Method Article

AMEBaS: חילוץ אוטומטי של קו אמצע וחיסור רקע של פלואורסצנטיות רציומטרית של תאים בודדים מקוטבים

DOI:

10.3791/64857

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Mathematics and Statistics, University of São Paulo, 2Center for Mathematics, Computing and Cognition, Federal University of ABC, 3Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 4Cell Biology and Molecular Genetics Department, University of Maryland, 5Department of Biosciences, University of Milan, 6Department of Physics, Politecnico di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הנוכחיות לניתוח הדינמיקה התוך-תאית של תאים בודדים מקוטבים הן לעתים קרובות ידניות וחסרות סטנדרטיזציה. כתב יד זה מציג צינור ניתוח תמונות חדשני לאוטומציה של חילוץ קו אמצע של תאים מקוטבים בודדים וכימות התנהגות מרחבית-זמנית ממעברי זמן בממשק מקוון ידידותי למשתמש.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוטביות התא היא תופעה מקרוסקופית הנוצרת על ידי אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית ששיאם בהופעתם של תחומים מיוחדים ברמה התת-תאית. היא קשורה לפיתוח מבנים מורפולוגיים אסימטריים העומדים בבסיס פונקציות ביולוגיות מרכזיות כגון חלוקת תאים, גדילה והגירה. בנוסף, הפרעה בקוטביות התא נקשרה להפרעות הקשורות לרקמות כגון סרטן ודיספלסיה קיבה.

השיטות הנוכחיות להערכת הדינמיקה המרחבית-זמנית של כתבים פלואורסצנטיים בתאים מקוטבים בודדים כוללות לעתים קרובות צעדים ידניים להתחקות אחר קו אמצע לאורך הציר הראשי של התאים, דבר הגוזל זמן רב ונוטה להטיות חזקות. יתר על כן, למרות שניתוח יחסימטרי יכול לתקן את ההתפלגות הלא אחידה של מולקולות הכתב באמצעות שני ערוצים פלואורסצנטיים, טכניקות חיסור רקע הן לעתים קרובות שרירותיות וחסרות תמיכה סטטיסטית.

כתב יד זה מציג צינור חישובי חדשני לאוטומציה וכימות של ההתנהגות המרחבית-זמנית של תאים בודדים באמצעות מודל של קוטביות התא: צמיחת שיער צינור/שורש אבקה ודינמיקה של יונים ציטוסוליים. אלגוריתם בן שלושה שלבים פותח כדי לעבד תמונות יחסיות ולחלץ ייצוג כמותי של דינמיקה תוך תאית וצמיחה. השלב הראשון מפלח את התא מהרקע, ומפיק מסיכה בינארית באמצעות טכניקת סף במרחב עוצמת הפיקסלים. השלב השני עוקב אחר נתיב דרך קו האמצע של התא באמצעות פעולת שלד. לבסוף, השלב השלישי מספק את הנתונים המעובדים כקיטוע זמן יחסימטרי ומניב קימוגרף יחסימטרי (כלומר, פרופיל מרחבי 1D לאורך זמן). נתונים מתמונות יחסיות שנרכשו עם כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית מגידולי אבקה שימשו כדי לבחון את השיטה. צינור זה מאפשר ייצוג מהיר, מוטה פחות ומדויק יותר של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים מקוטבים, ובכך מקדם את ערכת הכלים הכמותית הזמינה לחקר קוטביות התא. קוד המקור של AMEBaS Python זמין בכתובת: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוטביות התא היא תהליך ביולוגי בסיסי שבו הפעולה המרוכזת של אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית מגיעה לשיאה בהקמת תחומים תת-תאיים מורפולוגיים מיוחדים1. חלוקת תאים, גדילה ונדידה מסתמכים על אתרי קוטביות כאלה, בעוד שאובדנו נקשר לסרטן בהפרעות הקשורות לרקמת אפיתל2.

