגדנים הוצמדו לאוליגונוקלאוטידים ייחודיים של DNA. בעת הגדרת הכיסויים באמצעות מנהל המכשירים מבוסס האינטרנט (איור 4) עבור טכנולוגיית ניתוח תמונות ברקוד זו, יש לציין שהמחזור הראשון והאחרון הם תמיד "ריקים" (איור 2 ואיור 4), אשר מספקים את אותות הפלואורסצנטיות ברקע שיש להחסיר מהאותות הספציפיים מהנוגדנים. לאחר איסוף תמונות בפורמט QPTIFF באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ניתן להמחיש אותן באמצעות מספר תוכנות ניתוח תמונה אוטומטיות המוגנות בפטנט או תוכנות קוד פתוח. תמונות ללא הפרדות צבע יכולות להציג את כל הסמנים או הסמנים שנבחרו לקבלת תצוגה טובה יותר של האותות (איור 5). יתר על כן, כל נוגדן יכול להיות מוערך חזותית עבור לוקליזציה גרעינית, ציטופלזמית, או ממברנית. ניתן לזהות בקלות תאי מערכת החיסון, הגידול והסטרומה. לאחר מכן, ניתוח תמונות יכול לספק מידע על עוצמת האות, הטווח הדינמי והפיזור המרחבי של כל הסמנים (איור 6). השיטה הזו אפשרה לנו לנתח את כל 26 הסמנים ברמה התת-תאית באזור רקמה אחד (איור 7). על ידי ניתוח הקו-לוקליזציה של הסמנים, יכולנו לזהות את הפנוטיפים התאיים, למקם את מיקום התא המרחבי, לחשב את המרחק בין התאים ולמצוא את התפלגות התאים. ההשפעה המכרעת של טכנולוגיה זו היא הצגת פאנל חזק של 26 סמנים המתמקד במצב החיסוני של מיקרו-סביבה ברקמות.

איור 1: תמונה של אימות נוגדנים מצומדים בהתאמה אישית באמצעות ג'ל חלבון Bis-Tris. נתיב 1 של הג'ל מראה את תקן החלבון. נתיב 2 ונתיב 4 מראים נוגדנים מצומדים לברקוד (חצים). נתיב 3 ונתיב 5 מראים את רצועות השרשרת הכבדות והקלות מנוגדן לא מצומד (ראשי חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מפת תצורה של לוח צביעה עבור שתי דוגמאות כיסוי. קיצורים: HB = מאגר הידרציה; B = דילול/בלוק נוגדנים; PSFS = פתרון קיבוע לאחר צביעה; PBS = מלח חוצץ פוספט; MeOH = מתנול; S = פתרון אחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תצורת לוחית הכתב. לכל נוגדן מצומד יש ברקוד המשלים לכתב ספציפי. כדי להגדיר את לוחית הכתב, כל נוגדן מצומד והכתב המתאים לו צריכים להיות רשומים. לאחר מכן, לכל נוגדן מוקצה מספר מחזור. הביצועים של שני מחזורים ריקים (C1 ו- C18) משמשים להערכת רמת הפלואורסצנטיות בשלושת ערוצי הפלואורסצנטיות ולחיסור רקע לאחר הדמיה באמצעות תוכנת בקרת רכישת התמונה. אשף תוכנה יבדוק את המכשיר בשלב זה כדי לוודא שכל ההגדרות נכונות (איור 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: רכישת תמונה באמצעות תוכנת הבקרה עבור הגדרת הניסוי. (A) בחר בכרטיסיה ניסוי בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת הבקרה כדי להכין ולהתחיל בהגדרה. (ב,ג) בחר New Template כדי להזין את ההגדרות הניסיוניות עם פרוייקט חדש ושם ניסוי חדשים. (ד) לשנות היטב את מחזור ההתחלה ואת מספר המחזורים כך שישקפו את מיקום המדווח בלוח הכתב בן 96 הקידוחים. (ה) להקצות את התעלות הפלואורסצנטיות המתאימות לארבעת הערוצים המיועדים להפעלת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תצוגה חזותית של תמונות באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט (QuPath). חלון הצופה מציג 26 סמנים בקטע רקמת השקדים המוכתמת FFPE. החלון בהירות וניגודיות מציג את הסמנים עם סימני הביקורת. לבסוף, חלון המציג מציג את דוגמת FFPE עם הסמנים שנבחרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תצוגה חזותית של תמונות באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט. (A) מקטעי רקמת שקדים הוכתמו עבור 26 הסמנים, והתמונות של המקטעים בפורמט QPTIFF הוצגו באמצעות תוכנה מסחרית להצגת שקופיות דיגיטליות או תוכנת קוד פתוח (QuPath) לביאור וסקירה. (ב-ו) שישה סמנים הוצגו באותו ביאור כדי לראות טוב יותר את האותות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: תצוגות של 26 סמנים בודדים שנעשה בהם שימוש עם תוכנה מבוססת אינטרנט. ביטוי הסמן ברקמת השקדים מוצג באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית עם פאנל אונקולוגי חיסוני (למעלה משמאל). מוצגים סמנים בודדים בשני אזורים קטנים (מלבנים אדומים). ההוספה המוגדלת מציגה תאים חיוביים לסמנים אלה (חצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: סיכום תהליך העבודה של רכישת תמונות מרובות. קטעי רקמת FFPE הוכתמו באמצעות פאנל נוגדנים 26 ואחריו תגובה רב מחזורית. תמונות גולמיות של החלקים המוכתמים עובדו באופן חישובי, וצפיפות תאים וניתוח מרחבי בוצעו באמצעות התמונות המרוכבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: אימות IHC ברקמת שקדים. חלקי רקמת FFPE הוכתמו באמצעות נוגדן בודד. ביטוי הסמן ברקמת השקדים מוצג בהגדלה נמוכה, והתוספת המוגדלת מציגה תאים חיוביים לסמן (מלבנים אדומים). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

