כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת תרבית תלת ממדית של ספרואידים של קווי תאים עובריים ודגי זברה בכבד
במאמר זה
סיכום
תקציר
קווי תאי דגים מבטיחים מודלים במבחנה להערכת רעילות אקולוגית; עם זאת, למערכות תרבית חד-שכבתיות קונבנציונליות (תרבית דו-ממדית) יש מגבלות ידועות (למשל, אריכות ימים בתרבית ותחזוקה של חלק מהתפקודים התאיים in vivo ). לפיכך, הוצעו תרביות תלת-ממדיות, כגון ספרואידים, שכן מודלים אלה יכולים לשחזר מבנים דמויי רקמות, וללכוד טוב יותר את תנאי in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים עם שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים). הפרוטוקול מורכב מציפוי התאים בצלחת בעלת תחתית עגולה, נמוכה במיוחד, בעלת 96 בארות. לאחר 5 ימים תחת רעידות מסלוליות (70 סל"ד), נוצר ספרואיד יחיד לכל באר. הספרואידים שנוצרו מציגים גודל וצורה יציבים, ושיטה זו מונעת היווצרות של ספרואידים מרובים בבאר; לכן, אין צורך לבחור ידנית ספרואידים בגדלים דומים. הקלות, המהירות ויכולת השחזור של שיטה ספרואידית זו הופכים אותה לשימושית עבור בדיקות מבחנה בעלות תפוקה גבוהה.
מבוא
ספרואידים הם כדורים קטנים של תאים הנוצרים כאשר תאים מתורבתים במגע קרוב בין תאים בתרבית תלת-ממדית. היכולת של ספרואידים לחקות את סביבת הרקמה in vivo כבר נחקרה במגוון קווי תאים ותאים ראשוניים 1,2. עם זאת, למרות שספרואידים מפותחים היטב עבור מחקרי רעילות יונקים, הפיתוח של ספרואידים למחקרי רעילות עם בעלי חוליות שאינם יונקים (למשל, דגים) עדיין בעיצומו3. עבור קווי תאי דגים, ספרואידים פותחו במגוון שיטות שונות, כגון טלטול אורביטלי (OS) באמצעות סוגים שונים של לוחות באר 3,4,5,6,7....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
שלבי המפתח ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S בלוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות מוצגים באיור 1.
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור פתרונות ומדיית תרבות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. תרביות מדיום וחד-שכבתיות של תרביות תאים
- לגדל את שני קווי התאים (ZFL, ZEM2S) כחד-שכבות באינקובטור ב-28°C ללאCO2, ולגדל אותם בתת-גידול ביחס של 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש ~80%.
- התחל עם בקבוק T75 של תאי דג זברה במפגש ~80%, בתרבית כמתואר לעיל.
- הסר את ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ספרואידים בודדים לכל באר עם גודל וצורה יציבים נוצרים בשיטה זו. איור 2 מדגים את תהליך ההיווצרות של ספרואידים בודדים של תאי ZFL ו-ZEM2S בבאר של צלחת ULA תחת טלטול אורביטלי (70 סל"ד). לקווי התאים ZFL ו-ZEM2S יש התנהגויות שונות בתרבית תלת-ממדית. קו התאים ZEM2S מציג תכונות שמעניקות את היכולת ליצור בקלות צורה ספרואידית מאז היום הראשון של הרעידה המסלולית (איור 2E), בעוד שקו תאי ZFL דורש 5 ימים כדי להגיע לצורה הכדורית הרצויה (איור 2.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זוהי שיטה פשוטה, קלה ומהירה ליצירת ספרואידים של קווי תאי כבד ועובר של דגי זברה. שיטה זו פותחה על ידי קבוצה זו בהתבסס על שינויים של שיטות ספרואידים תלת ממדיות קיימות כדי להתגבר על בעיות שדווחו במחקרים מדעיים הקשורים להיווצרות ספרואידים, כמו גם אי ודאויות בדיוק הנתונים מבדיקות ספרואידים תלת ממדיות. לדוגמה, הבעיות המדווחות נעוצות בקשיי טיפול, באופי הגוזל זמן של יצירת ספרואידים, בצורך לבחור ספרואידים בגודל ובצורה דומים לביצוע בדיקה, כמו גם קשיים בתהליך העברת הספרואידים מהטיפות למיקרו-צלחות בשיטת הטיפה התלויה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
לזכרו של ד"ר מרסיו לורנצ'יני, מחבר שותף של עבודה זו, חוקר מעולה בתחום הקוסמטיקה ומוקדש לקידום המחקר הקוסמטי בברזיל. המחברים אסירי תודה למעבדה מרובת המשתמשים במחלקה לפיזיולוגיה (UFPR) על זמינות הציוד ועל התמיכה הכספית של התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES, ברזיל) (קוד האוצר 001) וה- Grupo Boticário.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 96 בארות שקוף תחתון עגול נמוך במיוחד Microplate, עטוף בנפרד, עם מכסה, | קורנינג | 7007 | |
| DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה, פירובט | Gibco | 12800-017 | |
| תערובת חומרים מזינים F-12 של Ham, אבקת | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| עיבוד וניתוח תמונה ב-Java ( ImageJ) תוכנת 1.52p | National Institutes of Health, ארה"ב | זמין ב: | |
| https://imagej.nih.gov/ij/index.html L-15 Medium, אבקת | Gibco | 41300021 | |
| Orbital Shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 מ"מ קוטר סיבוב |
| Dulbeccos PBS (10x) עם סידן ומגנזיום | Invitrogen | 14080055 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 בינוני | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - סרום בקר עוברי, מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA | Gibco | 12657-029 | |
| נתרן ביקרבונט, אבקה, ביו-ריאגנט לביולוגיה מולקולרית | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| כתם כחול טריפן (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום | Gibco | 15400054 | |
| קו תאים ZEM2S | ATCC | CRL-2147 | קו תאים זה נתרם באדיבות על ידי פרופסור ד"ר מייקל J. Carvan (אוניברסיטת ויסקונסין, מילווקי, ארה"ב) |
| קו תאים ZFL | BCRJ | 256 |
מקורות
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
