Method Article

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

DOI:

10.3791/64848

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  , 
1Office of Science and Engineering Laboratories, Center for Devices and Radiological Health, U.S. Food and Drug Administration

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מדגימים שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CM), מצופות על מצע גמיש, יחד עם מיקרוסקופ מבוסס וידאו. כלי זה יהיה שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות התכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה לבבית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) נחקרים כעת עבור יישומי מבחנה מרובים ושימשו בהגשות רגולטוריות. כאן, אנו מרחיבים את השימוש בהם להערכות בטיחות או ביצועים של מכשירים רפואיים לבביים. פיתחנו שיטה חדשנית להערכת תכונות התכווצות של מכשור רפואי לבבי בחד-שכבות hiPSC-CMs דו-ממדיות המתכווצות על מצע הידרוג'ל גמיש מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM). כלי זה מאפשר לכמת את ההשפעות של אותות מכשיר אלקטרופיזיולוגיה לבבית על תפקוד הלב האנושי (למשל, תכונות התכווצות) באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM גודלו בתרבית במשך 2-4 ימים על מצע הידרוג'ל גמיש בפורמט של 48 בארות.

ה-hiPSC-CMs נחשפו לאותות חשמליים סטנדרטיים של אפנון התכווצות הלב (CCM) של מכשירים רפואיים והושוו לבקרה (כלומר, קצב בלבד) hiPSC-CMs. תכונות ההתכווצות הבסיסיות של hiPSC-CMs הדו-ממדיים כומתו על ידי ניתוח זיהוי מבוסס וידאו המבוסס על תזוזת פיקסלים. hiPSC-CMs דו-ממדיים מגורה CCM המצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש הציגו תכונות כיווץ משופרות באופן משמעותי ביחס לקו הבסיס (כלומר, לפני גירוי CCM), כולל משרעת התכווצות שיא מוגברת וקינטיקה מואצת של כיווץ והרפיה. יתר על כן, השימוש במצע ההידרוג'ל הגמיש מאפשר ריבוב של קריאות צימוד התכווצות בעירור לב מבוססות וידאו (כלומר, אלקטרופיזיולוגיה, טיפול בסידן והתכווצות) ב- hiPSC-CMs בריאים וחולים. הזיהוי והכימות המדויקים של ההשפעות של אותות אלקטרופיזיולוגיים לבביים על התכווצות הלב האנושית חיוניים לפיתוח, אופטימיזציה והפחתת סיכונים של מכשור רפואי לבבי. שיטה זו מאפשרת הדמיה חזקה וכימות של תכונות ההתכווצות של סינציציום הלב, אשר אמור להיות בעל ערך עבור בדיקות בטיחות או יעילות של מכשור רפואי לב לא קליני. מאמר זה מתאר, בפירוט, את המתודולוגיה ליצירת 2D hiPSC-CM hydrogel substrate monolayers.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ככל שאוכלוסיית ארצות הברית מזדקנת, מספר חולי אי ספיקת הלב ממשיך לעלות, יחד עם העלויות הרפואיות הישירות 1,2. יש צורך קריטי לפתח טיפולים חדשניים לטיפול באי ספיקת לב ומתודולוגיות לא קליניות חדשניות לבדיקת טיפולים כאלה. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) הוצעו ככלי במבחנה כדי לסייע בתהליך הפיתוח הטיפולי ושימשו בהגשות רגולטוריות 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב בהם הוגבל למחקרי התכווצות בשל היעדר תכונות כיווץ חזקות כאשר הם מצופים בתנאי תרבית דו-ממדית קשיחים סטנדרטיים (כלומר, תרבית רקמה קונבנציונלית פלסטיק או זכוכית)5,6,7,8. הדגמנו בעבר את התועלת של ציפוי hiPSC-CMs בודדים בודדים על מצע הידרוג'ל גמיש כדי ליצור תכונות כיווץ גלויות חזקות9. הראינו כי hiPSC-CMs מבודדים הם בעלי תכונות התכווצות דומות לאלה של קרדיומיוציטים חדריים של ארנב בוגר שבודד טרי. יתר על כן, הדגמנו את התועלת של שיטה זו להערכת תגובות התכווצות לסוכנים פרמקולוגיים7. יתר על כן, מחקרים אחרים יישמו טכנולוגיה זו להערכות מכניסטיות עבור מדע בסיסי ומודלים של מחלות10,11,12. כאן, מתודולוגיה זו הורחבה לחד-שכבות דו-ממדיות hiPSC-CM, והתועלת שלה בהערכת אותות חשמליים של מכשירים רפואיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית (CCM) של מכשירים רפואיים במבחנה מודגמת.

