הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR

4.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64760

⸱

14 באפריל 2023

 ,  , 
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.

תקציר

השליה היא איבר חיוני המווסת ומשמר את התפתחות היונקים ברחם. השליה אחראית על העברת חומרי מזון ופסולת בין האם לעובר ועל ייצור ואספקה של גורמי גדילה והורמונים. מניפולציות גנטיות שליה בעכברים הן קריטיות להבנת התפקיד הספציפי של השליה בהתפתחות טרום לידתי. לעכברים טרנסגניים בעלי ביטוי Cre ספציפי לשליה יש יעילות משתנה, ושיטות אחרות למניפולציה של גנים שליה יכולות להיות חלופות שימושיות. מאמר זה מתאר טכניקה לשינוי ישיר של ביטוי גנים שליה באמצעות מניפולציה של גן CRISPR, אשר ניתן להשתמש בה כדי לשנות את הביטוי של גנים ממוקדים. באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, סכרים בהריון עוברים לפרוטומיה ביום העוברי 12.5 (E12.5), ופלסמיד CRISPR מועבר על ידי מיקרופיפטה זכוכית לתוך השליה הבודדת. הפלסמיד מחושמל מיד לאחר כל הזרקה. לאחר התאוששות הסכר, השליות והעוברים יכולים להמשיך בהתפתחות עד להערכה בנקודת זמן מאוחרת יותר. הערכת השליה והצאצאים לאחר השימוש בטכניקה זו יכולה לקבוע את התפקיד של תפקוד השליה הספציפי לזמן בהתפתחות. סוג זה של מניפולציה יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו גנטיקה ותפקוד של שליה משפיעים על גדילת העובר והתפתחותו בהקשרים של מחלות מרובות.

מבוא

השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה1. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.

העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר6. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר7. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם8. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים9. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.

לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות1. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה10. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים17.

בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.

טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF 17. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בוצעו בהתאם ובהתאם לתקנות הפדרליות ולמדיניות אוניברסיטת איווה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

1. בעלי חיים ובעלי חיים

  1. שמור על בעלי החיים במחזור אור יום של 12 שעות עם מזון ומים עד ליביטום.
  2. השתמש בעכברות CD-1 בגילאי 8-15 שבועות. השתמש בנוכחות של תקע כפייתי כדי לזהות E0.5.
  3. ב-E0.5 מאכלסים לבדו את הסכרים ההריוניים.

2. כיול המיקרופיפטה

הערה: יש לבצע את כיול המיקרופיפטה לפני הניתוח במידת האפשר.

  1. לפני ייצור וכיול המיקרופיפטה, יש לדלל את כל הפלסמידים לריכוז המומלץ (0.1 מק"ג/מיקרוליטר) במים נטולי DNase. מערבבים את הפלסמיד עם צבע ירוק מהיר מדולל כראוי (1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-PBS) (ריכוז פלסמיד סופי: 0.06 מק"ג/מק"ל).
  2. משוך מיקרופיפטות באמצעות נימי זכוכית בקוטר 10 ס"מ בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ וקוטר פנימי של 0.86 מ"מ עם מושך מיקרופיפטה.
  3. בזהירות לשבור את קצה micropipette (2-3 מ"מ) עם מלקחיים סטריליים.
  4. לטעון את micropipette לתוך קצה microcapillary מחובר microinjector. ודא שהמיקרו-מזרק מחובר למכונת המיקרו-הזרקה ושיש רמות מספיקות של חנקן כדי לכייל את המיקרופיפטה.
  5. לאחר חיבור המיקרופיפטה למיקרו-מזרק, טען אותה בתמיסת הצבע הירוק המהיר כדי לבצע את הכיול (1 מיקרוגרם/μL ב-PBS). כיילו את המיקרופיפטה להזרקת נפח של כ-3.5 μL. רוקנו ("שקוף") את המיקרופיפטה כהכנה להעמסת תמיסות הפלסמיד כמפורט להלן.
    הערה: כל מיקרופיפטה תהיה שונה במקצת. כדי למנוע פגיעה בשליה במהלך ההזרקה, זמן ההזרקה צריך להיות מוגדר בין 0.5-1.5 שניות. הלחץ צריך להיות מוגדר בין 1-8.5 psi. כיול כל מיקרופיפטה בנפרד; אם micropipette לא ניתן לכייל בתוך פרמטרים אלה, אז זה לא צריך לשמש.

