Method Article

AMEBaS: חילוץ אוטומטי של קו אמצע וחיסור רקע של פלואורסצנטיות רציומטרית של תאים בודדים מקוטבים

DOI:

10.3791/64857

June 23rd, 2023

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות הנוכחיות לניתוח הדינמיקה התוך-תאית של תאים בודדים מקוטבים הן לעתים קרובות ידניות וחסרות סטנדרטיזציה. כתב יד זה מציג צינור ניתוח תמונות חדשני לאוטומציה של חילוץ קו אמצע של תאים מקוטבים בודדים וכימות התנהגות מרחבית-זמנית ממעברי זמן בממשק מקוון ידידותי למשתמש.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוטביות התא היא תופעה מקרוסקופית הנוצרת על ידי אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית ששיאם בהופעתם של תחומים מיוחדים ברמה התת-תאית. היא קשורה לפיתוח מבנים מורפולוגיים אסימטריים העומדים בבסיס פונקציות ביולוגיות מרכזיות כגון חלוקת תאים, גדילה והגירה. בנוסף, הפרעה בקוטביות התא נקשרה להפרעות הקשורות לרקמות כגון סרטן ודיספלסיה קיבה.

השיטות הנוכחיות להערכת הדינמיקה המרחבית-זמנית של כתבים פלואורסצנטיים בתאים מקוטבים בודדים כוללות לעתים קרובות צעדים ידניים להתחקות אחר קו אמצע לאורך הציר הראשי של התאים, דבר הגוזל זמן רב ונוטה להטיות חזקות. יתר על כן, למרות שניתוח יחסימטרי יכול לתקן את ההתפלגות הלא אחידה של מולקולות הכתב באמצעות שני ערוצים פלואורסצנטיים, טכניקות חיסור רקע הן לעתים קרובות שרירותיות וחסרות תמיכה סטטיסטית.

כתב יד זה מציג צינור חישובי חדשני לאוטומציה וכימות של ההתנהגות המרחבית-זמנית של תאים בודדים באמצעות מודל של קוטביות התא: צמיחת שיער צינור/שורש אבקה ודינמיקה של יונים ציטוסוליים. אלגוריתם בן שלושה שלבים פותח כדי לעבד תמונות יחסיות ולחלץ ייצוג כמותי של דינמיקה תוך תאית וצמיחה. השלב הראשון מפלח את התא מהרקע, ומפיק מסיכה בינארית באמצעות טכניקת סף במרחב עוצמת הפיקסלים. השלב השני עוקב אחר נתיב דרך קו האמצע של התא באמצעות פעולת שלד. לבסוף, השלב השלישי מספק את הנתונים המעובדים כקיטוע זמן יחסימטרי ומניב קימוגרף יחסימטרי (כלומר, פרופיל מרחבי 1D לאורך זמן). נתונים מתמונות יחסיות שנרכשו עם כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית מגידולי אבקה שימשו כדי לבחון את השיטה. צינור זה מאפשר ייצוג מהיר, מוטה פחות ומדויק יותר של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים מקוטבים, ובכך מקדם את ערכת הכלים הכמותית הזמינה לחקר קוטביות התא. קוד המקור של AMEBaS Python זמין בכתובת: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוטביות התא היא תהליך ביולוגי בסיסי שבו הפעולה המרוכזת של אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית מגיעה לשיאה בהקמת תחומים תת-תאיים מורפולוגיים מיוחדים1. חלוקת תאים, גדילה ונדידה מסתמכים על אתרי קוטביות כאלה, בעוד שאובדנו נקשר לסרטן בהפרעות הקשורות לרקמת אפיתל2.

תאים הגדלים באופן אפי הם דוגמה דרמטית לקוטביות, שבה אתר הקוטביות בקצה בדרך כלל מכוון מחדש לרמזים חוץ-תאיים3. אלה כוללים נוירוטים מתפתחים, קורים פטרייתיים, שערות שורש וצינורות אבקה, שבהם תהליכים תאיים מרובים מראים הבדלים בולטים מקצה התא לכיוון השוק. בצינורות אבקה, במיוחד, פילמור אקטין (actin polymerization), סחר ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי

ניתן להשתמש במחברת Jupyter ישירות באינטרנט באמצעות Google Colab בכתובת https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, שם התבססו ההוראות שלהלן. לחלופין, מחברת Jupyter זמינה בכתובת https://github.com/badain/amebas, שם ניתן להוריד אותה ולהגדיר אותה לרוץ באופן מקומי ב- Jupyter (אנקונדה יכולה לספק תהליך התקנה קל וחוצה פלטפורמות). נתוני בדיקה מלאים ניתן למצוא בזנודו (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), המכילים נתונים חד-ערוציים ודו-ערוציים של צינורות אבקה Arabidopsis המבטאים pH או Ca2+ כתבים14. הצינור חולק לחלקים, כאשר ניתן ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צינור AMEBaS הופך את החילוץ של דינמיקת קו האמצע של תאים בודדים מקוטבים מערימות תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לאוטומטי, מה שהופך אותו לפחות גוזל זמן ופחות מועד לטעויות אנוש. השיטה מכמתת את הפסקות הזמן האלה על-ידי יצירת קימוגרפים וערימות תמונות יחסיות (איור 1) בגידול תאים בודדים. ניתן להתאים אותו לעבודה על תאים בודדים נודדים, אך יש צורך בניסויים נוספים. AMEBaS מיושמת בפייתון כמחברת Jupyter אינטראקטיבית (המתוארת בסעיף פרוטוקול מחברת אינטראקטיבי), המאפשר שימוש קל יותר ללא צורך ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה החדשנית המוצגת כאן היא כלי רב עוצמה לייעול ואוטומציה של ניתוח ערימות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים מקוטבים. השיטות הנוכחיות המתוארות בספרות, כגון תוספי קימוגרף של ImageJ, דורשות מעקב ידני אחר קו האמצע של התא המקוטב המעניין, משימה שהיא לא רק גוזלת זמן אלא גם מועדת לטעויות אנוש. מכיוון שהגדרת קו האמצע בצנרת זו נתמכת בשיטה נומרית18,19 המבצעת שלד, מוסרת הערכה סובייקטיבית, ומציגה תקן כמותי לנוהל. זה שימושי במיוחד עבור חוקרים עם כמויות גדולות של נתונים, עם.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברי כתב היד אינם מצהירים על אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה למענקי FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, GM131043 המענקים של NIH R01 ומענקי NSF MCB1714993, MCB1930165 לתמיכה כספית. נתוני שיער השורש הופקו עם התשתית ובהנחייתם של פרופ' אנדריאה באסי ופרופ' אלכס קוסטה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GithubGithubhttps://github.com/badain/amebas
Google ColabGooglehttps://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
  2. Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
  3. Palanivelu, R., Preuss, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell PolarityRatiometric FluorescenceMidline ExtractionBackground SubtractionSingle Cell AnalysisFluorescence Time LapseCell SegmentationSkeletonizationKymograph GenerationPolarized Cells

Related Articles