מאמר שיטה

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

DOI:

10.3791/64871

⸱

26 במאי 2023

 ,  , 
1The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים מטאפלסטיים של הלבלב הם מבשרי תאים ממאירים המעוררים גידולים בלבלב. עם זאת, בידוד תאי לבלב שלמים הוא מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. התאים יכולים לשמש לריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) או לתרבית משותפת דו-ממדית או תלת-ממדית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלבלב כולל שתי מערכות עיקריות: המערכת האנדוקרינית, המייצרת ומפרישה הורמונים, והמערכת האקסוקרנית, המהווה כ-90% מהלבלב וכוללת תאים המייצרים ומפרישים אנזימי עיכול. אנזימי העיכול מיוצרים בתאי הלבלב האצינאריים, מאוחסנים בשלפוחיות הנקראות זימוגנים, ולאחר מכן משוחררים לתריסריון דרך צינור הלבלב כדי להתחיל תהליכים מטבוליים. האנזימים המיוצרים על ידי תאי אצינר יכולים להרוג תאים או לפרק RNA ללא תאים. בנוסף, תאים אצינאריים הם שבירים, ופרוטוקולי דיסוציאציה נפוצים גורמים למספר רב של תאים מתים ופרוטאזות ו-RNases נטולי תאים. לכן, אחד האתגרים הגדולים ביותר בעיכול רקמת הלבלב הוא שחזור תאים שלמים וברי קיימא, במיוחד תאים אצינריים. הפרוטוקול המוצג במאמר זה מציג שיטה דו-שלבית שפיתחנו כדי לענות על צורך זה. הפרוטוקול יכול לשמש לעיכול לבלב תקין, לבלב הכולל נגעים טרום ממאירים, או גידולי לבלב הכוללים מספר רב של תאי סטרומה ומערכת החיסון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד מסוגי הסרטן האגרסיביים ביותר1. ראיות קליניות תומכות ברעיון כי PDAC מתפתח מתאי מערכת אקסוקרינית, כולל תאים אצינריים, במשך שנים רבות, מונע על ידי מוטציות בפרוטו-אונקוגןKRAS 2.

גידולי לבלב כוללים סוגי תאים רבים ושונים, והוכח כי תאים ממאירים מהווים רק 20%-50% ממסת הגידול3. סוגי תאים שונים מתקשרים עם תאי האפיתל, תומכים בטרנספורמציה שלהם ומשפרים את היווצרות הגידול וצמיחתו. אירועים מוקדמים גורמים למטאפלזיה אצינרית, אשר מעוררת נגעים מיקרוסקופיים הנקראים ניאופלזיה תוך-אפיתליאלית של הלבלב (PanINs), אשר יכולים במקרים מסוימים להתפתח ל-PDAC4.

יש צורך קריטי לחקור אינטראקציות אלה ולכוון אותות מרכזיים. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) היא שיטה רבת עוצמה החושפת ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד, ובכך עוקבת אחר השינויים שעוברים תאי אפיתל, ובכך מאפשרת לחקור את התפתחות סרטן הלבלב.

דיסקציה ועיכול רקמות לתאים בודדים היא השלב הראשון בניסוי scRNA-seq. מספר גורמים הופכים את עיכול רקמת הלבלב למאתגר במיוחד: 1) תאי אצינר מהווים יותר מ-90% מהלבלב ותאי אצינר מכילים כמויות גדולות של אנזימי עיכול, כולל פרוטאזות ו-RNases המפחיתים את איכות הספריות מבוססות RNA; (ii) תאים אצינאריים רגישים מאוד ועשויים לשכב אם משתמשים בפרוטוקולים סטנדרטיים; (iii) תאי אצינר מבטאים מספר קטן של גנים ברמות גבוהות מאוד. לכן, אם תאים אלה הם lysed במהלך הניסוי, זה יכול לזהם את פרופיל ביטוי גנים שנצפה של תאים אחרים; (iv) רקמת הלבלב שהתאוששה מגידולים היא דסמופלסטית, ולכן קשה לנתח אותה מבלי לפגוע בתאים. לכן, למרות שנדרשת שמירה על כדאיות גבוהה של כל סוגי התאים, מספרם הרב ורגישותם של התאים האצינאריים מוסיפים מורכבות נוספת. גורמים אלה מערימים קשיים בהשגת תרחיף חד-תאי שהוא בר-קיימא ביותר מ-80% ואין לו גושים, כפי שנדרש בניסויי scRNA-seq.