ה-TME ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות, התקדמות ותגובות לטיפול בסרטן. בנוסף, הצפיפות של תת-קבוצות לימפוציטים ספציפיות החודרות לגידול ב-TME יכולה לשמש כסמן ביולוגי פרוגנוסטי לסוגים מסוימים של סרטן. למרבה הפלא, בנוסף להרכב התאי של TME, המאפיינים המרחביים של הגידול יכולים לספק מתווה להבנת הביולוגיה של הגידול ולזיהוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים פוטנציאליים^12,17.

מכיוון שאוכלוסיות רבות של תאי חיסון מעורבות בתגובות פרו-סרטניות או אנטי-סרטניות, הבנה טובה יותר של תאים אלה והיחסים המרחביים שלהם זה עם זה ועם תאים סרטניים תסייע להנחות את הזיהוי של אסטרטגיות אימונותרפיות חדשות. מחקרים קודמים ריבדו את המיקום והפיזור המרחבי של תאי TME בהתבסס על מבנה הרקמה באזורים התוך-גידוליים והפריטומורליים והשוליים הפולשים של תאי הגידול^18,19. במהלך 15 השנים האחרונות, ההתקדמות הטכנולוגית הפכה את הניתוח הפנוטיפי של תאים בודדים בהתבסס על הפיזור המרחבי שלהם לכלי חדשני ומשפיע לחקר TME ולסיווג סמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאימונותרפיה של גידולים. היסטוכימיה מולטיפלקס IF יכולה להעריך בו זמנית סמנים ביולוגיים מרובים²⁰.

בדומה לאסטרטגיית נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים, ארבעה סוגים של פלטפורמות מולטיפלקס מבוססות חלבון משמשים לחקר TME: כרומוגן, פלואורסצנטיות, ברקוד DNA ומערכות זיהוי נוגדנים עם תווית איזוטופ מתכת. פלטפורמות IHC כרומוגניות חסכוניות מאפשרות הדמיה של שקופיות שלמות והערכה פתולוגית באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר קונבנציונלי. ב multiplexed IF ו IHC, נוגדנים מצומדים עם fluorophores משמשים. פלטפורמת IF/IHC המולטיפלקס מזהה נוגדנים בעלי ספציפיות גבוהה ויכולה לכמת נוגדנים ממוקדים גם ברמה התת-תאית ^6,21. בנוסף, בשל אופיים של כרומוגנים ופלואורופורים, השימוש בלוח נוגדנים אחד יכול ללכוד את הביטוי של עד 10 סמנים ביולוגיים בשקופית אחת. על פלטפורמות מבוססות איזוטופים מתכתיים, נוגדנים מתויגים מתכתיים משמשים לביצוע הדמיה מרובת תאים ברזולוציה חד-תאית ומרחבית, ורגישות גבוהה עבור קטעי רקמה בודדים²². תיאורטית, גישות נוגדנים מצומדות מתכתיות אלה מאפשרות זיהוי סימולטני של יותר מ-100 סמנים ביולוגיים על מקטע רקמה יחיד. אחד האתגרים של טכניקת סימון האיזוטופים הוא התאבכות איזוברית, המונעת הגעה ל-100% טוהר העשרה²³. יתר על כן, ההפרעה גדלה ככל שמספר הסמנים גדל. פלטפורמות זיהוי נוגדנים מצומדות DNA מזהות נוגדנים המסומנים בברקודים ייחודיים של DNA. יותר מ -40 סמנים ביולוגיים ניתן ללכוד בו זמנית עם ספציפיות גבוהה על פלטפורמות אלה⁶.

