מאמר שיטה

קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

DOI:

10.3791/64874

⸱

19 במאי 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיה מתארת את הייצור של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) ואת יישומם להערכה חוץ גופית של מועמדים אנטיגניים במהלך הפיתוח של חיסונים וטרינריים פוטנציאליים בבקר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטיים (DCs) הם התאים מציגי האנטיגן (APC) החזקים ביותר במערכת החיסון. הם מסיירים באורגניזם בחיפוש אחר פתוגנים וממלאים תפקיד ייחודי במערכת החיסון על ידי קישור בין תגובות החיסון המולדות והנרכשות. תאים אלה יכולים לבצע פגוציטים ולאחר מכן להציג אנטיגנים שנלכדו לתאי מערכת החיסון המשפיעים, מה שמעורר מגוון רחב של תגובות חיסוניות. מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לייצור במבחנה של תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר (MoDCs) שבודדו מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים של בקר (PBMCs) ויישומם בהערכת אימונוגניות חיסונים.

מיון תאים מבוסס מגנטית שימש לבידוד מונוציטים CD14+ מ- PBMCs, ותוספת של מדיום תרבית שלם עם אינטרלוקין (IL)-4 וגורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שימשה כדי לגרום להתמיינות של מונוציטים CD14+ ל- MoDCs נאיביים. הדור של MoDCs לא בשלים אושר על ידי זיהוי הביטוי של קומפלקס היסטותאימות גדול II (MHC II), CD86 ו- CD40 פני השטח של התא. חיסון כלבת זמין מסחרית שימש כדי לפעום את MoDCs לא בשלים, אשר לאחר מכן תורבתו יחד עם לימפוציטים נאיביים.

ניתוח ציטומטריית הזרימה של MoDCs פועמים אנטיגן ותרבית לימפוציטים משותפת חשף את הגירוי של התפשטות לימפוציטים מסוג T באמצעות ביטוי של סמני Ki-67, CD25, CD4 ו- CD8. ניתוח ביטוי ה-mRNA של IFN-γ ו-Ki-67, תוך שימוש ב-PCR כמותי, הראה כי ה-MoDCs יכולים לגרום לפרימה ספציפית לאנטיגן של לימפוציטים במערכת זו של תרבית משותפת במבחנה . יתר על כן, הפרשת IFN-γ שהוערכה באמצעות ELISA הראתה טיטר גבוה משמעותית (**p < 0.01) בתרבית הלימפוציטים MoDC-לימפוציטים פועמת חיסון כלבת מאשר בתרבית לימפוציטים MoDC-לימפוציטים ללא אנטיגן. תוצאות אלה מראות את התוקף של בדיקת MoDC במבחנה זו למדידת אימונוגניות חיסונים, כלומר ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים לחיסון בקר לפני שתמשיך בניסויי in vivo , כמו גם בהערכות אימונוגניות חיסונים של חיסונים מסחריים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיסון וטרינרי מייצג היבט מכריע של גידול בעלי חיים ובריאותם, שכן הוא תורם לשיפור הביטחון התזונתי ורווחת בעלי החיים על ידי הענקת הגנה מפני מחלות המשפיעות על משק החי ברחבי העולם1. שיטה יעילה במבחנה להערכת האימונוגניות של מועמדים אפשריים לחיסון תסייע להאיץ את תהליך הפיתוח והייצור של חיסונים. לכן, יש צורך להרחיב את תחום בדיקות החיסון עם מתודולוגיות חדשניות המבוססות על מחקרי מבחנה , שכן זה יעזור לחשוף את המורכבות של תהליכים חיסוניים הקשורים חיסון זיהום פתוגן. כיום, מחקרי חיסון ואתגר של בעלי חיים in vivo , הדורשים דגימה תקופתית (למשל, דם וטחול), משמשים למדידת האימונוגניות של חיסונים ואדג'ובנטים מועמדים. בדיקות אלה יקרות, גוזלות זמן ויש להן השלכות אתיות, מכיוון שברוב המקרים, המתת חסד של בעלי חיים מתבצעת עד סוף הניסויים.