תאים הגדלים באופן אפי הם דוגמה דרמטית לקוטביות, שבה אתר הקוטביות בקצה בדרך כלל מכוון מחדש לרמזים חוץ-תאיים3. אלה כוללים נוירוטים מתפתחים, קורים פטרייתיים, שערות שורש וצינורות אבקה, שבהם תהליכים תאיים מרובים מראים הבדלים בולטים מקצה התא לכיוון השוק. בצינורות אבקה, במיוחד, פילמור אקטין (actin polymerization), סחר בשלפוחיות וריכוזים יוניים מקוטבים במידה ניכרת, ומראים שיפועים ממוקדי קצה4. צינורות אבקה הם הגמטופיטים הזכריים של צמחים פורחים והם אחראים על העברת תאי הזרע לביצית על ידי גידול בלעדי בקודקוד התא באחד מקצבי הצמיחה המהירים ביותר הידועים לתא בודד. השיפועים הממוקדים בקצה של יונים כגון סידן 5 (Ca2+) ופרוטונים 6 (H+) ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על צמיחת צינור האבקה, שהוא חיוני להשגת תפקידה הביולוגי העיקרי שמגיע לשיאו בהפריה כפולה 5,6. לפיכך, שיטות כמותיות לניתוח הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים הגדלים באופן אפי חיוניות לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס צמיחה מקוטבת 7,8,9. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בקימוגרפים, כלומר מטריצה שמייצגת את עוצמות הפיקסלים של קו האמצע של התא (למשל, עמודות) לאורך זמן (למשל, שורות), מה שמאפשר להמחיש צמיחה ונדידה של תאים באלכסון (איור 1). למרות התועלת שלהם, קימוגרפים מופקים לעתים קרובות על ידי מעקב ידני אחר קו האמצע, להיות נוטה הטיות וטעויות אנוש תוך גם להיות מייגע למדי. זה דורש שיטה אוטומטית של חילוץ קו אמצע שהיא התכונה הראשונה של הצינור שהוצג כאן בשם AMEBaS:מתיחה אוטומטית Midline Eו- Background Subtraction של מעברי זמן פלואורסצנטיים יחסיים של תאים בודדים מקוטבים.

במונחים של הליכים ניסיוניים, הדמיה כמותית של יונים/מולקולות/מינים בעלי עניין בתאים בודדים יכולה להיות מושגת באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות מקודדות גנטית10. מבין האפשרויות המתרחבות ללא הרף, גשושיות יחסיות הן אחת המדויקות ביותר מכיוון שהן פולטות אורכי גל פלואורסצנטיים שונים כאשר הן קשורות/לא קשורות למולקולות המעניינות11. זה מאפשר תיקון של ההטרוגניות המרחבית בריכוז התוך תאי של הגשושית על ידי שימוש ביחס של שני ערוצים עם רקע ספציפי לערוץ שלהם מופחת. עם זאת, הערכת סף הרקע עבור כל ערוץ ונקודת זמן יכולה להיות משימה מורכבת, שכן לעתים קרובות היא משתנה במרחב עקב אפקטים כמו הצללה, כאשר פינות התמונה יש שונות בהירות ביחס למרכז, ועם הזמן עקב דהיית הפלואורופור (photobleaching)12. למרות שישנן מספר שיטות אפשריות, כתב יד זה מציע לקבוע את עוצמת הרקע באופן אוטומטי באמצעות סף הסגמנטציה המתקבל עם אלגוריתם איזודאטה13, אשר לאחר מכן מוחלק על פני מסגרות באמצעות רגרסיה פולינומית כסטנדרט. עם זאת, רכיבים מרחביים הנובעים מהטרוגניות פלואורסצנטית שאינה קשורה לתא המטרה שהוסרוב-12, זכו להתעלמות בשיטה זו. סף אוטומטי יכול להתבצע במספר שיטות, אך אלגוריתם איזודאטה הפיק את התוצאות הטובות ביותר מבחינה אמפירית. לפיכך, חיסור אוטומטי של ערך רקע וחישוב יחסימטרי הם התכונה העיקרית השנייה של AMEBaS (איור 1), אשר, ביחד, מקבלת כקלט ערימה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דו-ערוצי, מעריכה את קו האמצע של התא ואת הרקע הספציפי לערוץ, ומפיקה קימוגרפיות של שני הערוצים והיחס ביניהם (פלט ראשי #1) לאחר חיסור רקע, החלקה והסרה חריגה, יחד עם ערימה של תמונות יחסיות (פלט ראשי #2).

