Method Article

ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים

DOI:

10.3791/64807

⸱

February 17th, 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המתאר כיצד לבודד זקיקי שחלות אנושיות מרקמת קליפת המוח שהוקפאה והופשרה כדי לבצע ניתוחי ביטוי גנים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השחלה היא איבר הטרוגני המורכב מסוגי תאים שונים. כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתרחשים במהלך folliculogenesis, לוקליזציה של חלבונים ביטוי גנים יכול להתבצע על רקמה קבועה. עם זאת, כדי להעריך כראוי את רמות ביטוי הגנים בזקיק אנושי, יש לבודד מבנה מורכב ועדין זה. לפיכך, פותח פרוטוקול מותאם שתואר בעבר על ידי מעבדתו של וודרוף כדי להפריד זקיקים (הביצית ותאי הגרנולוסה) מסביבתם. רקמת קליפת המוח השחלתית מעובדת תחילה באופן ידני כדי להשיג שברים קטנים באמצעות שני כלים: חותך רקמות ומסוק רקמות. לאחר מכן הרקמה מתעכלת אנזימטית עם 0.2% collagenase ו-0.02% DNase למשך 40 דקות לפחות. שלב העיכול הזה מבוצע ב 37 ° C ו 5% CO2 והוא מלווה pipetting מכני של המדיום כל 10 דקות. לאחר הדגירה, הזקיקים המבודדים נאספים ידנית באמצעות פיפטה מיקרוקפילרית מכויילת תחת הגדלה במיקרוסקופ. אם זקיקים עדיין נמצאים בחתיכות הרקמה, ההליך הושלם עם microdissection ידני. הזקיקים נאספים על קרח בתווך תרבית ונשטפים פעמיים בטיפות של תמיסת מלח חוצצת פוספט. הליך עיכול זה חייב להיות מבוקר בקפידה כדי למנוע הידרדרות זקיק. ברגע שנראה שמבנה הזקיקים נפגע או לאחר מקסימום של 90 דקות, התגובה נעצרת עם תמיסת חסימה של 4 מעלות צלזיוס המכילה 10% נסיוב בקר עוברי. יש לאסוף לפחות 20 זקיקים מבודדים (בגודל של פחות מ-75 מיקרומטר) כדי לקבל כמות מספקת של RNA כולל לאחר מיצוי RNA עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בזמן אמת (RT-qPCR). לאחר החילוץ, הכימות של סך הרנ"א מ-20 זקיקים מגיע לערך ממוצע של 5 ננוגרם/מיקרוליטר. לאחר מכן הרנ"א הכולל משועתק לאחור ל-cDNA, והגנים המעניינים מנותחים עוד יותר באמצעות RT-qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השחלה היא איבר מורכב המורכב מיחידות תפקודיות ומבניות, כולל הזקיקים בתוך קליפת המוח והסטרומה. פוליקולוגנזה, התהליך של הפעלת זקיקים, גדילה והבשלה ממצב שקט קדמוני לזקיק בוגר המסוגל להיות מופר ולתמוך בהתפתחות עוברית מוקדמת, נחקר רבות במחקר1. חשיפת המנגנונים המניעים תופעה זו עשויה לשפר את טיפולי הפוריות לנשים2. ניתוחים על רקמה אנושית קבועה מאפשרים הערכה של ביטוי חלבונים ולוקליזציה של גנים בתוך היחידות התפקודיות של השחלה 3,4. עם זאת, נדרשות טכניקות ספציפיות כדי לנתק את הזקיקים מקליפת המוח שמסביב כדי להעריך במדויק את רמות ביטוי הגנים בתוך זקיקי השחלות. לפיכך, במחקר קודם....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה אושר על ידי הוועדה האתית של בית החולים ארסמה (בריסל, בלגיה). המטופלת שנכללה בפרוטוקול זה עברה הקפאת רקמת שחלה (OTC) לשימור פוריות לפני החשיפה לכימותרפיה בשנת 2000. המטופלת חתמה על הסכמה מדעת בכתב לתרום את שאריות הרקמה הקפואה שלה למחקר בתום תקופת האחסון.