כחלופה למבחני in vivo, תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) שימשו להערכת תגובות חיסוניות המושרות על ידי חיסונים במבחנה2. PBMCs הם אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מ 70%-90% לימפוציטים, 10%-20% מונוציטים, ומספר מוגבל של תאים דנדריטיים (DCs, 1%-2%)3. PBMCs מכילים תאים מציגי אנטיגן (APC) כגון תאי B, מונוציטים ו-DC, אשר מסיירים ללא הרף באורגניזם בחיפוש אחר סימני זיהום או נזק לרקמות. כימוקינים המופרשים באופן מקומי מאפשרים גיוס והפעלה של נגמ"שים לאתרים אלה על ידי קשירה לקולטני פני השטח של התא. במקרה של מונוציטים, כימוקינים מכוונים את גורלם להתמיין ל-DCs או למקרופאגים4. ברגע ש-DCs נתקלים בפתוגן ולוכדים אותו, הם נודדים לאיברי לימפה משניים, שם הם יכולים להציג את האנטיגנים הפפטידיים המעובדים של הפתוגן באמצעות חלבוני שטח מסוג I או Class II של קומפלקס היסטותאימות עיקריים (MHC) לתאי CD8+ T או CD4+ T, בהתאמה, ובכך לעורר תגובה חיסונית 5,6.

תפקיד המפתח שממלאים DCs בתיאום תגובה חיסונית מגנה מפני פתוגנים שונים הופך אותם ליעד מחקרי מעניין להבנת מנגנוני חיסון תוך-תאיים, במיוחד בעת תכנון חיסונים ואדג'ובנטים נגד גורמים זיהומיים7. מכיוון שחלק ה- DCs שניתן להשיג מ- PBMCs הוא קטן למדי (1%-2%), מונוציטים שימשו במקום זאת ליצירת DCs במבחנה8. DCs אלה שמקורם במונוציטים (MoDCs) פותחו בתחילה כאסטרטגיית טיפול אפשרית באימונותרפיה לסרטן9. לאחרונה, MoDCs שימשו למחקר חיסונים 10,11,12, ומונוציטים קלאסיים הם תת-הסוג הדומיננטי (89%) לייצור MoDC 13. הייצור של MoDCs במבחנה הושג בעבר באמצעות תוספת של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) שניתן בשילוב עם ציטוקינים אחרים כגון אינטרלוקין-4 (IL-4), גורם נמק הגידול α (TNF-α), או IL-1314,15,16.

ההצלחה של בדיקת MoDC במבחנה מסתמכת על היכולת של MoDCs בוגרים מעוררי אנטיגן לווסת את ההיקף והסוג של התגובה החיסונית הספציפית לסוג האנטיגן שזוהה17. סוג הפתוגן המוכר ומוצג על ידי MoDCs קובע את ההתמיינות של תאי CD4+ T עוזר (Th) לתאי השפעה Th1, Th2 או Th17 ומאופיין בפרופיל ציטוקין מפריש ספציפי לפתוגן. תגובת Th1 מופעלת נגד פתוגנים תוך-תאיים וגורמת להפרשת אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול בטא (TNF-β), המווסת הגנה תלוית פגוציטים. תגובת Th2 מופעלת נגד אורגניזמים טפיליים ומאופיינת בהפרשת IL-4, IL-5, IL-10 ו-IL-13, היוזמת הגנה הומורלית בלתי תלויה בפאגוציטים. Th17 מציע הגנה תלוית נויטרופילים מפני זיהומים חיידקיים ופטריות חוץ-תאיים בתיווך הפרשת IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ו-TNF-α 18,19,20,21. בהתבסס על מחקרים קודמים, צוין כי לא כל הפתוגנים נופלים בפרופיל הציטוקינים הצפוי. לדוגמה, MoDCs עוריים, בתגובה לזיהום טפילי לישמניה, מעוררים הפרשת IFN-γ מתאי T CD4+ ותאי T CD8+, ובכך גורמים לתגובת Th1 פרו-דלקתית מגנה22.

כמו כן, הוכח כי בעופות MoDCs עם סלמונלה ליפופוליסכריד (LPS), יכול לגרום לתגובה משתנה נגד סלמונלה טיפימוריום על ידי הפעלת תגובות Th1 ו- Th2, בעוד סלמונלה גלינרום גורם לתגובת Th2 בלבד, מה שיכול להסביר את ההתנגדות הגבוהה יותר של האחרון לקראת אישור MoDC23. ההפעלה של MoDCs נגד Brucella canis (B. canis) דווחה גם בכלבים ובבני אדם, כלומר זה יכול לייצג מנגנון זיהום זואונוטי24. MoDCs אנושיים עם B. canis גורמים לתגובת Th1 חזקה המקנה עמידות לזיהום חמור, בעוד ש-MoDCs לכלבים גורמים לתגובת Th17 דומיננטית עם תגובת Th1 מופחתת, מה שמוביל לאחר מכן לביסוס זיהום כרוני25. MoDCs של בקר מראים זיקה מוגברת לווירוס מחלת הפה והטלפיים (FMDV) מצומד לאימונוגלובולין G (IgG) בהשוואה ל- FMDV לא מצומד בלבד, שכן MoDCs יוצרים קומפלקס נוגדנים נגיפי בתגובה ל-10 הראשונים. יחד, מחקרים אלה מראים כיצד נעשה שימוש ב-MoDCs כדי לנתח את המורכבות של תגובות חיסוניות במהלך זיהום פתוגן. ניתן להעריך את התגובה החיסונית הנרכשת על ידי כימות של סמנים ספציפיים הקשורים לשגשוג לימפוציטים. Ki-67, חלבון תוך-תאי המזוהה רק בתאים מתחלקים, נחשב לסמן אמין למחקרי התפשטות26, ובאופן דומה, CD25 המתבטא על פני השטח של תאי T בשלב המאוחר של ההפעלה מתאים להתרבות לימפוציטים27,28.

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת לייצור במבחנה של MoDCs בקר, ולאחר מכן יישומם בבדיקת חיסון חוץ גופית המשמשת לבדיקת האימונוגניות של חיסונים. חיסון כלבת זמין מסחרית (RV) שימש כדי לאמת את היעילות של בדיקה זו. הפעלה והתפשטות של לימפוציטים מסוג T נמדדו על ידי ציטומטריית זרימה, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) באמצעות ניתוח של סמני הפעלת תאים מבוססים היטב כגון Ki-67 ו- CD25 והפרשת IFN-γ 28,29,30,31. במהלך הניסוי של משרד ההגנה לא נערכו ניסויים בבעלי חיים או בבני אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף הדם מתבצע על ידי שירות וטרינר מוסמך בהתאם להנחיות האתיות של הסוכנות האוסטרית לבריאות ובטיחות מזון (AGES) ובהתאם לתקנים המקובלים לרווחת בעלי חיים32. המחקר קיבל אישור אתי ממשרד החקלאות האוסטרי. התכנון הניסיוני ליצירת MoDCs ויישומו לאחר מכן מומחש באיור 1.

1. ייצור משרדי ממשלה נאיביים

הערה: דגימות דם שלמות נלקחו מעגל יחיד ללא פתוגן על ידי ניקוב ורידים ג'וגולרי עם vacutainers heparinized (שמונה צינורות דם 9 מ"ל שימשו במחקר זה). העבירו את הדם בקופסת קרח. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, או עבדו אותן מיד. שמור על הדם מסתובב כדי למנוע קרישת דם. לעקר את vacutainers עם 70% אתנול. כל הניסויים הבאים בוצעו עם דגימה ביולוגית אחת ושישה שכפולים טכניים.