3. ניתוח (איור 1A)

הערה: כדי להכין, נקו את המשטחים הן של אזור ההכנה והן של אזור הניתוח עם אתנול 70%. הניחו תחתיכה סופגת באזור ההכנה. באזור הניתוח, הניחו כרית חימום כלפי מטה, ולאחר מכן הניחו כרית תחתונה סופגת מעליה. יש לעקר את כל הכלים לפני הניתוח. הזמן שהסכר נמצא תחת הרדמה צריך להיות מתחת לשעה.

  1. הרדמה
    1. יש לתת 5 מ"ג/ק"ג של NSAID (meloxicam) או משכך כאבים מאושר אחר לסכר ההריון 30 דקות עד שעה לפני הניתוח.
    2. הניחו את הסכר ההריוני בתא אינדוקציה המחובר לוופורייזר איזופלורן.
    3. כוונו את הוופורייזר ל-4% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן.
    4. לאחר שההרדמה אושרה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה מופחת, יש להסיר את הסכר מתא האינדוקציה לאזור ההכנה.
  2. הכנה לניתוח
    1. באזור ההכנה, מניחים את הסכר שכיבה עם חרוט האף.
    2. הפחיתו את הוופורייזר ל-2% איזופלורן ו-3.5 ליטר/דקה חמצן בזמן שהסכר נמצא בחרוט האף.
    3. לגלח היטב את בטן הסכר ולהסיר פרווה עודפת. ציפוי לסירוגין של הבטן המגולחת בתמיסת פובידון ואתנול 70% שלוש פעמים באמצעות אפליקטורים סטריליים מכותנה. החל את המעיל הסופי של תמיסת פובידון. כדי למנוע התייבשות של הקרנית, הניחו ג'ל דמעות מלאכותי על שתי העיניים של הסכר (איור 2A, B).
    4. לאחר ההכנה, העבירו את הסכר עם חרוט האף לאזור הניתוח המיועד.
  3. לפרוטומיה של הרחם
    הערה: יש להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל ההליך הכירורגי. החליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
    1. באזור הניתוח, הניחו את עמוד השדרה של הסכר, והדקו את חרוט האף למקומו באמצעות נייר דבק. הניחו את כרית החימום מתחת לכרית הסופגת לטמפרטורה של 45°C.
    2. בעזרת מלקחיים ומספריים, לבצע חתך קו אמצע משוער 2 ס"מ דרך העור. השתמש במלקחיים כדי אוהל העור, ולעשות חתך אנכי לתוך העור. לאחר מכן, בצע חתך נוסף בגודל דומה דרך הצפק כדי לחשוף את קרני הרחם. בעזרת מלקחיים, מקמים את הצפק תוך כדי ביצוע החתך האנכי (איור 2C, D).
      הערה: אי ביצוע אוהל כראוי בעת חיתוך הצפק עלול להוביל לחתך קטלני של המעיים.
    3. לעסות בעדינות את קרני הרחם דרך החתך על ידי לחיצה על צידי הבטן. עשו זאת על ידי הנחיה זהירה של הרחם ללא כלים, תוך שימוש באצבעות בלבד כדי למנוע פגיעה בשוגג. הניחו את הרחם החשוף על גבי וילון כירורגי סטרילי המכסה את בטן הסכר ושמרו אותו לח לאורך כל הניתוח בעזרת טיפות מלח סטריליות, שניתן לחמם ל-30°C לפני השימוש לפי הצורך (איור 2E, F).
      הערה: ניתן לזהות את קרני הרחם כמתואר ב- Wang et al.27.
    4. לאחר שהרחם נחשף, בחר שלושה זוגות שליות למניפולציה.
      הערה: ניתן לזהות את השליות כפי שתוארו על ידי Elmore et al.24. כדי למקסם את הישרדות העוברים, לא יותר מ 6 שליות צריך להיות מטופל. אם קיימים פחות מ-12 עוברים, יש להזריק לא יותר מ-4 שליות. בחר שתי שליות סמוכות כך שאחת תקבל זריקת בקרה והשנייה תקבל את פלסמיד הניסוי. השימוש בשתי שליות סמוכות מאפשר השוואה טובה יותר של שליות במקומות דומים ברחם וגם מאפשר קצב הישרדות מוגבר. זוגות השליות שנבחרו נבחרים באופן אקראי ומרווחים לאורך שתי קרני הרחם (איור 1B).
    5. רשום את מיקום מניפולציות השליה וארגון העוברים בתוך קרני הרחם, כך שניתן יהיה לזהות את העוברים והשליות במהלך האיסוף, שכן סכר אחד יישא הן שליות/עוברים שטופלו בניסוי.
