מאמר שיטה

אסטרטגיות סינון מולקולות קטנות מזיהוי עופרת ועד אימות

923 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64811

⸱

20 בינואר 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

Festa, F., Labaer, J. הקרנת מעכבי קינאז במיקרו-מערכי חלבון אנושיים בהרכבה עצמית. כתב העת לניסויים חזותיים. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. מבחני פעילות מבוססי NMR לקביעת עיכוב תרכובת, ערכי IC50, פעילות מלאכותית ופעילות תאים שלמים של ריבוהידרולאזים נוקלאוזיד. כתב העת לניסויים חזותיים. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. מבחן תפוקה גבוהה לחיזוי רעילות כימית על ידי פרופיל פנוטיפי אוטומטי של Caenorhabditis elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. שימוש בהדמיה בתוכן גבוה כדי לכמת את מעורבות המטרה בתאים דבקים. כתב העת לניסויים חזותיים. 141, e58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. בדיקת לוציפראז בעלת תפוקה גבוהה להערכת פרוטאוליזה של פרוטאז בעל מחזור יחיד PCSK9. כתב העת לניסויים חזותיים. 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. שימוש במודלים של דג זברה של זיהומים בנגיף שפעת A אנושי כדי לסנן תרופות אנטי-ויראליות ולאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח. כתב העת לניסויים חזותיים. 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. הערכת עמידות למעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירת מסלולי העברת אותות על ידי מערכי נוגדנים. כתב העת לניסויים חזותיים. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. התאמה בתפוקה גבוהה למחצה של מבחן ATPase המצמד ל-NADH לסינון מעכבי מולקולות קטנות. כתב העת לניסויים חזותיים. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. פיתוח מעכבים של אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות REPLACE: יישום לתכנון ופיתוח מעכבי CDK תחרותיים שאינם ATP. כתב העת לניסויים חזותיים. 104, e52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. זיהוי מתווכים של איתות קולטני תאי T באמצעות סינון ספריות מעכבים כימיים. כתב העת לניסויים חזותיים. 143, e58946 (2019).

Takakusagi, Y. אסטרטגיית ניתוח ביו-פאנינג וביואינפורמטיקה מבוססת ביו-חיישנים לאימות גלובלי של אינטראקציות תרופה-חלבון. כתב העת לניסויים חזותיים. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. פרופיל תאי בעל תפוקה גבוהה של תרכובות פירוק חלבון ממוקדות באמצעות קווי תאים HiBiT CRISPR. כתב העת לניסויים חזותיים. 165, e61787 (2020).

מאמר מערכת

מהפכת הגנומיקה הביאה לכמות עצומה של ידע על הקשר בין הפרעה גנטית לפנוטיפים שונים של מחלות1. זה הוביל לביאור של חלבונים רבים כמטרות תרופתיות פוטנציאליות ועורר עניין בגילוי ופיתוח של תרכובות המעכבות מטרות אלה2. בהקשר זה, אסטרטגיות סינון שונות התגלו כגישות חשובות לגילוי תרכובות פגיעה, אימות מטרה, מדידת זיקות קשירה, סלקטיביות, רעילות ומעורבות מטרה בתוך התא, כמו גם תגובתיות מורכבת, יציבות ותכונות פרמקוקינטיות. אוסף זה לוכד כמה מההתקדמות המתודולוגית בתחום זה במטרה להציג מספר רב של אסטרטגיות שניתן להשתמש בהן כדי לסנן ולהעריך את הפעילות הביוכימית ו/או הביולוגית של מולקולות קטנות.

חלבון קינאז מייצג משפחת אנזימים גדולה המונה למעלה מ-500 חברים. אנזימים אלה הם מווסתים מרכזיים של כל התהליכים התאיים, ותפקודם הלקוי נקשר למחלות רבות. לכן, הם היו מוקד של עניין עז בגילוי תרופות, ובהרחבה, בפיתוח מתודולוגיה. לפיכך, ארבעה מאמרים באוסף זה מדווחים על ההתקדמות בתחום זה. Festa ואחרים מתארים פלטפורמת סינון לגילוי מעכבי קינאז המשתמשת במערכי חלבונים ניתנים לתכנות של חומצות גרעין בהרכבה עצמית (NAPPA)4. מערכים אלה מציגים קינאזות אנושיות באורך מלא ומאפשרים סינון מרובה של תרכובות על פני אוסף קינאז גדול, ובכך מאפשרים לא רק זיהוי פגיעות אלא גם סלקטיביות פרופיל. טימן ועמיתיו מתארים שיטה מבוססת מיקרו-מערך פוספו-נוגדנים שפותחה כדי לסנן שינויים ברחבי התא במצב הזרחן כקריאה של פעילות מעכב קינאז5. זה יכול להוביל לתובנות לגבי אופי המסלולים שהפכו עמידים לעיכוב, שהוא פרמטר חשוב הרלוונטי להבנת התגובה והיעילות של התרופות. צ'ן ועמיתיו מתארים בדיקת זרימה ציטומטרית לסינון אוספי מעכבי קינאז לזיהוי תרכובות המשפיעות על איתות קולטני תאי T (TCR)6. אסטרטגיה זו הובילה לזיהוי מהיר של קינאזות המעורבות באיתות TCR, מה שמצביע על הפוטנציאל שלהם כמטרות לפיתוח תרופות אימונותרפיות. לבסוף, פעילותם של קינאזות רבות מווסתת באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs), מה שמצביע על כך שתרכובות המכוונות ל-PPIs אלה עשויות להיות מעניינות. Nandha Premnath ואחרים מתארים שיטה הנקראת REPLACE (החלפה בחלופות ליגנד חלקיות באמצעות העשרה חישובית) שניתן להשתמש בה לפיתוח PPIs תחרותיים שאינם ATP של קינאזות על ידי המרת תכונות של קושרים פפטידים למולקולות קטנות המעורבות באותו משטח קשירה7.