  1. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות לבידוד PBMCs מהדם הפריניזציה
    1. מערבבים היטב את הדם על ידי הפיכתו פי 10.
    2. באמצעות פיפטה 10 מ"ל, להעביר 20 מ"ל של דם heparinized לצינור סטרילי 50 מ"ל, ולדלל אותו עם 10 מ"ל של מלוחים חוצץ פוספט (PBS).
    3. פיפטה 15 מ"ל של בידוד לימפוציטים בינוני לצינור סטרילי 50 מ"ל.
      הערה: יש לאפשר למדיום המבודד לימפוציטים להגיע לטמפרטורת החדר לפני הפיפטה.
    4. הטה את צינור 50 מ"ל המכיל את מדיום בידוד הלימפוציטים למצב של 45°. הצבע על קצה פיפטה 25 מ"ל בניצב, ושכב בזהירות את 30 מ"ל הדם PBS על גבי מדיום בידוד הלימפוציטים, מבלי לערבב את השניים. לאט מאוד, להחזיר את הצינור 50 מ"ל למצב אנכי.
    5. צנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 35 דקות ב-20°C עם האצה מרבית וללא בלימה (פונקציית ההאטה כבויה).
    6. השתמש פיפטה פסטר לאסוף את שכבת PBMC (השכבה הלבנה הדקה מיד אחרי השכבה הראשונה של פלזמה) ולהעביר אותו לתוך צינור חדש 50 מ"ל.
      הערה: צנטריפוגת שיפוע צפיפות מפרידה דם שלם לשכבות שונות. כתוצאה מכך, אריתרוציטים להתיישב בתחתית כמו גלולה, תאים mononuclear (PBMCs) להתיישב בשכבת הממשק, ואת פלזמה יוצר את השכבה העליונה. גרנולוציטים נמצאים בין הגלולה לבין שכבת PBMC.
    7. שטפו את מרכזיות הקטיף פי 2 על ידי הוספת PBS עד לנפח של 40 מ"ל וערבוב יסודי על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 500 × גרם ב 4 ° C במשך 7 דקות עם תאוצה מקסימלית האטה מקסימלית.
    8. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי הקנטה, להשהות מחדש את הגלולה ב-15 מ"ל של מאגר אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) אחד, ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
      הערה: אין לדגור במשך יותר מ-15 דקות. מאגר ACK זמין מסחרית משמש כדי להבטיח את הליזה של תאי הדם האדומים שיורית (RBCs) נוכח בחלק PBMC.
    9. הוסף PBS לנפח של 40 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם ו 4 ° C במשך 7 דקות עם האצה והאטה מרביות.
    10. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, וחזרו על שלב 1.1.9.
    11. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מדיום תרבית שלם (בטמפרטורת החדר).
      הערה: מדיום התרבית המלא מורכב ממדיום תרבית תאים RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. הפרדה מגנטית של תאי CD14+/− מאוכלוסיית PBMC באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים CD14
    1. ספור את התאים עם מונה תאי המוציטומטר נקי באמצעות 10 μL של תרחיף תאים מעורבב עם 10 μL של תמיסת טריפאן כחול (0.4%).
      הערה: צבע כחול טריפאן הוא כימיקל רעיל ומסרטן פוטנציאלי. יש לטפל בו בעת לבישת ציוד מגן אישי (PPE) כדי למנוע מגע, ויש להשליך את הפסולת במיכל אטום מיוחד לפסולת רעילה. תאים מתים ייראו כחולים, ואילו תאים חיים ייראו צלולים מתחת למיקרוסקופ.
    2. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
    3. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, והשהו מחדש את הגלולה במאגר מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות נפח של 40 μL לכל 1 × 107 תאים. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
      הערה: מאגר FACS מורכב מ-2% FBS ו-2 mM חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) המומסת ב-PBS.