CCM הוא טיפול באי ספיקת לב תוך לבבית שבו אותות אלקטרופיזיולוגיים לא מעוררים מועברים לשריר הלב במהלך תקופת העקשנות המוחלטת של מחזור הלב13,14. שיטות ניתנות לשחזור להערכת CCM במודלים של תאי לב אנושיים חסרות. עבודות קודמות השתמשו במודלים שונים של תאי לב כדי להעריך את תגובת ההתכווצות של CCM. הדגמנו במבחנה כי קרדיומיוציטים חדריים של ארנבים שבודדו זה עתה מגיבים לגירוי CCM על ידי עלייה חולפת בסידן ומשרעת התכווצות15. מחקר נוסף בקרדיומיוציטים חדריים של כלבים מבודדים הדגים שיפור כתוצאה מ-CCM של משרעת הסידן החולפת התוך-תאית16. עם זאת, רוב מחקרי CCM השתמשו בתכשירים של בעלי חיים מסוג ex vivo ו-in vivo. קשה לקשר בין מחקרים אלה מכיוון שהם מיישמים מגוון פרמטרים של דופק CCM ומינים17. מחקר אחד במודל פפילרי ארנב מבודד גילה התכווצות מוגברת הנגרמת על ידי CCM 8,18, ומערך של מחקרי לב שלם הדגימו שיפור המושרה על ידי CCM של תפקוד התכווצות19,20,21. מחקרים אלה סיפקו תובנה מכניסטית חשובה. עם זאת, קיים מחסור במודלים אנושיים הניתנים לשחזור עבור מחקרי EP התכווצות לב חוץ גופית, כולל CCM. לשם כך, פיתחנו מספר מודלים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של hiPSC והדגמנו שיפור הנגרם על ידי CCM של תכונות כיווץ באופן תלוי פרמטרים. יתר על כן, ההשפעות האינוטרופיות המושרות על ידי CCM נמצאו מתווכות בחלקן על ידי קלט עצבי ואיתות β-אדרנרגי 8,17,22. עם זאת, יש לדעת יותר על המנגנונים של טיפול CCM, ושימוש בקרדיומיוציטים אנושיים מתכווצים יכול לסייע בהשגת תוצאה זו. לפיכך, יש צורך משמעותי לפתח כלים אנושיים לא קליניים להערכת התקנים ואותות CCM חדשניים, להאיץ את תהליך הרגולציה, להפחית את הנטל על מודלים של בעלי חיים ולסייע למפתחי מכשירים לקבל החלטות 8,17,23,24. חשוב לפתח פרוטוקולים קלים של עשה זאת בעצמך שניתן להעביר לכל מעבדה והמשתמשים בציוד סטנדרטי ובדרישות תאים נמוכות כדי להפחית את העלויות. שיטה זו מבהירה את ההשפעות של גירוי CCM על תפקוד קרדיומיוציטים אנושיים ומספקת תובנות חשובות על בטיחות או יעילות CCM17. כאן, אנו מתארים את השיטה ליצירת חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות על מצע הידרוג'ל גמיש כדי לייצר כלי לא קליני סטנדרטי לכימות תגובות התכווצות של אלקטרופיזיולוגיה חריפה של הלב (כלומר, CCM) בבריאות ובחולי.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת הצלחות והמדיה

הערה: אליציטוט הידרוג'ל טיפוסי מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM) הוא ~ 200 μL בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל המאוחסן ב -20 ° C.

  1. בתרבית רקמה סטרילית מכינים צלחת סטרילית בעלת 6 בארות על ידי העברת 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין (טבלת חומרים) לכל באר. מניחים את המכסה על צלחת 6 בארות, ומאפשרים לצלחת המצופה לדגור ב 37 ° C למשך מינימום של 1 שעות.
  2. יום אחד לפני זריעת hiPSC-CMs על מצע הידרוג'ל גמיש, להפשיר aliquot הידרוג'ל (טבלה של חומרים) במקרר על קרח.
  3. הכן את המדיום cardiomyocyte (טבלה של חומרים) על ידי ערבוב 500 מ"ל של RPMI 1640, 10 מ"ל של 50x B-27 מוסף, ו 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין9.

2. זריעה של hiPSC-CMs שמורים בהקפאה

  1. יומיים לפני זריעת hiPSC-CMs על מצע ההידרוג'ל הגמיש, יש לצלחת מראש את hiPSC-CMs על צלחות סטריליות 6 בארות מצופות ג'לטין 0.1%. הפשירו את hiPSC-CMs באמצעות פרוטוקול הפשרה סטנדרטי 9,25.
  2. לאחר מכן, צלחת 1,500,000 hiPSC-CMs (טבלת חומרים) לכל באר בהתאם להוראות היצרן (איור 1A)26.
  3. תרבית את hiPSC-CMs בתווך קרדיומיוציטים סטנדרטי במשך 2-4 ימים כדי לאפשר hiPSC-CMs להתאושש מההקפאה ב 37 ° C ו 5% CO2. רענן את המדיום בילה עם 100% cardiomyocyte בינוני כל 48 שעות.