1. הפשרה של רקמת שחלה בהקפאה

  1. מכינים צלחת בת 6 בארות המכילה 5 תמיסות הפשרה. הבאר הראשונה מכילה 5 מ"ל של תמיסה cryoprotectant המורכבת מדיום Leibovitz-15, 0.1 mol / L סוכרוז, 1.5 mol / L dimethyl sulfoxide (DMSO), ו 1% אלבומין בסרום אנושי (HSA). הבארות הבאות מכילות 5 מ"ל של מדיום לייבוביץ-15 עם ריכוזים הולכים ופוחתים של הגנה קריופרוטקטיבית: 1 mol/L, 0.5mol/L....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הליך בידוד זה, הנסיין יכול לשלוף זקיקים מסביבת סטרומה כדי לבצע ניתוחים ספציפיים של ביטוי גנים. בהתבסס על גודל ומורפולוגיה של זקיקים, ניתן להבדיל בין השלבים השונים של folliculogenesis. הנסיין יכול לבחור זקיקים מעניינים על פי גודלם באמצעות פיפטה מיקרוקפילרית מותאמת. על ידי שימוש במיקרו-נימים של מקסימום 75 מיקרומטר, ניתן להבחין בין זקיקים ראשוניים וזקיקים ראשוניים לזקיקים משניים, אנטראליים ובוגרים. יתר על כן, הנסיין יכול לאשר את שלב הזקיק על פי מורפולוגיית הזקיק. כאשר חוקרים את הפעלת הזקיקים נבחרים זקיקים שקטים וזקי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימור בהקפאה של רקמת השחלה הוא גישה מבטיחה לשימור פוריותן של חולות סרטן. במרפאה, רקמת קליפת המוח המופשרת מושתלת בחזרה למטופלת לאחר הפוגה, ומאפשרת את חידוש תפקוד השחלות והפוריות19,20. מלבד השימוש הקליני, ניתן לתרום גם שאריות של שברי שחלות למחקר בסוף תקופת האחסון כדי לחקור את המנגנונים המווסתים את הפוליקולוגנזה. יתר על כן, רקמה זו שימושית במיוחד לפיתוח חלופות להשתלה כאשר היא אינה אפשרית, כגון מערכות תרבית חוץ גופית או שחלות מלאכותיות. עם זאת, שינויים בתוך .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מצוינות במדע (EOS) (ID: 30443682). I.D. הוא חוקר עמית ב- Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת פטרי מרושתת 2 מ"מCorning430196
2100 מכשיר ביואנלייזרAgilentG2939BA
2100 תוכנת מומחהAgilent גרסה B.02.08.SI648
צלחת 4 בארותSigma AldrichD6789
צלחת 6 בארותCarl Roth  EKX5.1
Agilent סך הכל RNA 6000 ערכת פיקוAgilent5067-1513
חומצה אסקורביתSigma AldrichA4403
מכלולי צינור שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיותSigma AldrichA5177
צנטריפוגהEppendorf5424R
קולגנאז IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript טרנסקריפט הפוך טרנסקריפטאזPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-גלוטמיןסיגמא אולדריץ'G7513
McCoy' s 5A + ביקרבונט + HepesLifeTechnologies12330-031
קוצץ רקמות McIlwainStoelting51350
מיקרו-נימי RI EZ-Tips 200 ומיקרו; mCooperSurgical7-72-2200/1
מיקרו-נימי RI EZ-Tips 75 ומיקרו; mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c תוכנת הפעלהThermoFisherגרסה 1.6
ספקטרופוטומטר NanoDropThermoFisher2000/2000c
פניצילין GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR ירוק מאסטר מיקסThermoFisherA46109
פריימרים: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
פריימרים: HPRTF: CCTGGCGTCGTCGTGATTAGATGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
פריימרים: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTCATTCTCTCTGG R: AGTCCTCTCCATGCAAGTT
QPCR בזמן אמת Quantstudio 3ThermoFisherA33779
ערכת בידוד RNA כוללת RNAqueous-microThermoFisherAM1931
סלניוםסיגמא אולדריץ'S9133
נתרן פירובטסיגמא אולדריץ'S8636
סטריאומיקרוסקופניקוןSMZ800
סטרפטומיצין סולפטסיגמא אולדריץ'S1277
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S1888
Thermo Scientific Forma Series II  מעטפת מים CO2  אינקובטוריםThermoFisher3110
תומאס סטדי-ריגס פורס רקמותתומס סיינטיפיק6727C10
טרנספריןרוש 
10652202001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gene ExpressionHuman FolliclesFollicle IsolationOvarian TissueEnzymatic DigestionGranulosa CellsRNA ExtractionRT qPCROocyte IsolationFolliculogenesis

Related Articles