    4. הוסף 5 μL של CD14 microbead buffer לכל 1 × 107 תאים, וערבב היטב באמצעות פיפטה.
    5. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס לבחירה חיובית של מונוציטים CD14+ בקר33. מערבולת כל 15 דקות במהלך תקופת הדגירה.
    6. שלב אופציונלי (לניתוח ציטומטריית זרימה): הוסף 10 μL של נוגדן מכתים CD14-FITC (fluorescein isothiocyanate) עם דגירה עוקבת למשך 15 דקות ב 4-8 ° C. עיין בניתוח ציטומטריית זרימה בשלב 5 לקבלת פרטים.
    7. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS, וצנטריפוגה למשך 7 דקות ב 500 × גרם.
    8. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ FACS לכל 1 × 108 תאים.
    9. הכנס את עמודת הפרדת התאים האימונומגנטית למפריד (מחזיק הטור המגנטי), ומקם צינור איסוף של 15 מ"ל מתחת לשקע העמוד לאיסוף הזרימה.
    10. שטפו את העמוד עם 1 מ"ל של מאגר FACS נטול גזים. לאחר השטיפה, החלף את הצינור המשומש של 15 מ"ל בחדש.
    11. אפשר לתרחיף התא (משלב 1.2.8) לעבור דרך העמודה על-ידי צנרת 1 × 108 תאים במאגר של 500 מיקרוליטר בכל פעם.
      הערה: שימו לב לא ליצור בועות אוויר בעת ערבוב התאים לפני שתאפשרו להם לעבור דרך העמודה.
    12. שטפו את העמוד 3x עם 3 מ"ל של מאגר FACS נטול גז בכל פעם.
    13. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל הראשון הזה כשבר תא CD14 (PBMCs פחות מונוציטים CD14+ ); זה נקרא גם מקטע הלימפוציטים הנאיביים.
      הערה: תאי CD14− נשמרים בתווך תרבית שלם עד לייצור MoDCs עם פעימות אנטיגן.
    14. הסר את העמודה מהמפריד.
    15. מניחים צינור סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל מתחת לעמוד לאיסוף הקולחים.
    16. פיפטה 5 מ"ל של חיץ FACS לתוך העמודה, ומיד לדחוף אותו באמצעות בוכנה.
    17. אסוף את הזרימה, ותייג את החלק המדולל השני הזה כשבר התא CD14+ ; זה נקרא גם שבר מונוציטים נאיבי.
    18. הוסף מדיום תרבית שלם למונוציטים CD14+ שנקטפו כדי להשיג 1 × 106 תאים / מ"ל.
      הערה: ספור את התאים החיים במקטע התא המדולל CD14+ כדי להעריך את נפח מדיום התרבית המלא הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
    19. קח צלחת סטרילית של 24 בארות, והוסף 1 מ"ל של תרחיף התא (1 × 106 תאים / מ"ל) לכל באר.
  3. בידול של מונוציטים נאיביים CD14+ ל-MoDCs נאיביים על ידי תוספת של קוקטייל ציטוקינים 3% w/v (GM-CSF + IL-4) עם סך של 5 ימי דגירה
    1. יש להוסיף לכל באר המכילה מונוציטים מסוג CD14+ 40 μL (3% w/v) של קוקטייל הציטוקינים המסופק בערכה.
    2. לדגור את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 וב 37 ° C במשך 48 שעות.
    3. ביום השני, העבירו מחצית מתכולת כל באר (500 מיקרוליטר) באמצעות פיפטה לצינורות בודדים של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם ב-4°C למשך 7 דקות.
    4. השליכו את הסופרנטנט, ותלו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם ורענן.
    5. העבר 500 μL של תרחיף תא זה משלב 1.3.4 בחזרה לכל באר ייעודית, כך שהנפח הסופי הוא 1 מ"ל.
    6. העשירו כל באר ב-20 מיקרוליטר קוקטייל ציטוקינים.
    7. לדגור על התרבית במשך 72 שעות באינקובטור לח עם 5% CO2 וב 37 ° C.
    8. לאחר הדגירה ביום 5, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור.
      הערה: כל באר תכיל 1 מ"ל של תרחיף תאים של MoDCs נאיביים. מספר MoDCs יהיה אחוז (~ 20%) מהמונוציטים המקוריים המצופים (1 × 106/מ"ל).