כאן, פיתחנו פרוטוקול באמצעות טריפסין C ו collagenase P, יחד עם ניטור רקמות תכוף. זה תומך בדיסוציאציה לתאים בודדים תוך שמירה על כדאיות גבוהה לתמיכה בהצלחת ניסויי scRNA-seq 5,6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ועדת האתיקה המשותפת (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים) של האוניברסיטה העברית (ירושלים, ישראל) והמרכז הרפואי הדסה (ירושלים, ישראל) אישרה את פרוטוקול המחקר לרווחת בעלי חיים (MD-18-15417-5 "דינמיקה של רקמות בסרטן הלבלב בעכברים"), והפרוטוקול המוצג כאן עמד בכל התקנות האתיות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים. האוניברסיטה העברית היא אגודה להערכה והסמכה של המכון הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה.

הערה: מלאי זן העכבר #007908, מלאי #019378 ומלאי #008179 התקבלו מהמעבדה של ג'קסון. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; עכברי Rosa26LSL-tdTomato) נוצרו על ידי חציית הזנים הנ"ל. עכברים משני המינים, בגילאי 6 שבועות עד 15 חודשים, שימשו למחקר. טמוקסיפן הוכן על ידי המסת האבקה בשמן תירס. עכברים בוגרים (בני 6-8 שבועות, נקבות וזכרים), קיבלו הזרקה תת עורית של טמוקסיפן בימים 0 ו-2 במינון של 400 מ"ג/ק"ג ונבדקו פעמיים בשבוע לאחר ההזרקה. לא ניתן היה למדוד גידולים מכיוון שהם היו ממוקמים באופן פנימי; לכן, המתת חסד בוצעה אם נצפו סימנים קליניים חריגים על פי הפרוטוקול האתי. עכברים הומתו בנקודות זמן שונות לאחר השראת טמוקסיפן, באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם.

1. דיסקציה של הלבלב

הערה: לקבלת תפוקה אופטימלית במהלך החילוץ וכדי להבטיח כדאיות תאים טובה, דיסקציה מהירה היא קריטית. כדי לקצר את הזמן הדרוש לבידוד הלבלב, כל המכשירים והציוד חייבים להיות מוכנים על קרח לפני המתת העכבר.

  1. יש להרדים את העכבר על ידי חנקCO2 ולוודא באמצעות נקע צוואר הרחם. משלב זה ואילך, כל ההליכים חייבים להתבצע עם מכשירי ניתוח סטריליים.
  2. תקן את העכבר ורסס את הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך בצורת V של 2.5 ס"מ באזור איברי המין עם מספריים ומלקחיים ולהמשיך כלפי מעלה כדי לפתוח באופן מלא את חלל הבטן.
  3. אתר את הבטן בצד שמאל של העכבר. אתר את הלבלב, שנמצא ליד הטחול. מפרידים את הלבלב מהקיבה והתריסריון באמצעות שתי מלקחיים (ללא קריעה). המשיכו להפריד את הלבלב מהמעי הדק, הג'ג'ונום והאיליאום.
  4. הזז את הלבלב לצד ימין של העכבר. להפריד את החיבורים הנותרים בין הלבלב לבין חלל החזה עם מלקחיים כדי לנתק לחלוטין את הלבלב ואת הטחול המחובר.
  5. מוציאים את הלבלב ופורסים אותו לבדיקה בצלוחית פטרי על קרח.
    הערה: יש להקפיד במהלך שלב זה להסיר רק את הלבלב, ולא להסיר רקמת שומן מזנטרי או רקמה סמוכה אחרת יחד עם הלבלב, כדי למנוע זיהום תאי.

2. דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של הלבלב

  1. הכינו מראש את המאגרים הבאים.
    1. חיץ דיסוציאציה 1: 4 מ"ל של טריפסין C + 6 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלה 1) עבור כל דגימה.
    2. חיץ דיסוציאציה 2: 9 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת הנקס′ (HBSS) 1x; אלבומין בסרום בקר 4% (BSA); 1 מ"ל של collagenase P (10 מ"ג / מ"ל); 200 μL של מעכב טריפסין (10 מ"ג / מ"ל); ו-200 μL של DNase I (10 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלה 1).
    3. חיץ שטיפה: 50 מ"ל של HBSS 1x; 2 גרם של BSA; 1 מ"ל של מעכב טריפסין (10 מ"ג / מ"ל); ו-1 מ"ל DNase 1 (10 מ"ג/מ"ל).
    4. תמיסת עצירת פעילות אנזימים: HBSS 1x המכיל 5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-150 גרם DNase I (0.2 מ"ג/מ"ל).
  2. מניחים את הלבלב בצינור 50 מ"ל על קרח. שטפו את הלבלב ב-10% FBS ב-HBSS 1x. רקמת השומן תצוף והלבלב ישקע. זוהי דרך קלה לדמיין ולהסיר במהירות את רקמת השומן הלבן המזהמת עדיין מחובר ללבלב.
  3. מעבירים את רקמת הלבלב של העכבר לצלחת פטרי סטרילית המכילה 5 מ"ל HBSS 1x על קרח. חתכו את הלבלב לחתיכות קטנות של 1 עד 3 מ"מ3 באמצעות מספריים Noyes ואזמל (איור 2A). במקרה של יותר מדגימה אחת, יש לשמור את הדגימות על קרח ב-10% FBS/HBSS 1x.
  4. מעבירים את הרקמות לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 350 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר שברי תאים ותאי דם.
  5. השהה מחדש את החלקים במאגר דיסוציאציה 1 המכיל 0.02% טריפסין C-0.05% EDTA למשך 10 דקות ב-37°C עם תסיסה (180 סל"ד). יש לשטוף מיד עם 10% FBS/Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 350 גרם ב 4 ° C.
  6. יש לשטוף שוב על ידי השעיית הגלולה ב-10 מ"ל של חיץ כביסה וצנטריפוגה ב-350 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לפני שלב הדיסוציאציה הבא.
  7. לדגור על הלבלב בחיץ דיסוציאציה 2 למשך 15 דקות ב-37°C עם תסיסה (180 סל"ד).
  8. לאחר 15 דקות, לבצע דיסוציאציה מכנית על ידי pipeting נמרצות את שברי הלבלב למעלה ולמטה פיפטות סטריליות בגודל הולך ופוחת (25, 10, ו 5 מ"ל פיפטות סרולוגיות) 10 פעמים ולהביא בחזרה ל 37 ° C.
    1. לאחר 5 דקות נוספות, חזור על הדיסוציאציה המכנית והשתמש במיקרוסקופ אור כדי לפקח על הדיסוציאציה בהתאם לכמות ההשעיה של תא בודד. בדרך כלל אם בשלב זה, פחות מ -90% מההשעיה מורכבת מתאים בודדים מבודדים, יש צורך בזמן דגירה ארוך יותר. השתמש בכחול טריפאן כדי לפקח על כדאיות התא.
    2. המשך עם הדגירה ולקחת דגימות כדי לזהות את הדיסוציאציה כל 5 דקות.
      הערה: זמן הדגירה הכולל תלוי ברקמה ויכול להשתנות בין דגימות. הדגירה ודיסוציאציה של רקמות אמורות להסתיים כאשר 90% מהתאים מופרדים לתאים בודדים או כאשר מתגלה ירידה בכדאיות.
  9. לאחר שרקמת הלבלב מנותקת היטב (בהתאם להיעלמות מקטעי הלבלב ולעכירות הגוברת של התמיסה) (איור 2), עצרו את התגובה האנזימטית על-ידי שטיפה פעמיים עם תמיסת עצירת פעילות האנזים למשך 5 דקות ב-4°C. משלב זה, שמור את תרחיף התא על קרח.
  10. העבירו את מתלה התא דרך רשת ניילון של 70μm ובדקו את כדאיות התא תחת המיקרוסקופ. גדלים קטנים יותר של רשת ניילון עשויים להפחית את כדאיות התא.
  11. להשהות ולשטוף את הגלולה עם 5-10 מ"ל של תמיסת כביסה חוצצת קרה כקרח. ספור את התאים.
  12. אם נצפים מספר תאי דם אדומים, יש לטפל בתאים עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. במקרים בהם נצפים גושים, יש לטפל שוב במדגם עם טריפסין, כמתואר בשלב 2.5. הכדאיות מזוהה עם כחול טריפאן מתחת למיקרוסקופ, ואם הכדאיות נמוכה מ-80%, יש לבודד תאים חיים באמצעות ערכת מיון תאים מתים (MACS) המופעלת מגנטית עם עמודות MACS MS (ראה טבלה 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה5 שפורסמה לאחרונה, יישמנו את הפרוטוקול המתואר לעיל כדי לחקור את השלבים המוקדמים של פיתוח PDAC באמצעות מודל עכבר. העכבר הונדס גנטית כך שיכלול את הקלטות Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato 7, המאפשרות ביטוי של KRAS פעיל באופן קונסטיטוטיבי בתאי אצינר לאחר הזרקת טמוקסיפן.