  4. הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד הבקרה
    הערה: כדי לשמור על טכניקה אספטית, יש לעקר את משוטי האלקטרופורציה ואת המיקרו-מזרק בחומר מעקר קר לפני השימוש. החליפו כפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
    1. באמצעות מיקרופיפטה מכוילת, לטעון כמות מספקת של פלסמיד הבקרה המתאים עבור שלוש זריקות. בצעו את כל ההזרקות בעומק של ~0.5 מ"מ לרוחב לתוך השליה בין אזור הדסידואה (לבן) לאזור הצומת (אדום כהה) (איור 3A-F).
    2. לבצע זריקות בשלוש שליות הביקורת.
      הערה: בצע את כל זריקות פלסמיד הבקרה לפני זריקות הניסוי כדי למנוע זיהום צולב של הפלסמידים עם המיקרופיפטה. זה יאפשר להשתמש באותה מיקרופיפטה, שכן שינוי מיקרופיפטות וזמן כיול מגדיל באופן דרסטי את זמן הניתוח ומקטין את הישרדות הסכר.
    3. בצע אלקטרופורציה של שליות הבקרה המוזרקות בפלסמיד תוך 2 דקות מההזרקה.
    4. עבור אלקטרופורציה, השתמש בזוג משוטים 3 מ"מ המחוברים למכונת אלקטרופורציה. כדי להבטיח יעילות שילוב CRISPR ואת הכדאיות של עוברים, השתמש בהגדרות האלקטרופורציה הבאות: 2 פולסים, 30 V, 30 ms פולס, 970 ms פולס כבוי, חד קוטבי.
    5. לאחר ההזרקה אך מיד לפני ההתחשמלות יש לצפות את מקומות המגע במי מלח סטריליים, ולמרוח את המלח בדיוק על שלושת האתרים בדופן הרחם והמשוטים בטפטפת או מזרק.
    6. לחץ בעדינות על משוטי האלקטרופורציה בצדדים הרוחביים של השליה. הניחו את משוט האנודה מעל אתר ההזרקה ואת הקתודה ישירות ממול (איור 4A-C).
    7. לחץ על הפולס במכשיר האלקטרופורציה, והמתן עד ששתי הפולסים יסתיימו לפני הסרת משוטי האלקטרופורציה.
      הערה: כמות קטנה של קצף לבן נראית לעתים קרובות בין המשוטים לשליה במהלך פולסים. אם זה לא קורה, בדוק את המתח מהמשוטים עם מד מתח לפני שימוש נוסף. אם הקריאה במד המתח אינה תואמת את הגדרת מתח האלקטרופורציה, המשוטים אינם פונקציונליים.
  5. הזרקת שליה ואלקטרופורציה של פלסמיד ניסיוני
    1. בצע את אותן הוראות משלב 3.4.1. לשלב 3.4.2. שימוש בפלסמיד ניסיוני במקום פלסמיד הבקרה.
    2. בצע אלקטרופורציה של כל שלוש השליות המוזרקות הניסיוניות תוך 2 דקות מההזרקה. זה צריך להתבצע באותו אופן כמו עבור אלה מוזרקים עם פלסמידים בקרה. בצע את שלב 3.4.4. לשלב 3.4.7.
  6. סיום הניתוח
    1. לאחר השלמת מניפולציית השליה, עסו בעדינות את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן באמצעות אצבעות בלבד (איור 5A).
    2. ראשית, בצע תפרים בודדים בעלי קשר כפול על שכבת הצפק באמצעות תפרים מצופים וקלועים הניתנים להמסת מסה באורך 45 ס"מ עם סגסוגת מחט 3/8c 13 מ"מ. רווח את התפרים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה (איור 5B).
    3. לאחר תפירת שכבת הצפק, תפרו את העור בתפרים נמסים. קשר משולש התפרים הבודדים במרחק של 2-3 מ"מ זה מזה כדי להבטיח שהסכר לא יוכל לבטל את התפר (איור 5C).
    4. לאחר השלמת התפירה, כוונו את האיזופלורן ל-1% ואת החמצן ל-3.5 ליטר/דקה, ומרחו דבק רקמות על התפרים שעל העור (איור 5D).
      הערה: דבק רקמות הוא אופציונלי אך מומלץ למנוע פתיחה מחדש של החתך עקב לעיסת סכר.
    5. כאשר דבק הרקמה התייבש, כבו את מכשיר האידוי והוציאו את הסכר מאזור הניתוח. הניחו את הסכר בכלוב תומך על גבו.