Multiplexed imaging היא פלטפורמה מסחרית לזיהוי נוגדנים עם תווית ברקוד DNA ליישום נוגדנים מצומדים לדנ"א על שקופית רקמה אחת בשלב אחד (איור 8). עבור שלב הכנת הרקמה, בניגוד לפלטפורמת ההדמיה של קרן יונים מרובבת, הדורשת שימוש בשקופיות מצופות זהב המתקבלות מהיצרנים, פלטפורמת ההדמיה המרובבת דורשת רק כיסויים רגילים או שקופיות מצופות ב-0.1% פולי-L-ליזין כדי לסייע לרקמה להיצמד אליה ולשמור על שלמות הרקמה בתהליך הצביעה וההדמיה. מומלץ להשתמש במקטעי רקמה על כיסויים תוך 4 שבועות לאחר החתך, שכן אחסון ממושך של שקופיות לא מוכתמות מביא להפחתת אנטיגניות. ניתן לשמור דגימת כיסוי מוכתמת במאגר אחסון בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים מבלי לאבד את אות הצביעה שלה. אין צורך בציוד מיוחד לאחסון דגימות הכיסוי. מערכת ההדמיה המרובבת שודרגה לשימוש בשקופיות רגילות במקום החלקות כיסוי, מה שמאפשר צביעה של רקמות גדולות יותר וטיפול קל. בעת שימוש בתמיסת הפחתה להצמדת נוגדנים (שלב 3.2.3), התגובה צריכה להיות מוגבלת ללא יותר מ -30 דקות כדי למנוע נזק לנוגדנים. יש להכין מחדש את מאגרי החסימה בשלב 5.6.6, ואין לעשות שימוש חוזר במאגרי החסימה.

בהשוואה לפלטפורמות זיהוי נוגדנים מרובים עם תווית כרומוגן, פלואורסצנטיות ומתכות, לטכנולוגיית ההדמיה המרובבת יש יתרונות מסוימים. לדוגמה, יותר מ -60 לוחות נוגדנים מתוכננים מראש עבור הדמיה מרובת זמינים באופן מסחרי, מה שעוזר לחסוך זמן ועלויות בהצמדת נוגדנים ותיקוף, ומספר לוחות נוגדנים שתוכננו מראש גדל. נוגדנים אלה, הכוללים את סמן הקרצינומה pan-cytokeratin, סמן המלנומה SOX10, סמן כלי הדם CD31, סמן סטרומה SMA, וסמנים רבים של תאי החיסון, מאומתים ומוכנים לניסוי. עבור נוגדנים שאינם מתוכננים מראש, ערכת הצמידות הזמינה מסחרית המיועדת לשימוש עם הדמיה מרובבת היא פשוטה וידידותית למשתמש. נוגדנים מצומדים על ידי הלקוח טובים למשך שנה אחת כאשר מאוחסנים ב 4 ° C. בנוסף, חימום המכונה אינו נדרש ללכידת התמונות. בטכנולוגיית הדמיה מרובת משתתפים זו, שלבי השטיפה, ההכלאה וההפשטה האיטרטיביים ברכישת התמונה גורמים רק לעתים רחוקות לירידה בעוצמת הסמן או למורפולוגיה ירודה של הרקמה 5,24,25. יתר על כן, תמונות מרוכבות נלכדות בפורמט QPTIFF עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט בן שלושה צבעים וניתן להעלות ולנתח אותן באמצעות תוכנת ניתוח דיגיטלית של צד שלישי. ניתן להמחיש את סמני הצביעה ברזולוציה של תא בודד, וניתן לאפיין פנוטיפים של תאים באמצעות לוקליזציה משותפת של הסמנים (איור 6 ואיור 7). הניתוח המקיף של תמונה מרובת תאים חושף עוד יותר את תאי הרקמה, את כימות הסמן החד-תאי ואת נתוני השכן הקרוב ביותר ונתוני הקרבה (איור 8).