בנוסף לקינאזות, אנזימים רבים אחרים ממלאים תפקידים במחלות והם נמשכים לגילוי תרופות. לכן, שיטות המותאמות לאנזימים שאינם קינאזות מעניינות גם הן. לדוגמה, סטוקמן ועמיתיו מתארים מבחני פעילות מבוססי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כדי לגלות ולהעריך מעכבים של נוקלאוזידים ריבוהידרולזים מהטפיל Trichomonas vaginalis8. בדיקות אלו יכולות לשמש גם לקביעת ערכי IC50 . כדי לסנן מעכבי ATPase, Radnai et al. פיתחו שיטת סינון תפוקה גבוהה למחצה המשתמשת בפורמט בדיקת אנזים מצומד הכולל שני אנזימים (פירובט קינאז ולקטט דהידרוגנאז) שבסופו של דבר מתרגם את פעילות ATPase לפלואורסצנטיות פנימית של ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (NADH) כקריאה9. בניגוד לכל האנזימים שתוארו עד כה שהם תהליכיים ומזרזים שלבים מרובים, פרופרוטאין המרה סובטיליזין/קקסין סוג 9 (PCSK9) הוא פרוטאז בעל מחזור יחיד המעוכב על ידי הסובסטרט שלו. זה הופך את הבדיקה למעכבי PCSK9 למאתגרת, ו-Chorba et al. מתארים שיטה מבוססת תאים בעלת תפוקה גבוהה המקשרת את פעילות המחשוף של PCSK9 לפעילות הלוציפראז המופרש כקריאה, ובכך מאפשרת בדיקה למעכבים10.

בנוסף למציאת תרכובות המעכבות את פעילותן של מטרות שונות, מבחנים המאשרים כי התרכובת מפעילה את המטרה המיועדת שלה בתאים, מעוררים גם הם עניין רב. אקסלסון ועמיתיו מתארים אסטרטגיה לאימות מעורבות מטרה בתאים נצמדים המבוססת על שילוב הדמיה בעלת תוכן גבוה על ידי נוגדנים אימונו-פלואורסצנטיים ובדיקת הסטה תרמית תאית (CETSA)11. בדיקה זו משתמשת באתגר חום איזותרמי לתאים שטופלו באוסף תרכובות גדול כדי לזהות תרכובות מייצבות. שיטה שיכולה להעריך את מעורבות המטרה והפעילות של מולקולות מפרקות שפותחה על ידי ריצ'ינג ואחרים, משתמשת בטכנולוגיית תיוג HiBiT/LgBiT כדי לייצר חלבון זוהר ולנטר פרמטרים של פירוק באמצעות ירידה בזוהר12. לבסוף, Takakusagi ואחרים מתארים שיטה לאימות אינטראקציות חלבון-תרופות המבוססת על שימוש בתצוגות פפטיד מבוססות פאג'ים כדי לסנן קשירה בין מוטיבים של פפטידים קושרי תרופות ומולקולות קטנות13. מסך התצוגה הפפטידי משולב עם ניתוח ביואינפורמטי כדי לאמת את קשירת המטרה.

שכבה נוספת של אימות מולקולות קטנות היא אפיון ההשפעות שלהן במודלים של בעלי חיים. אוסף זה כולל שתי שיטות כאלה, האחת משתמשת במודלים של דג זברה (Danio rerio) של זיהום בנגיף שפעת A אנושי כדי להעריך את היעילות של תרכובות בעלות פעילות אנטי-ויראלית, כמו גם את התגובה החיסונית של המארח14, ואחרת המשתמשת ב-Caenorhabditis elegans כמודל לפרופיל רעילות תרכובות15. שני המחקרים הללו מדגישים את הצורך בשיטות אופטימליות שיכולות להעריך יעילות ורעילות in vivo.

לסיכום, גילוי ופיתוח תרופות הם תהליכים אדירים עם צווארי בקבוק רבים, אתגרים וסבירות גבוהה לכישלון. בנוסף, נטל התחלואה המתמשך, בין אם זה בתחום המחלות הזיהומיות שבו מספר הפתוגנים העמידים לתרופות גדל בקצב מדאיג או באזורים של שכיחות הולכת וגוברת של מחלות כרוניות ומחלות הקשורות להזדקנות האוכלוסייה, דורש את תשומת הלב והפעולה הממוקדות שלנו. אוסף זה מדגיש מספר שיטות שמטרתן להאיץ את גילוי, אימות ואפיון התרופות. במבט קדימה, אנו מצפים לראות חידושים נוספים בתחום זה, במיוחד אלה שמטרתם לשפר את תפוקת ההקרנה, להגדיל את מגוון הספריות הכימיות ולפתח מודלים in vivo התואמים להקרנה בתפוקה גבוהה (HTS). יתר על כן, זרימות עבודה המספקות ראייה הוליסטית של עוצמה, סלקטיביות, ספציפיות, יעילות ורעילות בקנה מידה מהיר וקטן יותר יכולות להיות מאפשרות במיוחד.

גילויים

מ.ק. הוא יועץ בתשלום לעורכי מדעי החיים.

תודות

M.K. נתמך בחלקו על ידי NCI T32 CA236754.

מקורות

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

מאמרים קשורים