AMEBaS נבדק עם הפסקות זמן פלואורסצנטיות של גידולי אבקה Arabidopsis שהתקבלו תחת מיקרוסקופ, או עם Ca2+ (CaMeleon)8 או pH (pHluorin)6 חיישנים ratiometric מבוטא תחת מקדם LAT52 ספציפי אבקה. תמונות מכל ערוץ צולמו כל 4 שניות כשהוא מחובר למיקרוסקופ הפוך, מצלמה מוארת קדמית (2560 פיקסלים × 2160 פיקסלים, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר), תאורת פלואורסצנטיות ועדשת מטרה טבילת מים 63x, 1.2NA. הגדרות המסננים ששימשו עבור CaMeleon היו: עירור 426-450 ננומטר (CFP) ו- 505-515 ננומטר (YFP), פליטה 458-487 ננומטר (CFP) ו- 520-550 ננומטר (YFP), ואילו עבור pHluorin, עירור 318-390 ננומטר (DAPI) ו- 428-475 ננומטר (FITC), פליטה 435-448 ננומטר (DAPI) ו- 523-536 ננומטר (FITC). ערכת נתונים מלאה נוספה לבדיקה ב-Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.

בנוסף, הצינור נבדק עם נתוני שיער שורש, כאשר ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ יריעה קלה (SPIM) כפי שתואר קודם לכן 15,16 עם שערות שורש Arabidopsis המבטאות את כתב Ca2+ המקודד גנטית NES-YC3.6 תחת שליטתו של מקדם UBQ10 17. תוכנת LabView הביתית ששלטה ברכישת המצלמה, תרגום הדגימות והצמצם של מיקרוסקופ יריעת האור אפשרה תצפית על שני ערוצי cpVenus ו-CFP, אך גם הדמיה של היחס ביניהם בזמן אמת. כל תמונת יחס של קיטוע הזמן ייצגה הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) בין תמונות התעלות הפלואורסצנטיות cpVenus ו-CFP שהתקבלו מ-15 פרוסות של הדגימה במרווחים של 3 מיקרומטר זו מזו. יחס cpVenus/CFP בהילוך מהיר של MIPs נשמר ושימש ישירות לניתוח AMEBaS.

אף על פי שצינור זה יכול לעבוד עם סוגים רבים של תאים גדלים ונודדים, הוא תוכנן במיוחד לנתח תאים גדלים הגדלים אך ורק בקצה, כגון צינורות אבקה, שערות שורש וקורי פטריות, שבהם יש התאמה של האזורים הציטופלזמיים שאינם גדלים בין המסגרות. כאשר התכתבות כזו אינה קיימת, על המשתמש לבחור באפשרות complete_skeletonization בשלב 1.3.1.1 (עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים).

figure-introduction-1
איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה של קו הצינור. צנרת AMEBaS מנתחת ומעבדת מעברי זמן מיקרוסקופיים בשלושה שלבים עיקריים: סגמנטציה של תא יחיד, מעקב אחר קו אמצע ויצירת קימוגרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי

ניתן להשתמש במחברת Jupyter ישירות באינטרנט באמצעות Google Colab בכתובת https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, שם התבססו ההוראות שלהלן. לחלופין, מחברת Jupyter זמינה בכתובת https://github.com/badain/amebas, שם ניתן להוריד אותה ולהגדיר אותה לרוץ באופן מקומי ב- Jupyter (אנקונדה יכולה לספק תהליך התקנה קל וחוצה פלטפורמות). נתוני בדיקה מלאים ניתן למצוא בזנודו (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), המכילים נתונים חד-ערוציים ודו-ערוציים של צינורות אבקה Arabidopsis המבטאים pH או Ca2+ כתבים14. הצינור חולק לחלקים, כאשר ניתן לבצע כל צעד על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה לאחר הגדרת האפשרויות הספציפיות למשתמש. הקבצים הדרושים למחקר זה זמינים בתיקיית ה- zip הראשית של AMEBaS (קובץ קידוד משלים 1).