3. דיסוציאציה וספירה של hiPSC-CMs מצופים מראש

  1. בדוק את המצב של hiPSC-CMs לפני דיסוציאציה. להעריך את הבריאות של hiPSC-CMs, הבטחת כדאיות פעימות יציבות.
    הערה: טוהר אוכלוסיית hiPSC-CM חשוב (למשל, >90% טרופונין T לבבי)7. שיטת בחירת קרדיומיוציטים (למשל, בחירה מטבולית או מיון) מומלצת כדי להפחית את ההפרעה של מצע הידרוג'ל על ידי תאים שאינם קרדיומיוציטים25,26.
  2. שטפו את hiPSC-CMs 2x עם 4 מ"ל לכל באר של D-PBS ללא CaCl 2 או MgCl2 (טבלת חומרים). לשאוף את D-PBS, להוסיף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה בטמפרטורת החדר לכל באר, ולאחר מכן לדגור במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  3. הוסף 10 מ"ל של מדיום קרדיומיוציטים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.
  4. נתקו את hiPSC-CMs מהלוח בעל 6 הקידוחים בעזרת פיפטה של 1,000 μL (איור 1B). הוסף את תרחיף התא לצינור החרוטי 15 מ"ל26.
  5. לשטוף את הבאר עם 1 מ"ל של מדיום cardiomyocyte טרי כדי לאסוף כל hiPSC-CMs שיורית, ולהוסיף אותם צינור חרוטי 15 מ"ל. הביאו את הנפח הסופי של הצינור החרוטי ל -15 מ"ל.
  6. צנטריפוגה למשך 5 דקות (200 × גרם). הסר את supernatant עד סימן 1 מ"ל. להשעות מחדש את התאים במדיום קרדיומיוציטים לנפח סופי של 5 מ"ל.
  7. ספור את hiPSC-CMs עם מונה תאים ידני או אוטומטי.
  8. יש לדגור על מתלה hiPSC-CM בטמפרטורת החדר בזמן הכנת מצעי ההידרוג'ל הגמישים (30 דקות לכל היותר).

4. הכנת מצעי ההידרוג'ל הגמישים

  1. הכינו פיפטה של 20 μL בטמפרטורה של 1 μL, קצוות פיפטה של 20 μL (למשל, 20 μL), וצלחת תחתונה סטרילית מזכוכית עם 48 בארות. ודא כי סטופר / טיימר מוכן לפני ביצוע מצעי הידרוג'ל.
  2. במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית, ערבבו את מצע ההידרוג'ל מבוסס ECM על ידי הקשה עדינה על הצינור, ומיד הניחו אותו בחזרה על קרח.
  3. לאחר מכן, הפעל את שעון העצר / טיימר מיד לפני שמצע ההידרוג'ל הראשון מצופה - זהו זמן אפס.
  4. פיפטה 1 μL של מצע הידרוג'ל למעלה ולמטה ~ 3x כדי לקרר את קצה פיפטה. מרחו ~1 μL של מצע ההידרוג'ל הלא מדולל אופקית על תחתית כל באר של צלחת 48 הקידוחים (איור 1C, איור 2A ואיור 3A), והחזיקו את הפיפטה בזווית של 45°. לוחמו את כל מצעי ההידרוג'ל באותו כיוון בכל באר (איור 2 ואיור 3) כדי לסייע בזיהוי המצע בעת ביצוע הניסויים בהגדלה של פי40 7,9,17,27.
    הערה: כל קו ~1 μL הוא מצע הידרוג'ל אחד (איור 3). בדרך כלל, לוקח ~ 5 דקות להכין 48 בארות. השימוש במעמד מיקרו-פלטה מוטה אופקית (למשל, 30°) עשוי לאפשר תצוגה טובה יותר של תחתית הבאר ומצע ההידרוג'ל. הקפד ללכת לכל אורך הבאר (כלומר, משמאל לימין). מצעי הידרוג'ל קצרים עלולים להיות עבים מדי, ובכך להפחית את יציבות המצע. אין לאפשר למצע ההידרוג'ל להתייבש בקצה הפיפטה. במקרה כזה, עבור במהירות לעצה חדשה והמשך מיד. לחלופין, ניתן להשתמש בקצוות פיפטה צוננים. מצע הידרוג'ל מבוסס ECM עשוי להתפלמר במהירות כאשר הוא אינו על קרח. מומלץ להכין כמה בארות בכל פעם (למשל, 10). בנוסף, מומלץ להתאמן בצלחת מדומה של 48 בארות.
  5. הניחו את המכסה על צלחת 48 הקידוחים, ואפשרו למצעי ההידרוג'ל לדגור במשך 8-10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית לפני הוספת התאים (איור 2B).
    הערה: חשוב להקפיד על זמני הדגירה המוצעים. זמן דגירה של יותר מ-10 דקות יוביל למצעי הידרוג'ל נוקשים וללא התכווצויות נראות לעין. זמן דגירה של פחות מ-8 דקות עלול להוביל לקריסת מצעים.
  6. זרעו מיד את hiPSC-CMs ישירות על מצעי ההידרוג'ל, עם ~30,000 hiPSC-CMs בני קיימא לכל באר בנפח בינוני נמוך של ~200 μL של תווך קרדיומיוציטים, באמצעות פיפטה של 1,000 μL (איור 2B ואיור 3B).
    הערה: תהליך זה עוצר את פילמור מצע ההידרוג'ל ומבטיח שה-hiPSC-CMs נמצאים על המצע 7,9,17,27.
  7. הניחו את המכסה על הצלחת, ואפשרו ל-hiPSC-CMs לדגור ללא הפרעה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2C) במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית כדי לאפשר ל-hiPSC-CMs להיצמד למצע ההידרוג'ל.
  8. הוסף בעדינות ~ 100 μL של מדיום קרדיומיוציטים טרי לכל באר (נפח סופי: ~ 300 μL לכל באר). מניחים את המכסה על הצלחת, ומעבירים לאינקובטור ב 37 ° C, 5% CO 2 במשך2-4 ימים. רענן את המדיום 100% כל 24 שעות לפני ביצוע ניסויי ההתכווצות.
    הערה: בדוק חזותית את hiPSC-CMs עבור המורפולוגיה הנכונה; מיד לאחר הציפוי, hiPSC-CMs אמורים להופיע עגולים (איור 3B). ביום השני לאחר הזריעה, ייצפה סינקיטיום חד-שכבתי דו-ממדי hiPSC-CM (איור 3C) (וידאו משלים S1) עם כיווץ גלוי חזק (וידאו משלים S2).