4. טיפול ומעקב לאחר הניתוח

  1. לאפשר לסכר ההרה להתאושש בכלוב נקי תחת השגחה למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח שלא יהיו סיבוכים מיידיים של הניתוח. התבונן עד שהוא אמבולטורי לחלוטין ויכול להתהפך על רגליו ללא סיוע. לשכן את הסכר לאחר הניתוח.
  2. יש לעקוב אחר הטיפול והמעקב המוסדיים שלאחר הניתוח עד לאיסוף העוברים. רשום את משקל הסכר, ועקוב אחר התפרים ואתר החתך מדי יום.

5. איסוף שליה E14.5

  1. ב-E14.5, יש להרדים עמוקות את הסכר עם קוקטייל קטמין/קסילזין (1 מ"ג/מ"ל קטמין ו-0.1 מ"ג/מ"ל קסילזין), ולאחר מכן לנקוע את הסכר בצוואר הרחם.
  2. בצע חתך בצורת V לתוך הבטן של הסכר עם מספריים, ולהסיר את הרחם. מניחים מיד על צלחת פטרי בקוטר 5 ס"מ על קרח. באמצעות מלקחיים, בזהירות להסיר את העובר ואת השליה המתאימה מן הרחם.
    הערה: שמור תיעוד של מיקום העובר והשליה המתאימה בקרני הרחם כדי לקבוע מי קיבל את המניפולציה הישירה במהלך הניתוח.
  3. רשום את משקלי השליה. באמצעות מלקחיים וסכיני גילוח נטולי RNAse, חתכו את השליה לשניים לאורך קו האמצע. הכניסו מחצית אחת ל-4% PFA בטמפרטורה של 4°C. חתכו שוב את החצי הנותר לשניים, ואחסנו את שני הרבעונים הנותרים בטמפרטורה של 80°C בשני צינורות, אחד עם מגיב אחסון RNA.
    הערה: ניתן לאחסן עוברים ורקמות אימהיות אחרות מהאוסף בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.

6. ניתוח ביטוי גנים שליה

  1. השתמש ברבע השליה המאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס בריאגנט אחסון RNA.
  2. עבד את השליות עבור qPCR כמתואר ב- Elser et al. באמצעות שיטת Trizol לבידוד RNA, ספקטרופוטומטר לריכוז RNA, ערכת סינתזת cDNA ו- qPCR עם SYBR Green Master Mix28. במקום ערכת Turbo DNAfree DNAse המוזכרת ב- Elser et al., השתמש בערכת RNAcleanup לאחר בידוד ה- RNA של Trizol כדי להבטיח שהדגימות אינן מכילות מזהמים28.
    הערה: קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS) עבור Trizol, והשתמש בו במכסה אדים כימי.
  3. להעריך את החדרת הפלסמיד של פלסמיד הבקרה עם פריימרים GFP ושל פלסמיד ניסיוני עם פריימרים BLAST (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בערך CT כדי לקבוע את נוכחותו של פלסמיד.
    הערה: ערכי CT מעל 35 הם תוצאות חיוביות שגויות, ורק אלה מתחת ל -35 צריכים להיחשב אינדיקטור חיובי לכך שהפלסמיד הוכנס בהצלחה.
  4. להעריך את ביטוי השליה IGF-1 מנורמל לגן משק הבית 18s (פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1). השתמש בשיטת ddCT כדי לחשב את שינוי הקיפול, ולאחר מכן חשב את שינוי הקיפול המנורמל של דגימות הניסוי לשינוי הקיפול הממוצע של דגימות הבקרה.