  1. פתח את מחברת Jupyter וקרא את קבצי קיטועי הזמן.
    1. נווט אל דף הבית של המחברת האינטראקטיבית ב- Google Colab שהוזכר לעיל או הורד ופתח את מחברת AMEBaS_Local.ipynb מ- GitHub.
    2. הכן את הגדרת הספריה עבור נתוני הקלט והפלט:
      1. אם אתה משתמש בגירסה המקומית, מקם את קיטועי הזמן הפלואורסצנטיים כקובץ TIFF או DV בתוך תיקייה בשם data שחייבת להימצא בתיקיית הבסיס של התוכנית. יש ליצור תיקיה בשם כדי לקבל את הנתונים שנוצרו. לאחר מכן הפעל את בלוק קוד ההתקנה.
      2. אם אתה משתמש במחברת ב- Google Colab, הפעל את בלוק קוד ההתקנה כדי ליצור באופן אוטומטי את הנתונים ואת תיקיות היציאה .
    3. הפעל את בלוק קוד קלט הקובץ כדי לקרוא את נתוני קיטועי הזמן על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה . אם אתה משתמש בגירסת Google Colab של המחברת, לחץ על בחר קובץ כפתור כדי להעלות ישירות את קובץ קיטועי הזמן לתיקיית הנתונים .
      הערה: מספר הערוצים יזוהה באופן אוטומטי בהתבסס על ממד התמונה.
    4. בחר אם פלטים נוספים של כל שלב יופקו על-ידי הגדרת הפרמטר 'verbose' ל - True או False.
  2. זהו את התא הראשי ואת המקטע מהרקע (איור 2).
    1. הפעל את בלוק הקוד Single Cell Segmentation כדי להפריד באופן אוטומטי את התא המעניין מהרקע על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה .
      הערה: מסנני חציון וגאוס יוחלו כשלב עיבוד מקדים להסרת רעש לא רצוי לפני פילוח החזית מהרקע לפי סף איזודאטה ובידוד האזור של האזור הגדול ביותר כדי להסיר ממצאים לא רצויים.
      1. התאימו את ערך הסיגמא המשמש את הגאוס במשתנה 'סיגמה' כדי לכוונן את החלקות של מסיכת הסגמנטציה. ערך ברירת המחדל הוא 2.0.
      2. הגדר את אומדן המשתנה ל- False כדי לאחסן את הסף המוערך מ- Isodata ישירות או ל - True כדי להחליק אותו על פני מסגרות שכנות באמצעות רגרסיה פולינומית מקומית (LOESS). כוונן את הפונקציה שלו על ידי שינוי משתנה n_points . ערך ברירת המחדל הוא 40.
  3. עקבו אחר קו האמצע לאורך שלוחת התא (איור 3).
    1. הפעל את בלוק הקוד Cell Midline Tracing על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי להפוך את התא באופן אוטומטי לשלד באמצעות שיטה18 של לי ולהרחיב את קצה השלד האחרון באמצעות אקסטרפולציה ליניארית.
      1. בחר לעקוב אחר קו האמצע רק במסגרת האחרונה או פעם אחת בכל מסגרת על-ידי התאמת הארגומנט complete_skeletonization .
        הערה: כאשר כל המסגרות הן שלד, מדלגים על אקסטרפולציה.
      2. הגדר את שבר הנקודות בשלד לאינטרפולציה במהלך אקסטרפולציה על ידי התאמת משתנה interpolation_fraction . ערך ברירת המחדל הוא 0.25.
      3. בחר את אורך אקסטרפולציית קו האמצע על-ידי שינוי extrapolation_length המשתנה. ברירת המחדל היא -1, המרחיבה את השלד עד לקצה הקרוב ביותר.
  4. צור קימוגרפים עבור כל ערוץ ( איור 4).
    1. הפעל את בלוק הקוד הראשון של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור קימוגרפים באופן אוטומטי עבור שני הערוצים.
      1. בחר את גודל ליבת גאוס המשמשת להחלקה על-ידי התאמת kymograph_kernel המשתנה.
        הערה: היא תואמת לגודל השכונה (בפיקסלים) שמעליה ממוצעות עוצמות הפיקסלים. ברירת המחדל היא 3 פיקסלים x 3 פיקסלים.
      2. שלדים לא מורחבים יוצרים קימוגרפים מכוסים שחייבים להשתמש במפת צבע מותאמת אישית כדי להציג כראוי את העוצמות שלהם. בחר את אחוז השבר של העוצמות שיוקצו לצבע הרקע, שחור, תוך התאמת משתנה shift_fraction . ערך ברירת המחדל הוא 0.7.
  5. חשב את היחס בין הערוצים (איור 5).
    1. הפעל את בלוק הקוד השני של תצוגה חזותית של נתונים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה כדי ליצור באופן אוטומטי קימוגרף יחסימטרי וקיטועי זמן יחסיים (איור 6).
      הערה: שלב זה זמין רק בעת שימוש בהפסקות זמן דו-ערוציות. סף עוצמת הרקע המאוחסן בשלב 1.2.1.2 מופחת מכל ערוץ.
      1. התאם את משתנה switch_ratio כדי להחליף את סדר הערוצים המשמשים כמונה וכמכנה במהלך חישובי היחס. ברירת המחדל היא False.
      2. בחר אם יש להחליק עוד יותר את קיטוע הזמן של היחס באמצעות מעבר מסנן חציוני על-ידי התאמת משתנה smooth_ratio . ברירת המחדל היא False.
      3. בחר אם להסיר חריגות הנוצרות על-ידי האות הנמוך של ערוץ המכנה על-ידי מניפולציה של משתנה reject_outliers . ברירת המחדל היא True והגדרת חריגים כערכים פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני שמעל הרביעון השלישי (שבו נמצאים 75% מהערכים).
      4. בחר אם יש לייצא את הרקע בפלט היחסימטרי על-ידי התאמת background_ratio המשתנה. ברירת המחדל היא False, שמחליפה אותו באפסים.