5. רישום וניתוח התכווצות

  1. הכינו את מדיום בדיקת CCM, שהוא הפתרון של Tyrode המכיל את הדברים הבאים (ב-mmol / L): CaCl 2 0.5, NaCl 134, KCl 5.4, MgCl2 1, גלוקוז 10 ו-HEPES 10, כאשר ה-pH מותאם ל-7.4 עם NaOH, ושיווי משקל ל-37°C באמבט מים.
    הערה: סידן חוץ-תאי תת-מרבי (0.5 מילימול) משמש לשיפור חלון הבדיקה של CCM.
  2. הפעל את המיקרוסקופ ואת תא הבקרה הסביבתית כדי לאזן ל 37 ° C ו 5% CO2.
  3. הסר את מדיום קרדיומיוציטים מהצלחת של 48 בארות, ושטוף בעדינות כל באר פעמיים עם 600 μL של מדיום בדיקת CCM.
  4. הוסף 300 μL של מדיום בדיקת CCM לכל באר, והניחו את צלחת 48 הבארות על המיקרוסקופ בתא הבקרה הסביבתי. הכנס את האלקטרודות, ואזן את התאים למשך 5 דקות.
  5. השתמש במיקרוסקופ מבוסס וידאו כדי להקליט את סרטוני ההתכווצות. פתח את תוכנת הקלטת הווידאו והגדר קצב פריימים של 100 פריימים לשנייה. בחר אזור עניין (ROI) ליד מרכז השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM.
    הערה: אל תבחר החזר השקעה קרוב לקצה של חד-שכבות hiPSC-CM מכיוון שהדבר עלול להיות לא יציב עבור הקלטות כיווץ.
  6. לאחר מכן, השדה מגרה את התאים באמצעות מחולל פולסים מסחרי (Table of Materials) כדי לקצב חשמלי את החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM. קצב את hiPSC-CMs בסף של 1.5x ב- 1 הרץ עם פרמטרי פולס בסיסיים (לדוגמה, פעימות קצב גל מרובע מונופאזי עם משך פעימת גירוי של 2 אלפיות השנייה של ~ 14 V / cm)17.
  7. הקלט את קו הבסיס, קצב רק (כלומר, לפני CCM) (איור 1D) וידאו כיווץ במשך לפחות חמש פעימות17,28.
  8. לאחר מכן, עוררו את השכבה החד-שכבתית hiPSC-CM באמצעות אות חשמלי ניסיוני (איור 1D). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים של גירוי CCM: שני פולסים דו-פאזיים סימטריים של משך פאזה של 5.14 מילישניות (משך כולל של 20.56 אלפיות השנייה), ~28 וולט/ס"מ (משרעת פאזה), מרווח בין פאזות אפס והשהיה של 30 מילישניות (כלומר, זמן מסוף פולס הקצב ועד תחילת פולס CCM) (איור 1D)29,30 ולהקליט את סרטון ההתכווצות המושרה על ידי CCM במשך חמש פעימות לפחות.,
  9. כבה את אות CCM, עורר עם דופק קצב בסיסי, והקלט סרטון התכווצות של תקופת ההתאוששות (כלומר, לאחר CCM) למשך חמש פעימות לפחות.
  10. השתמש בתוכנת כיווץ סטנדרטית כדי לנתח באופן אוטומטי את סרטוני ההתכווצות ולכמת את תכונות ההתכווצות העיקריות (לדוגמה, משרעת ההתכווצות, שיפוע ההתכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90% ומשך ההתכווצות 50%)7,17,31,32.
  11. השתמש ב- hiPSC-CMs הדו-ממדיים על מצע ההידרוג'ל הגמיש לניסויי כיווץ מימים 2-14 לאחר ציפוי על המצע.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתואר בפרוטוקול זה הוא כלי פשוט וחזק ליצירת מונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות באופן גלוי על מצע הידרוג'ל גמיש. מדידת תכונות ההתכווצות מתבצעת באמצעות הקלטה מבוססת וידאו בשילוב עם תוכנה לניתוח התכווצות. זה מאפשר לכמת פרמטרים מרכזיים של התכווצות קרדיומיוציטים, כולל משרעת התכווצות, שיפוע התכווצות, שיפוע הרפיה, זמן לשיא, זמן לקו הבסיס 90%, ומשך התכווצות 50%. המודל משמש לאפיון תכונות ההתכווצות הבסיסיות של hiPSC-CMs (איור 4) מתורמים "בריאים" שונים, וניתן להרחיב אותו להערכת אותות של אלקטרופיזיולוגיה של הלב של מכשירים רפואיים (כלומר, CCM). היישום של פרמטרי גירוי CCM סטנדרטיים (איור 1D)29,30 הביא לתכונות כיווץ משופרות במבחנה (איור 5 וטבלה 1)17.

עוד הדגמנו שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את ההשפעות של אפנון ריכוזי סידן חוץ-תאיים על תכונות ההתכווצות האנושיות עם וללא גירוי CCM (איור 6)17. התלות הבסיסית הצפויה בסידן של התכווצות נצפתה 7,17, כמו גם עלייה הנגרמת על ידי CCM ברגישות לסידן ברמה של חד-שכבה קרדיומיוציטים. נוסף על כך, החקירה הפרמקולוגית של מסלול האיתות ה-β-אדרנרגי (איור 7) גילתה שההשפעות האינוטרופיות המושרות על-ידי CCM מתווכות בחלקן על-ידי איתות β-אדרנרגי17. יתר על כן, ניתן להרחיב כלי זה לקרדיומיוציטים ספציפיים למחלה ספציפית לחולה, כולל אלה של קרדיומיופתיה מורחבת (DCM)33,34,35 (איור 8), כדי להבין את ההשפעה של CCM בהקשר של מצבי מחלה; ואכן, משרעת התכווצות משופרת וקינטיקה מואצת של כיווץ והרפייה נצפו ב"מינון" CCM שנבדק כאן (איור 8). בעוד שיש לנו מכשיר מחקה CCM במעבדה שלנו, המתודולוגיה המשמשת כאן אינה ספציפית למערכת זו וניתן ליישם אותה על מכשירי אלקטרופיזיולוגיה אחרים של הלב.

figure-results-1
איור 1: סיכום סכמטי של מודל hiPSC-CM במבחנה דו-ממדי CCM. (A) hiPSC-CMs מצופים מראש בפורמט חד-שכבתי על לוחות 6 בארות מצופי ג'לטין (0.1%). (B) לאחר יומיים בתרבית, hiPSC-CMs מנותקים ומוכנים לציפוי על מצע הידרוג'ל גמיש. (C) ה-hiPSC-CMs המבודדים מצופים בצפיפות גבוהה על מצעי הידרוג'ל המסודרים בפורמט של 48 בארות (משמאל) ונבדקים בתמיסת סידן טירוד חוץ-תאית (0.5 מילימטר) (מימין). (D) מחולל דופק מסחרי ופרמטרים סטנדרטיים של דופק CCM קליני29,30 (מימין) משמשים לגירוי hiPSC-CMs; תפקוד הלב מוערך על ידי ניתוח מבוסס וידאו (משמאל). (E) רישומי התכווצות מייצגים לפני CCM (קו בסיס: 5 V), במהלך CCM (CCM: 10 V), ואחרי CCM (התאוששות: 5 V). איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סכמה של ציפוי וזריעה של מצע הידרוג'ל גמיש. (A) מצע הידרוג'ל מופשר לחלוטין, לא מדולל מבוסס ECM מוחל על צלחת סטרילית של 48 בארות (פאנל שמאלי), עם 1 מיקרוליטר של מצע הידרוג'ל לכל באר (פאנל ימני). (B) מצע ההידרוג'ל מורשה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 8-10 דקות (פאנל ימני), ולאחר מכן ציפוי hiPSC-CMs בצפיפות גבוהה בנפח בינוני נמוך (~200 μL) (פאנל שמאלי). (C) לאחר 10-15 דקות של דגירה, מתווסף מדיום לכל באר (פאנל שמאלי), והלוחות מועברים לאינקובטור תרבית רקמה סטנדרטי (פאנל ימני). קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית, hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם; RT = טמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מצע הידרוג'ל חוץ-תאי מבוסס מטריצה. (A) מצע הידרוג'ל מייצג (ללא תאים) בבאר אחת של פלטת זכוכית תחתונה בת 48 בארות מיד לאחר החלת המצע על הבאר. (B) זמן 0 לאחר זרע hiPSC-CMs. (C) זמן 24 שעות לאחר זריעת hiPSC-CMs. לוח זה הודפס מחדש מתוך Feaster et al.17. החיצים הלבנים מציינים את קצה מצע ההידרוג'ל, הגדלה פי 4. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. קיצור: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אפיון תכונות ההתכווצות החד-שכבתיות הדו-ממדיות hiPSC-CM. (A) רישום התכווצות מייצג של hiPSC-CMs דו-ממדיים בקצב של 1 הרץ (5 V). (B) עקבות התכווצות מייצגים המתארים מחזור התכווצות אחד. (C) תרשימי עמודות סיכום. הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 18. קיצור: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: השפעה חריפה של CCM על תכונות ההתכווצות הדו-ממדיות hiPSC-CM. (A) רישום התכווצות מייצג לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5 V). (B) עקבות התכווצות מייצגות של ההשפעות המיידיות (כלומר, פעימת CCM אחרונה לפני פעימת CCM, פעימת CCM ראשונה ופעימת CCM ראשונה, מסומנת על ידי +). (C) גרפים מסכמים של ההשפעות המיידיות. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ההשפעה של אפנון סידן חוץ-תאי על תגובת CCM. (A) עקבות התכווצות מייצגות של ההשפעות המיידיות עבור כל קבוצה לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5 V); hiPSC-CMs נחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של סידן חוץ-תאי (Cao) של 0.25-2 מילימול. (ב-ד) נתונים שהשתנו (סיגמואידלים) כדי להנחות את העין המדגימים את ההשפעה של CCM על רגישות הסידן של תכונות ההתכווצות (כלומר, המשרעת והקינטיקה ) (שיפוע גבעה = 1.0). n = 6-8 לקבוצה. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
תרשים 7: אתגר פרמקולוגי. עקבות התכווצות מייצגות עבור כל קבוצה לפני CCM (5 V), במהלך CCM (10 V) ואחרי CCM (5V); hiPSC-CMs טופלו מראש עם (A) רכב או (B) metoprolol (2 מיקרומטר). (ג,ד) תרשימי עמודות סיכום עבור כל תנאי. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 10 לכל קבוצה. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. איור זה הודפס מחדש על ידי Feaster et al.17. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: השפעה חריפה של CCM על תכונות ההתכווצות של hiPSC-CMs דו-ממדיים חולים. (A) מעקב התכווצות מייצג עבור DCM L35P, קו בסיס בקרה (לפני, 6 V), ו-DCM L35P בתוספת CCM (10 V). (B) תרשימי עמודות סיכום. אחוז שינוי, הנתונים ממוצעים ± SEM. n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01. קיצורים: hiPSC-CM = קרדיומיוציטים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם; CCM = אפנון התכווצות הלב; DCM = קרדיומיופתיה מורחבת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים S1: Timelapse של hiPSC-CMs על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית. hiPSC-CMs דו-ממדיים מצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש; זמן: 0-90 שעות; באר אחת של צלחת תחתונה מזכוכית 48 בארות; הגדלה פי 4. hiPSC-CMs יוצרים סינקיטיום חד-שכבתי אופקי (כלומר, משמאל לימין). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

וידאו משלים S2: hiPSC-CMs על הידרוג'ל מבוסס מטריצה חוץ-תאית. hiPSC-CMs דו-ממדיים מצופים על מצע ההידרוג'ל הגמיש; זמן: ~ 24 שעות; באר אחת של צלחת תחתונה מזכוכית 48 בארות; הגדלה פי 4. hiPSC-CMs יוצרים מורפולוגיה חד-שכבתית ומראים התכווצות חזקה ב~24 שעות לאחר הציפוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. סרטון זה לקוח מתוך התוכנית Feaster et al.17. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

פרמטרCCMאחרי
משרעת16 ± 4%**4 ± 5%
הגיע הזמן להגיע לשיא של 50%-20 ± 9%*7 ± 5%
הגיע הזמן להגיע לשיא של 90%-22 ± 8%*6 ± 5%
זמן לבסיס 50%-8 ± 5%4 ± 4%
זמן בסיסי 90%-12 ± 6%*5 ± 5%
משך התכווצות 10%-13 ± 6%3 ± 5%
משך התכווצות 50%-6 ± 5%3 ± 5%
משך התכווצות 90%0 ± 5%3 ± 4%
N2323

טבלה 1: תכונות התכווצות. אחוז שינוי ביחס לפני CCM (5 V); הנתונים ממוצעים ± SEM עבור כל הפעימות בכל קבוצה במהלך CCM (10 V) ולאחר CCM (5 V). n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. טבלה זו הודפסה מחדש מ-Feaster et al.17.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה ליצירת מונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות בחוזקה על מצע הידרוג'ל גמיש מבוסס מטריצה חוץ-תאית (ECM) עם ריאגנטים מסחריים 7,17. hiPSC-CMs שנזרעו על מצע ההידרוג'ל הגמיש נשארים בני קיימא ויש להם תכונות כיווץ משופרות7. טכניקה זו מסתמכת על ציוד מעבדה סטנדרטי ויכולות7. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול, כולל ביחס לעבודה עם מצע הידרוג'ל מבוסס ECM, הדורשים תשומת לב קפדנית לפרטים. בעיה פוטנציאלית אחת היא נוכחות של סרום בתווך. זה עלול לגרום לרשתות hiPSC-CMs ליצור רשתות (למשל, רשתות אנדותל/כלי דם) במקום יריעה חד-שכבתית מתמזגת; לפיכך, מדיום ללא סרום מומלץ במהלך הקמת מונושכבות הידרוג'ל hiPSC-CM גמישות (כלומר, יום 0 עד יום 4). כמו כן, הכנת יותר מדי מצעי הידרוג'ל בו זמנית עלולה לגרום למצעים גרועים או לא אחידים עקב עייפות המפעיל. בעוד שחשוב לעבוד במהירות, שלמותו של כל מצע הידרוג'ל היא קריטית. באופן דומה, יש לזרוע בזהירות את hiPSC-CMs ולשנות את המדיום; אין לעשות זאת בכוח. בעת שינוי המדיום, יש להוסיף אותו בעדינות מהקצה העליון של הבאר כדי לא להפריע למצע ההידרוג'ל או לתאים. בדומה לתרביות hiPSC-CM דו-ממדיות סטנדרטיות (כלומר, תרבית רקמה קונבנציונלית פלסטיק או זכוכית), ציפוי בצפיפות נמוכה יגרום להיווצרות חד-שכבתית לא שלמה. חשוב לבדוק ויזואלית את hiPSC-CMs כדי לוודא שהם נמצאים על מצע הידרוג'ל ולהשתמש בטיימר כדי להבטיח תזמון מדויק. יתר על כן, גידול החד-שכבות הדו-ממדיות hiPSC-CM במשך יותר מ-14 יום על מצע ההידרוג'ל עלול לגרום להפרעה חד-שכבתית, בהתבסס על תכונות ה-ECM והוראות יצרן המצע.

ישנן מספר מגבלות לשיטה הנוכחית שיש לקחת בחשבון. ראשית, התאים המשמשים בפרוטוקול זה היו מספקים מסחרי hiPSC-CMs, ותאים אלה יוצרים סינציטיום של תאים מצומדים חשמלית. הסינקיטיום מכיל תערובת של hiPSC-CMs מכל שלושת תת-הסוגים של הלב (כלומר, חדרי, פרוזדורי ונודלי)17. מחקרים עשויים להפיק תועלת מאוכלוסיית hiPSC-CM בלעדית לתת-סוג (כלומר, 100% חדרית או 100% פרוזדורית). שנית, שיטה זו השתמשה רק hiPSC-CMs, בעוד שאינם מיוציטים, כולל פיברובלסטים לבביים, תאי אנדותל ונוירונים, עשויים לשפר את פונקציונליות hiPSC-CM22,36. שלישית, hiPSC-CMs דו-ממדיים מציגים מספר תכונות של קרדיומיוציטים לא בשלים יחסית, כולל פעימות ספונטניות, מורפולוגיה אמורפית והיעדר תגובה אינוטרופית 8,37. רביעית, בעוד פרוטוקול זה מייצר חד-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות המתכווצות חזק, סביר להניח כי מודלים תלת-ממדיים משופרים של hiPSC-CM כגון רקמות לב מהונדסות, כגון ECTs, יביאו לתגובת כיווץ משופרת הנגרמת על ידי CCM תחת ריכוזי סידן פיזיולוגיים 8,38. לבסוף, הפרוטוקול המתואר כאן מיועד לפורמט של 48 בארות. עם זאת, עם אופטימיזציה והכללת אוטומציה, ניתן לשנות זאת לפורמט בעל תפוקה גבוהה (למשל, לוחות 96 באר או 384 בארות).

תקן הזהב הנוכחי למחקרי hiPSC-CM הוא תנאי תרבית דו-ממדיים קשיחים קונבנציונליים (כלומר, תרבית רקמות, פלסטיק או זכוכית). בעוד שהיא שימושית עבור אלקטרופיזיולוגיה3 וטיפול בסידן39 מחקרים, המתודולוגיה הקונבנציונלית מביאה לתכונות כיווץ מינימליות 5,6,7. כתוצאה מכך, תנאי תרבית דו-ממדית קשיחים קונבנציונליים אינם ניתנים להערכה של השפעות התכווצות CCM8. שיטות 38 HiPSC-CM ECTמשופרות מבחינה פונקציונלית הן מאתגרות מבחינה טכנית, גוזלות זמן רב ודורשות ציוד מתוחכם שאינו זמין בכל מעבדה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה ליצירת מונו-שכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בעלות כיווץ חזק במסגרת זמן קצרה יותר מאשר שיטות ECT תלת-ממדיות או שיטות דו-ממדיות קונבנציונליות לטווח ארוך 7,40,41. יתר על כן, הריאגנטים המשמשים כאן זמינים מסחרית, כולל מצע הידרוג'ל ו- hiPSC-CMs, ולשניהם יש עקביות רבה ללוט. בעוד שהשתמשנו באלקטרודות חוט פלטינה נשלפות (מרחק אינטראלקטרודה: 2.0 מ"מ, רוחב: 1.0 מ"מ), חומרים ותצורות אלקטרודות שונות ניתנים להערכות התכווצות CCM במבחנה 8,15,17,18,22. כמו כן, קיימות מספר תוכנות אוטומטיות המאפשרות ניתוח סרטוני התכווצות 7,31,32.

רוב השיטות הלא-קליניות להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי מסתמכות במידה רבה על מודלים יקרים של בעלי חיים in vivo (למשל, כלבים או חזירים) ועל רצועות שריר פפילריות מאתגרות מבחינה טכנית (למשל, ארנבות)18. מאמר זה תיאר מודל אנושי במבחנה כדי להעריך את ההשפעות של אותות אלקטרופיזיולוגיה של הלב של מכשירים רפואיים על התכווצות. כלי זה יכול להפחית את התלות במחקרים בבעלי חיים ולהיות שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות ההתכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה של הלב.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה משקף את דעותיהם של המחברים ואין לפרש אותו כמייצג את השקפותיו או מדיניותו של מנהל המזון והתרופות האמריקאי. אין לפרש את האזכור של מוצרים מסחריים, מקורותיהם או השימוש בהם בקשר לחומר המדווח כאן כאישור ממשי או משתמע של מוצרים אלה על ידי מחלקת הבריאות ושירותי האנוש. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים בעבודה זו.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מינוי לתוכנית השתתפות במחקר במרכז למכשירים ובריאות רדיולוגית המנוהלת על ידי מכון אוק רידג' למדע וחינוך באמצעות הסכם בין-סוכנותי בין משרד האנרגיה של ארצות הברית לבין מנהל המזון והתרופות האמריקאי. המחברים מודים לריצ'רד גריי, טרנט רוברטסון ואנה אווילה על הצעותיהם ועזרתם הטכנית. המחקר מומן באמצעות מנהל המזון והתרופות האמריקאי, משרד המדע וההנדסה מעבדות.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% ג'לטיןSTEMCELL Technologies7903מצע תרבית ציפוי מראש
48 בארות צלחתMatTek P48G-1.5-6-Fמצע הידרוג'ל hiPSC-CM תרבית,
תרמופרזכוכית 6 בארות140675תרבית hiPSC-CM,
תוסף פלסטיק B-27, עם אינסוליןInvitrogen17504-044Cardiomyocyte Media
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2)Fisher Scientificc70-500Tyrode'
הפלטפורמה והתוכנה של CellOPTIQ Clyde Biosciencesהקלטה וניתוח התכווצות
צינור חרוטי 15 מ"לקורנינג 352099hiPSC-CM דיסוציאציה
מצלמת CMOS דיגיטליתHamamatsuC11440-42U30התכווצות הקלטת וידאו
D-PBSLife Technologies14190-144בקרה סביבתית לשטיפת תאים
OKOLAB INCH201-K-FRAMEרגולציה סביבתית
גלוקוז סיגמא-אולדריץ'G8270-1 ק"גטירוד s פתרון
Hemocytometerפישר סיינטיפיק22-600-107hiPSC-CM ספירת
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375Tyrode' s פתרון
iCell Cardiomyocytes Plating בינוניFujifilm Cellular Dynamic, Inc. M1001hiPSC-CM ציפוי מדיה
iCell Cardiomyocytes2, 01434פוג'יפילם סלולר דינמיקה, בע"מ חממת R1017hiPSC-CMs
(37 ° C, 5% CO2)Thermofisher50116047לשמור על hiPSC-CMs
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX73הדמיה hiPSC-CMs
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2) פישר סיינטיפיקm33-500טירוד s פתרון
Matrigel גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנה מרתףקורנינג 356230מצע הידרוג'ל גמיש
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-129מצע הידרוג'ל
Aliquot דגם 4100 ממריץ מבודד בעוצמה גבוההAM-Systemsדגם 4100 מחולל דופק
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1153DCM hiPSC-CMs
עט-סטרפטוקוסInvitrogen15140-122קרדיומיוציטים
מדיה פיפטה L-20Rainin17014392ציפוי מצע הידרוג'ל
פיפטה P1000פישר סיינטיפיקF123602G
קצות פיפטה, 1000 ulFisher Scientific02-707-509
קצות פיפטה, 20 ulRaininGPS-L10Sייצור מצע הידרוג'ל
אשלגן כלורי (KCl) פישר סיינטיפיקP330-500טירוד תמיסת
s RPMI 1640, עם גלוקוז Invitrogen11875קרדיומיוציטים מדיה
נתרן כלורי (NaCl)פישר סיינטיפיקs641-212טירוד תמיסת
s נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'221465טירוד' s פתרון
אלקטרודותקצב וגירוי CCM
שעון עצר/טיימרפישר סיינטיפיק02-261-840ציפוי מצע הידרוג'ל
Trypan Blue StainLife TechnologiesT10282hiPSC-CM ספירת
TrypLE Express Life Technologies12605-010hiPSC-CM דיסוציאציה
תא גירוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, S. L., et al. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873(2018).
  2. Cook, C., Cole, G., Asaria, P., Jabbour, R., Francis, D. P. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).
  3. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  4. Yang, X., Ribeiro, A. J. S., Pang, L., Strauss, D. G. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).
  5. Zuppinger, C. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).
  6. Huethorst, E., et al. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).
  7. Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).
  8. Feaster, T. K., et al. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563(2022).
  9. Feaster, T. K. Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , Vanderbilt University Medical Center. PhD thesis (2015).
  10. Cadar, A. G., et al. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).
  11. Parikh, S. S., et al. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).
  12. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  13. Campbell, C. M., Kahwash, R., Abraham, W. T. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).
  14. PMA P180036. FDA Summary of Safety and Effectiveness Data. Food and Drug Administration. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019).
  15. Blinova, K., et al. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106(2014).
  16. Sabbah, H. N., et al. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).
  17. Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085(2021).
  18. Brunckhorst, C. B., Shemer, I., Mika, Y., Ben-Haim, S. A., Burkhoff, D. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).
  19. Mohri, S., et al. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).
  20. Mohri, S., et al. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).
  21. Burkhoff, D., et al. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).
  22. Narkar, A., Feaster, T. K., Casciola, M., Blinova, K. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498(2022).
  23. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  24. Blinova, K., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  25. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  26. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).
  27. Cadar, A. G., Feaster, T. K., Durbin, M. D., Hong, C. C. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).
  28. Narkar, A., Willard, J. M., Blinova, K. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199(2022).
  29. OPTIMIZER® Smart Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018).
  30. OPTIMIZER™ Smart Mini Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019).
  31. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
  32. Grune, T., Ott, C., Haseli, S., Hohn, A., Jung, T. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112(2019).
  33. Masarone, D., et al. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143(2022).
  34. Nadeem, M., Tariq, E. F., Aslam, H. M., Illahi, Y., Shah, R. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627(2020).
  35. Manganelli, G., et al. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).
  36. Mannhardt, I., et al. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461(2017).
  37. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  38. Feric, N. T., et al. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).
  39. Hwang, H. S., et al. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).
  40. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  41. Stoehr, A., et al. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Contractility ModulationHuman Stem Cell CardiomyocytesFlexible Hydrogel SubstrateElectrophysiology DevicesVideo Based DetectionCalcium HandlingBeta Adrenergic SignalingContraction AmplitudePatient Specific CardiomyocytesExcitation Contraction Coupling

Related Articles