אתגר בניתוח תמונות מרובות הוא זיהוי סוג התא. בדרך כלל, כאשר מוחלים יותר מסווגים של אובייקט יחיד על תמונה, יופיעו ביאורים לפנוטיפים נדירים יותר. לכן, מומלץ להשתמש בסמנים ידועים שאינם מבוטאים יחד באותו מסווג ולהחיל רק את המסווג הקשור לפנוטיפ על ביאור של תאים בודדים. שינויים בביאור מסוג התא יביאו לתוצאות מרחביות שונות באופן משמעותי, כגון הבדלים בהתפלגות המרחבית של התא ובניתוח שכונות תאים^26,27.

ניתוח תמונות מרובבות הוכיח את עצמו כמוצלח בצביעה והדמיה של סוגי דגימות רבים, כולל רקמת FFPE, רקמה קפואה טרייה, שקופיות שלמות מאוחסנות בארכיון ומיקרו-מערכי רקמות. ניתן להשיג תמונות מרובות של מקטעי שד, מוח, ריאות, טחול, כליות, בלוטות לימפה ורקמות עור^{עם נתוני} פנוטיפ מרחבי עמוק של תא יחיד 5,16,25,28.

בעתיד, נוגדנים מתוכננים מראש יותר עבור הדמיה multiplexed צפויים. בנוסף, פיתוח תוכנה ספציפית לניתוח תמונות מרובות נחוץ מאוד. נכון לעכשיו, תוכנות רבות הזמינות מסחרית וקוד פתוח לניתוח תמונות Hi-Plex קיימות²⁹, אך מדענים עדיין זקוקים לעזרה ביצירת זרימת עבודה סטנדרטית עבור ניתוחים אלה^30,31. למרות שהתמונות המורכבות שצולמו באמצעות פרוטוקול זה תואמות לתוכנת צד שלישי, הדבר עלול לגרום לעלויות נוספות עבור המשתמש. חסרון נוסף של טכנולוגיית ההדמיה המרובבת הוא הפחתת האות בזיהוי חלבון גרעיני לאחר שטיפה איטרטיבית, הכלאה והפשטה עם פאנלים גדולים של נוגדנים. למרבה המזל, ניתן למזער זאת על ידי שליפת הפלואורופורים המקודדים במחזורים מוקדמים בעת תכנון לוחות הכתב. לאחרונה, פלטפורמה זו שודרגה עם מערכת סריקה חדשה במהירות גבוהה, אשר צמצם באופן דרמטי את הזמן כדי לקבל תמונות מרוכבות³². בנוסף, דווח על אסטרטגיה חדשה המשתמשת בברקודים מצומדים של טירמיד כדי לשפר את ההדמיה מבוססת ברקוד נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים. טכנולוגיה זו נועדה להגביר אותות צביעה שקשה להשיג עבורם נוגדנים מצומדים בברקוד³³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x AR9 Buffer	Akoya Biosciences	AR900250ML
10x Buffer	Akoya Biosciences	7000001
16% פרפורמלדהיד	Thermo Fisher Scientific	28906
1X נוגדנים מדלל/בלוק	ARD1001EA		Akoya
	Biosciences Akoya Biosciences	7000009	מכיל תמיסת חסימת מסנן, תמיסת הפחתת נוגדנים 1, תמיסת הפחתת נוגדנים 2, תמיסת צימוד, תמיסת טיהור, תמיסת אחסון נוגדנים
מגיב	בדיקת Akoya Biosciences	7000002
דיאתיל פירוקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	40718-25ML
דימתיל סולפוקסיד	Avantor/VWR	BDH1115-4LP
אתנול, 200 הוכחה
G Blocker V2	Akoya Biosciences	240199
Histoclear	Thermo Fisher Scientific	50-329-50
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	34860-1L-R
Milli-Q אינטגרלי 10	מיליפור
Niknon מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Keyence Corp. of America	BZ-X810
כתם גרעיני	Akoya Biosciences	7000003
מים ללא נוקלאז	Thermo Fisher Scientific	AM9938
NuPAGE	Thermo Fisher Scientific	NP0008
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190136
שילוב ברקודים/מדווחים של PhenoCycler	Akoya Biosciences	5450004 (BX025/RX025)
		5450003 (BX022/RX022)
		5450023 (BX002/RX002)
		5250002 (BX020/RX020)
		2520003 (BX023/RX023)
		5250005 (BX029/RX029)
		5250007 (BX035/RX035)
		5250012 (BX052/RX052)
		5550012 (BX030/RX030)5550015
		(BX042/RX042)
		5550014 (BX036/RX036)
בקוד פתוח	QuPath	https://qupath.github.io/
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6065
	(Akoya Biosciences	7000008	מכילה מאגר הידרציה, חוסם N, חוסם J, חוסם S, מגיב מקבע, מאגר אחסון