figure-protocol-1
איור 2: שלב פילוח תא בודד. טכניקות עיבוד תמונה כגון סינון, סף ותיוג שטח משמשות לבידוד אות העניין (שלב 1.2). לנתונים מסוימים אלה היו הערכים הבאים עבור העוצמה הנמוכה ביותר: 2556, חציון: 3441 והעוצמה הגבוהה ביותר: 32125. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 3: סקירה כללית של מעקב אחר קו אמצע – קו האמצע של התא הבודד מתקבל על-ידי חישוב השלד שלו (לבן). הקצה (מגנטה) מחושב באופן ליניארי מהנקודות האחרונות בסוף השלד (שלב 1.3). בהרכב זה הן קו האמצע והן קצהו מונחים על גבי התא המקורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 4: קימוגרפיות של Timelapse - השוואה בין הקימוגרפים עבור כל ערוץ שנוצר כאשר 'complete_skeletonization' כבוי (שלב 1.4). הציר האנכי מתאר את התקדמות הזמן, והציר האופקי משרטט את העוצמה הממוצעת של נתיב קו האמצע האקסטרפולטיבי ואחריו תא בודד. עבור נתונים מסוימים אלה, מפת הצבעים מייצגת את הערכים הבאים עבור ערוץ 1 העוצמה הנמוכה ביותר: 2886, חציון: 3167, העוצמה הגבוהה ביותר: 21021. ערוץ 2 העוצמה הנמוכה ביותר: 3030, חציון: 3400, העוצמה הגבוהה ביותר: 29688. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 5: החלקת סף רקע - סף סגמנטציית הרקע נאמד באמצעות אלגוריתם איזודאטה ולאחר מכן מוחלק באמצעות רגרסיה פולינומית מקומית (שלב 1.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-5
איור 6: תוצאות יחסיות- (A) השוואה בין הפריים האחרון של הערוץ הראשון היחסי, לבין הערוץ הראשון המקורי המקוטע. (B) קימוגרף שנוצר מה-timelapse היחסי-מטרי (שלב 1.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. פרוטוקול מצב אצווה