לאחר פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקול האתי של העכבר), הלבלב נכרת, והפרוטוקול שתואר לעיל יושם (ראו איו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה נציג פרוטוקול לדיסוציאציה של רקמת הלבלב. הפרוטוקול פשוט, קל לשימוש ומספק כלי לבידוד תאים בודדים ברי קיימא מרקמת הלבלב בשלבים שונים בתהליך הממאירות, כולל גידולים מוצקים. במחקרים קודמים, סוגים שונים של collagenases שימשו לעיכול הלבלב 8,9. שימוש ב-collagenase חזק מאוד, כגון collagenase D, גורם לאוכלוסייה גדולה של תאי מערכת החיסון ולאחוז נמוך יותר של תאי אפיתל. השימוש ב- collagenase P מאפשר עיכול לבלב המתאים לרקמת לבלב שלמה או גידולית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר אביטל סרוסי-פורטוגז על העזרה בניתוח הנתונים ולד"ר דרור קולודקין-גל על הסיוע בביסוס הפרוטוקול במחקר קודם. אנו מודים לכל חברי מעבדת פרנס בעבר ובהווה. אנו מודים לד"ר ג'יליאן קיי ולד"ר מיכאל קנובסקי על עזרתם בעריכה. פרויקט זה זכה למימון ממענק הקרן הלאומית למדע (מס' 526/18), תוכנית אלכס א. סויקה, ומענק מהקרן לחקר הסרטן (פרס לפיתוח קריירת מחקר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגיב או משאב
70 ומיקרו; רשת ניילון M חתול קורנינג##431751
BSAסיגמא אולדריץ'חתול# A7906
קולגנאז Pחתול רוש11213857001
בדיקה
DAPIסיגמא אולדריץ'חתול#MBD0015
Dnase Iחתול רוש10104159001
מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/ זנים
סרום בקר עוברי חתול תרמו-פישר דרום אמריקאי10270106
חתול תמיסת מלח מאוזנת של הנקסתעשיות ביולוגיות#02-018-1A 
KRASLSL-G12D עכברימעבדת ג'קסוןJAX008179
ערכת הסרת תאים מתים MACSMilteny Bioteccat#130-090-101
PBSתעשיות ביולוגיותחתול#02-023-1A 
Ptf1a-CreER עכבריםמעבדת ג'קסוןJAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdעגבניות עכבריםמעבדת ג'קסוןJAX007908
טריפסין C-EDTA 0.05%תעשיות ביולוגיותcat# 03-053-1A
טריפסין מעכבחתול רושT6522
# מסחרית קריטית# ##

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  3. Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777(2019).
  4. Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
  5. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).
  6. Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
  7. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
  8. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  9. Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
  10. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
  11. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
  12. Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
  13. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים