הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה יעילה לרכישה דינמית בזמן אמת של זרמי תעלה אשלגן מגודר מתח (Kv) בקרדיומיוציטים H9c2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רישום זרם אשלגן תלוי מתח על קרדיומיוציטים H9C2 באמצעות טכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תעלות אשלגן על קרום תא שריר הלב ממלאות תפקיד חשוב בוויסות הפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא. בהיותו אחד מתעלות היונים העיקריות, תעלות אשלגן מגודרות מתח (Kv) קשורות קשר הדוק לכמה מחלות לב חמורות, כגון נזק לשריר הלב הנגרם על ידי תרופות ואוטם שריר הלב. במחקר הנוכחי, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לקבוע את ההשפעות של 1.5 mM 4-aminopyridine (4-AP, מעכב תעלות אשלגן רחב טווח) ואקוניטין (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ו- 200 μM) על זרם ערוץ Kv (I Kv) בקרדיומיוציטים H9c2. נמצא כי 4-AP עיכב את ה-I Kv בכ-54%, בעוד שההשפעה המעכבת של AC עלה-I Kv הראתה מגמה תלוית מינון (ללא השפעה עבור 25 μM, שיעור מעכב של 30% עבור 50 μM, שיעור מעכב של 46% עבור 100 μM ושיעור מעכב של 54% עבור 200 μM). בשל המאפיינים של רגישות ודיוק גבוהים יותר, טכניקה זו תקדם את חקר הקרדיוטוקסיות ואת ההשפעות הפרמקולוגיות של אתנו-רפואה המכוונות לתעלות יונים.
מבוא
תעלות יונים הן חלבונים משולבים מיוחדים המוטבעים בדו-שכבת השומנים של קרום התא. בנוכחות אקטיבטורים, המרכזים של חלבונים משולבים מיוחדים כאלה יוצרים נקבוביות הידרופיליות סלקטיביות ביותר, המאפשרות ליונים בגודל ומטען מתאימים לעבור באופן הובלה פסיבי1. תעלות יונים הן הבסיס לרגישות התאים ולביו-אלקטריות וממלאות תפקיד מפתח במגוון פעילויות תאיות2. הלב מספק דם לאיברים אחרים באמצעות התכווצויות קבועות הנובעות מתהליך עירור-כיווץ-מצומד היזום על ידי פוטנציאל פעולה3. מחקרים קודמים אישרו כי הדור של פוטנציאל הפעולה בקרדיומיוציטים נגרם על ידי השינוי בריכוז היונים התוך-תאיים, וההפעלה וההשבתה של תעלות יונים Na+, Ca2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הקרדיומיוציטים של חולדות H9c2 שהתקבלו באופן מסחרי (ראו טבלת החומרים) דוגרו ב-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת חום (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2. לאחר מכן, נעשה שימוש בטכניקת הידוק טלאי של תאים שלמים כדי לזהות את השינוייםב-I Kv בתאי H9c2 רגילים ובתאים שטופלו ב-4-AP או ב-AC (איור 1 ואיור 2).
1. הכנת פתרון
- הכינו את תרבית תאי ה-DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (ראו טבלת חומרים).
- הכן תמיסת 1.5 M 4-AP על-ידי הוספת 14.1165 מ"ג ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה איפשר הקלטה שלI Kv על פי הפרמטרים שנקבעו בטכניקת תיקון תא שלם. ה-I Kv הופעל על-ידי 150 מילישניות של גירוי דופק דה-פולריזציה מ-40+ עד +60 mV בפוטנציאל החזקה של −60 mV (איור 3A). ה-I Kv של קרדיומיוציטים של חולדות H9c2 הופיע לראשונה בסביבות −20 mV, ואז המשרעת גדלה עם דה-פולריזציה נוספת. הקשר הממוצע ביןה-I Kv לפוטנציאל הממברנה חושב מתוך משרעת הזרם שנמדדה. התוצאות הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת, משרעתה-I Kv הופחתה באופן נצפה לאחר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הטכניקה האלקטרופיזיולוגית של מהדק טלאי משמשת בעיקר לתיעוד ושיקוף הפעילות החשמלית והמאפיינים התפקודיים של תעלות יונים על קרום התא25. כיום, שיטות ההקלטה העיקריות של טכניקת מהדק הטלאי כוללות הקלטה חד-ערוצית והקלטת תאים שלמים26. עבור מצב התא כולו, מיקרואלקטרודת הזכוכית והלחץ השלילי משמשים ליצירת חותם בעל התנגדות גבוהה בין אזור קטן של קרום התא לבין קצה פיפטה27. ברגע שהלחץ השלילי המתמשך גורם לקצה הפיפטה לקרוע את קרום התא והממברנה מתחברת לדופן הפנימית של הפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130113) ומתוכנית המו"פ והטרנספורמציה המרכזית של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז צ'ינגהאי (2020-SF-C33).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | מגבר DSTDW000602 | |
| מכשיר אקסון | MultiClamp 700B | ||
| איזון אנליטי | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| זכוכית בורוסיליקט עם נימה (OD: 1.5 מ"מ, זיהוי: 1.10 מ"מ, אורך 10 ס"מ) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| צלחת תרבית תאים (100 מ"מ) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| צלחת תרבית תאים (35 מ"מ) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | גרסה 10. 5 | |
| תוכנת Clampfit | מכשירים מולקולריים, LLC. | גרסה 10. 6. 0. 13 | תוכנה לרכישת נתונים |
| D-(+)-גלוקוז | Rhawn | RH289133 | |
| מצלמה דיגיטלית | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| מדיום הנשר השונה של Dulbecco (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 2166090RP | |
| חולץ מיקרופיפטה בוער/חום | סאטר מכשיר | דגם P-1000 | |
| H9c2 תאים | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | סצ'ואן Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya טכנולוגיה כימית (שאנדונג) ושות', בע"מ | 20210221 | |
| KCl | צ'נגדו קולון כימית ושות', בע"מ | 2020082501 | |
| KOH | צ'נגדו קולון כימית ושות', בע"מ | 2020112601 | |
| MgCl2< / sub> | Tianjin Guangfu מכון מחקר כימי פיין | 20160408 | |
| MgCl2· 6H2O | צ'נגדו קולון כימית ושות', בע"מ | 2021020101 | |
| מיקרומניפולטור | מכשיר סאטר | MP-285A | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | IX73 | |
| מיקרוסקופ כיסוי זכוכית (20 ופעמים; 20 מ"מ) | ג'יאנגסו Citotest ציוד ניסיוני ושות' בע"מ | 80340-0630 | |
| Milli-Q | צ'נגדו ביו-מדע טכנולוגיה ושות', בע"מ | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B מפקד | Axon Instrument | MultiClamp מפקד 2.0 | תוכנת מגבר אותות |
| OriginPro 8 תוכנה | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (100x) | Boster ביולוגית טכנולוגיה ושות', בע"מ | 17C18B16 | |
| PH מטר | מטלר טולדו | S201K | |
| תמיסת מלח חומצה פוספט (1x) | גיבקו | 8120485 | |
| טריפסין 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
מקורות
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