7. ניתוח רמת חלבון שליה

  1. השתמש ברבע השליה שאוחסנה ב -80 מעלות צלזיוס. הומוגניזציה של הרקמה בתמיסת חיץ העשויה 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 ומעכב פרוטאז 10 mM ב- diH2 O עם pH סופי של 7.4. השתמש הומוגנייזר כף יד ו pestle כדי לפרק את הרקמה.
    הערה: הדגימה לא תעלה על 10% מנפח המאגר.
  2. דללו את הדגימות ההומוגניות במאגר ביחס של 1:12, כך שהן יהיו בטווח הניתן לזיהוי של ערכת בדיקת חומצה ביכונית. בצע את בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את סך החלבון באמצעות קורא לוחות.
  3. לאחר ביצוע בדיקת BCA, לנרמל את כל הדגימות לאותו ריכוז חלבון כולל של 2 מ"ג / מ"ל עבור IGF-1 ELISA, כפי שנעשה Gumusoglu et al.29.
  4. בצע את IGF-1 ELISA בהתאם להוראות היצרן, וכמת את רמות החלבון IGF-1 באמצעות קורא לוחות באמצעות עקומת ריכוז סטנדרטית.

8. אימות CRIPSR מרחבי באמצעות תיוג הכלאה פלואורסצנטי באתרו

  1. לאחר שחצאי השליה קובעו כראוי ב-4% PFA ב-4°C למשך 1-3 ימים, העבירו אותם ל-20% סוכרוז ב-4°C לפני הקפאתם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
  2. באופן סריאלי חותכים את השליה המשובצת OCT בחצי קריוסטט של -20 מעלות צלזיוס למקטעים של 10 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות כדי להיות מסומנים. חתכו את חצאי השליה כך שכל שלושת אזורי המשנה יהיו גלויים. אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש להכלאה באתר .
  3. בצע תיוג הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. בצע הכלאה של שקופית אחת עם בדיקה dCas9-3xNLS-VP64 ושקופית "אחות" שנייה של אותה שליה עם בדיקה Prl8a8.
    הערה: הבדיקה dCas9-3xNLS-VP64 מזהה את נוכחותו של פלסמיד ביטוי יתר. הגשושית Prl8a8 מדגישה ספונגיוטרופובלסטים של אזור הצומת, מה שמאפשר לזהות את תת-האזורים של השליה. שתי בדיקות אלה מסומנות בשקופיות "אחות" נפרדות כדי למנוע הפרעה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית עם האוטופלואורסצנטיות הירוקה בשליות.
  4. תייגו את שתי הגשושיות בצבע הזיהוי (אופל 620). לאחר השלמת פרוטוקול היצרן עבור FISH, החל מדיום הרכבה DAPI והנח מכסה על השקופית. אטמו את הכיסוי בלק שקוף.
  5. דמיינו את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב זקוף, ועבדו אותן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה. כאן נעשה שימוש בתוכנת CellSens.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות כלליות של הליכים (איור 6)
במחקר היו שלוש קבוצות שעברו מניפולציה. אלה כללו שליות שהוזרקו עם פלסמיד בקרה כללי CRISPR Cas9 (Cas9 Control), פלסמיד CRISPR בקרת הפעלה (Act Control), או פלסמיד הפעלת IGF-1 SAM (Igf1-OE). בקרת Cas9 מתאימה יותר לפלסמידים נוקאאוט, ובקרת ההפעלה מתאימה יותר לפלסמידים של ביטוי יתר/הפעלה. כדי להעריך את שינויי הכדאיות הנגרמים על-ידי מניפולציה של השליות באמצעות הזרקה והתחשמלות, הישרדות העוברים בתוך המלטה נותחה ב-E...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השליה היא מווסת עיקרי של גדילת העובר, וכאמור, שינויים בביטוי או בתפקוד של גן השליה עשויים להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר6. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן לביצוע מניפולציה ממוקדת in vivo CRISPR של שליית העכבר בגישה כירורגית מתקדמת יחסית. טכניקה זו מאפשרת יבול משמעותי של עוברים בני קיימא והשליות התואמות שלהם שניתן להשתמש בהם למחקר נוסף (איור 6A,B). השיטה הזו אפשרה לנו לבטא בהצלחה את השליה IGF-1 ב-E14.5 (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מכירים במקורות המימון הבאים: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ו-NIH T32GM145441. המחברים מודים לד"ר ואל שפילד ולמעבדות של ד"ר קלווין קרטר באוניברסיטת איווה על השימוש בחדר הניתוח ובציוד שלהם, כמו גם לד"ר אריק ואן אוטרלו, ד"ר ננדקומר נאראיאנן וד"ר מתיו ובר על עזרתם במיקרוסקופיה. המחברים מודים גם לד"ר שרה מאורר, מאיה אוונס וסרילקה קונדו על עזרתן בניתוחי הפיילוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל שפופרותUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) ב-PBSThermo Fisher ScientificJ61899.
96 באר צלחתקורנינגס3598לערכת BCA
רפידות תחתונות סופגותפישר סיינטיפיק14-206-62
בקרת הפעלה פלסמידסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-437275מים ללא דנאז המסופקים לדילול
AMV טרנסקריפטאז הפוך ניואינגלנד ביולאבסM0277Lשימוש לסינתזה cDNA
הרדמה וופייזור גזVetamacVAD-601TTVAD-קומפקטי וופורייזר
דמעות מלאכותי ג'לAkornNDC 59399-162-35
BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Fisher Scientific23227כימות חלבון
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000הומוגנייזר רקמות כף יד
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1עיבוד תמונה לתמונות FISH.
צנטריפוגה 5810EppendorfEP022628168צנטריפוגה צלחת
כלורופורםתרמו פישר מדעיJ67241-APבידוד RNA
אפליקטורים עם קצה כותנהProAdvantage77100עיקור לפני השימוש
CRISPR/Cas9 בקרת פלסמידסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-418922מים ללא דנאז המסופקים לדילול
CryoStatLeicaCM1950
דיסקציה מיקרוסקופLeicaM125 Cמשמש להדמיה לאחר נקרוסקופיה
תפרים נמסיםMed Vet InternationalJ385H
מים מזוקקיםGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) סידן; (-) מגנזיום
ECM 830 אלקטרו אלקטרופורטור (מכונת אלקטרופורציה)BTX הרווארד מכשיר45-0662גנרטור בלבד
סכין גילוח חשמליWahlCL9990
משוטי אלקטרופורציה מדעיים של קנט / פינצטהBTX הרווארד מכשיר45-0487משוטים בקוטר 3 מ"מ; חוטים כלולים
הטבעה: 250 PKGrainger21RK94קלטות הטמעת שליה
אתנולתרמו פישר מדעי268280010
מיכלי F-Air PennVeterinary Supply IncBIC80120מסנן איזופלורן עודף
צבע ירוק מהיר FCFSigmaF7252-5Gלהתמוסס ל 1 μ גרם/מ"ל ומסנן; להגן מפני אור
פוטומטר מיקרופלייט מבוסס פילטר (קורא צלחות)Fisher Scientific14377576יכול לשמש עבור BCA ו-ELISA
OcpsVWR82027-386קצות עדינים, ישר ומשונן
, ניטרלי חוצץ, 10%נימי זכוכית HT501128
- זכוכית בורוסיליקט (מיקרופיפטה)מכשירסאטרB150-86-10OD: 1.5 מ"מ, תעודת זהות: 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ
קוקטייל מעכב עצירת פרוטאז ופוספוטאז (100x)Thermo Scientific1861281מאגר הומוגניזציה של חלבון
כרית חימום ThermotechS766DDigitial Moist Heating
Pad HemostatsVWR10806-188לסת מוגמרת לחלוטין;
אמבט מים חמיםFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM פלסמיד (m1)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-421056-ACTמים ללא דנאז מסופקים לדילול
תא אינדוקציהVetamac941443אין צורך בגודל ליטר ספציפי
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
בידוד RNAאיזופרופונלי/2-פרופונליפישר סיינטיפיקA451-4
קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"לAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. מאגר הומוגניזציה של חלבון
MicroAmp™ צלחת תגובה אופטית 384 בארות עם ברקודפישר סיינטיפיק4309849לוחות ברקודים אין צורך
בקצה מיקרו-נימיEppendorf5196082001מחובר למיקרו-מזרק BTX
מיקרו-מזרקBTX מכשיר הרווארד45-0766מחזיק פיפטות נירוסטה, אורך 130 מ"מ, עבור 1 עד 1.5 מ"מ פיפטות
Microject 1000A (מכונת הזרקה)BTX מכשיר הרווארד45-0751MicroJect 1000A Plus System
חולץ מיקרופיפטה דגם P-97מכשיר סאטרP-97חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער/חום
מיקסר מיקרופלייט (שייקר צלחות)scilogex822000049999
עכבר/עכברוש IGF-I/IGF-1 ערכת קוונטיקין ELISAR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company305106 30 Gx 1/2 (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)
Nitrogen TankLinde7727-37-9כל גז אינרטי
תרופה נוגדת דלקת שאינה סטרואידית (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10אנלסגי כגון Meloxicam
NoseCone Vetamac9216099-14 מ"מ
צבע זיהוי אופל 620Akoya BiosciencesSKU FP1495001KTמשמש
לתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T) שלSakura4583
מיכל חמצןLinde7782 - 44 - 7חמצן בדרגה
רפואית PestlesUSA Scientific Inc14155390
תמיסת פובידון-יוד, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
כוח SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659שימוש עבור
בוחנים אקראיים qPCR (פריימרים אקראיים)New England BiolabsS1330Sשימוש לסינתזת cDNA
סכין גילוחGrainger26X080
RNA ערכת ניקוי & רכזZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
ערכת RNAscope v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100מכיל את כל הריאגנטים הנדרשים להכלאה פלואורסצנטית באתרה. בדיקות נמכרות בנפרד.
RNAscope ומסחר; בדיקה- MM-PRL8A8-C2אבחון תאים מתקדם  528641-C2
RNAscope ומסחר; בדיקה- Vector-dCas9-3xNLS-VP64אבחון תאים מתקדמים527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020תנור יבש למספריים הכלאה באתרו
VWR82027-578מספריים לניתוח, קצה חד, 4¹/?
נתרן כלורי (מי מלח)HospraNDC 0409-4888-03סטרילי,  0.9%
נתרן ציטראט, מלח טריסודיום, דיהידרט, [חומצת לימון, טריסודיום דיהידרט]מוצר מחקר בינלאומי03-04-6132
תרכיז נתרן הידרוקסיד 1N, פישר כימיקלפישר סיינטיפיקSS277חוצץ הומוגניזציה של חלבון
ספינת קיטורבלהB00DPX8UBA
Sterile SurgicalDrape Busse696לעקר לפני השימוש
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
Surgipath כיסוי זכוכית 24x60Leica3800160
מזרקיםBD - Becton, Dickson, and Company309659BD Luer Slip Tip מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 1 מ"ל
תרמו סיינטיפיק ומסחר; Invitrogen ומסחר; ננו-דרופ וסחר; ספקטרופוטומטר אחד עם WiFi ו-Qubit™ 4 פלואורומטרפישר סיינטיפיק13-400-525תצורה זו מגיעה עם פלואורומטר קיוביט 4.  אין צורך בכימות קיוביטים.
דבק רקמות3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. מאגר הומוגניזציה של חלבון
TRIzol™ ריאגנטתרמו פישר מדעי15596018בידוד RNA
TSA חבילת חיץ תאיםמתקדמים אבחון322810משמש לדילול צבע זיהוי אופל 620
אוניברסלי F-CircuitVetamac40200מחובר לאביזרי אידוי וופורייזר מיקרוסקופ פלואורסצנטי
מורכב זקוףאולימפוסBX61VSמשמש להדמיית FISH
Vectorshield עם DAPIVector LaboratoriesH-1200מדיית הרכבה Coverslip
ViiA ™ 7 מערכת PCR בזמן אמת עם 384 בארותThermo FisherScientific 4453536זה מיועד לזיהוי בלוקים של SYBR 384 בארות. TaqMan ו/או בלוקים קטנים יותר זמינים
לק Wet n Wild Shine, מגן ציפורניים שקוף, צבע ציפורנייםAmazonC450B
קסילזין 20 מ"ג/מ"לAnased343730_RX
AP קלטת סיגמא אולדריץ' מעוקל FISH

מקורות

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPRIn VivoIGF 1qPCR
עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.