  1. הורד ומקם את pipeline.py הקובץ ממאגר AMEBaS GitHub באותה ספרייה שבה נמצאים הנתונים.
  2. הקלד את מיקום הקובץ בשורת הפקודה לאחר קובץ התוכנית.
  3. כלול - -v כארגומנט מיקום כדי להציג את השלבים הפנימיים של הצינור, אם תרצה.
  4. כלול - -s לבחירה בערך סיגמה המשמש בשלב העיבוד המקדים של מסנן גאוס כהכנה לסגמנטציה של תאים. ברירת המחדל היא 2.
  5. כלול - -a כדי לעקוב אחר קו האמצע עבור כל מסגרת של חלוף הזמן. כברירת מחדל, קו הצינור משתמש רק במסגרת האחרונה.
  6. כלול - -f כדי לבחור את השבר [0,1] של השלד שישמש באינטרפולציה. ערך ברירת המחדל הוא 0.25.
  7. כלול -e כדי לבחור את האורך בפיקסלים של השלד האקסטרפולטיבי. ברירת המחדל היא -1, המרחיבה את השלד עד לקצה הקרוב ביותר.
  8. כלול --sf כדי לבחור את החלק של טווח הצבעים שיועבר לרקע בקימוגרפים שאינם אקסטרפולציה. ערך ברירת המחדל הוא 0.7.
  9. כלול - -k כדי לקבוע את גודל הליבה המשמשת בסינון הקימוגרף גאוס. ברירת המחדל היא 3.
  10. כלול - -eb כדי להעריך את עוצמת סף הרקע הכללית באמצעות רגרסיה פולינומית LOESS של עוצמות סף הרקע הספציפיות למסגרת.
    1. התאם אישית את מספר הנקודות המשמשות בהחלקת LOESS של ערכי סף הרקע על-ידי שינוי הפרמטר - -n. ערך ברירת המחדל הוא 40.
  11. החלף את הערוצים המשמשים כמונה וכמכנה במהלך חישובי היחס, כולל - r או - -switch_ratio, אם חלוף הזמן כולל שני ערוצים. כברירת מחדל, הערוץ השני הוא המונה והראשון הוא המכנה.
  12. בחר אם יש להחליק עוד יותר את קיטוע הזמן של היחס באמצעות מעבר מסנן חציוני עם הארגומנט - -sm . ברירת המחדל היא False.
  13. כלול -o כדי לדחות פיקסלים בעוצמות חריגות במהלך יצירת קיטועי זמן יחסיים.
  14. בחר אם יש לייצא את הרקע בפלט היחסימטרי באמצעות הארגומנט --b. ברירת המחדל היא False, שמחליפה אותו באפסים.
  15. הקש Enter כדי להפעיל. הפלט יופק באותה ספרייה כמו קובץ התוכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צינור AMEBaS הופך את החילוץ של דינמיקת קו האמצע של תאים בודדים מקוטבים מערימות תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאוטומטי, מה שהופך אותו לפחות גוזל זמן ופחות מועד לטעויות אנוש. השיטה מכמתת את הפסקות הזמן האלה על-ידי יצירת קימוגרפים וערימות תמונות יחסיות (איור 1) בגידול תאים בודדים. ניתן להתאים אותו לעבודה על תאים בודדים נודדים, אך יש צורך בניסויים נוספים. AMEBaS מיושמת בפייתון כמחברת Jupyter אינטראקטיבית (המתוארת בסעיף פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי), המאפשר שימוש קל יותר ללא צורך ב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה החדשנית המוצגת כאן היא כלי רב עוצמה לייעול ואוטומציה של ניתוח ערימות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים מקוטבים. השיטות הנוכחיות המתוארות בספרות, כגון תוספי קימוגרף של ImageJ, דורשות מעקב ידני אחר קו האמצע של התא המקוטב המעניין, משימה שהיא לא רק גוזלת זמן אלא גם מועדת לטעויות אנוש. מכיוון שהגדרת קו האמצע בצנרת זו נתמכת בשיטה נומרית18,19 המבצעת שלד, מוסרת הערכה סובייקטיבית, ומציגה תקן כמותי לנוהל. זה שימושי במיוחד עבור חוקרים עם כמויות גדולות של נתונים, עם...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברי כתב היד אינם מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה למענקי FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, GM131043 המענקים של NIH R01 ומענקי NSF MCB1714993, MCB1930165 לתמיכה כספית. נתוני שיער השורש הופקו עם התשתית ובהנחייתם של פרופ' אנדריאה באסי ופרופ' אלכס קוסטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GithubGithubhttps://github.com/badain/amebas
Google ColabGooglehttps://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
  2. Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
  3. Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
  4. Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
  5. Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
  6. Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
  7. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  8. Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
  9. Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
  10. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
  11. Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
  12. Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242(2022).
  13. Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  14. Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
  15. Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
  16. Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
  17. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  18. Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
  19. Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell PolarityRatiometric FluorescenceMidline ExtractionBackground SubtractionSingle Cell AnalysisFluorescence Time LapseCell SegmentationSkeletonizationKymograph GenerationPolarized Cells

Related Articles