2. בדיקת פעילות אנדוציטית של MoDC

הערה: בדיקת ספיגת האנטיגן או בדיקת הפעילות האנדוציטית מודדת את יכולתם של משרדי משרד תמימים להפנים חומר זר. בצע את הבדיקה באמצעות MoDCs נאיביים בתרבית עם קוקטייל ציטוקינים 3% w / v ועם 5 ימי דגירה, כפי שתואר קודם34.

  1. קצרו את מתלה תאי MoDC התמימים מצלחת 24 הקידוחים, והעבירו אותו לצינור של 15 מ"ל; כמו כן לאסוף את כל התאים שיורית על ידי שטיפת הבארות עם PBS.
  2. צנטריפוגה ל-500 × גרם למשך 7 דקות. להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבית בתוספת 1% FBS.
  3. ספור את תאי MoDC החיים כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה (2 × 10,5 תאים/מ"ל).
  4. תרבית את ה-MoDCs התמימים ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם בצלחת של 24 בארות עם ריכוז תאים סופי של 2 × 105 תאים/מ"ל.
  5. יש להוסיף לכל באר דקסטרן מצומד במינון 1 מ"ג/מ"ל FITC (בדיקה פלואורסצנטית המשמשת כעוקב אנדוציטוזה).
    הערה: FITC-dextran פועל כבדיקה פלואורסצנטית ומשמש כעוקב אנדוציטוזה.
  6. מכסים את הצלחת ודורים בחושך בטמפרטורה של 5% CO2 ו-37°C למשך 60 דקות.
    הערה: עבור בקרת הרקע, דגרו על תאי MoDC נוספים (2 × 105 תאים/מ"ל) עם 1 מ"ג/מ"ל FITC-דקסטרן על קרח, מכיוון שסוג זה של דגירה מונע את כניסתה של מולקולת הנותב (FITC-dextran) לתוך התאים.
  7. לאחר הדגירה, מיד להעביר את צלחת 24 באר על קרח כדי לעצור את אנדוציטוזה של FITC-dextran.
  8. שטפו את התאים עם מאגר FACS קר כקרח.
  9. קציר, צנטריפוגה והשעיה מחדש של הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ FACS.
  10. נתח את עוצמת הפלואורסצנטיות של FITC-דקסטרן בתוך התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. עיין בניתוח ציטומטריית זרימה בשלב 5.2 לקבלת פרטים.

3. ייצור של MoDC בפולסי אנטיגן

הערה: חיסון זמין מסחרית ומאושר קלינית נגד נגיף הכלבת (RV) יכול לגרום להבחנה של MoDCs נאיביים ל-MoDCs בוגרים מציגי אנטיגן. השתמש ב-0.1% (~1 μL) של מנת חיסון אחת נגד קרוואנים כדי לייצר MoDCs עם פעימות אנטיגן. יתר על כן, עדיף לייצר MoDCs בפולסי RV באותה לוחית תרבית המשמשת (בשלב 1.3.8) ליצירת MoDC נאיביים, מכיוון שהעברת MoDCs נאיביים לצלחת חדשה בת 24 בארות תשפיע עליהם לרעה.

  1. משלב 1.3.8) הוסף 1 μL/mL של מתלה RV ל-1 מ"ל של תרבית MoDC נאיבית בלוח 24 הקידוחים, ודגור במשך 48 שעות ב-5% CO2 ו-37°C.
    הערה: MoDCs נאיביים בתרבית ללא גירוי RV משמשים כבקרת רקע (וכגירוי לא ספציפי לתרבית משותפת עם לימפוציטים בשלבים הבאים).
  2. לאחר הדגירה, ביום השביעי, יש לשמור את הצלחת בת 24 הקידוחים המכילה את פעימות האנטיגן MoDCs על קרח למשך 10 דקות.
  3. הוסף 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכל באר. מערבבים היטב כל באר על ידי פיפטינג, ומעבירים את המתלה לצינור 15 מ"ל.
  4. שטפו את הבארות עם 2 מ"ל של PBS קר כקרח כדי לאסוף את התאים השיוריים שנותרו בתוך כל באר.
  5. מעבירים את התכולה לצינורות המתאימים שלהם, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 500 × גרם למשך 7 דקות.
  6. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את כדורית התא (MoDCs בפולסי אנטיגן) בתווך תרבית שלם, ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז התא הסופי של 1 × 105 תאים/מ"ל.
    הערה: ספור את התאים החיים כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה. השתמש ב- MoDCs פועמים של קרוואנים מהיום השביעי עבור מערכת התרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC.

4. תרבית משותפת של לימפוציטים MoDC

הערה: מערכת התרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC במבחנה קובעת את היכולת של MoDCs לראשוני לימפוציטים ספציפיים לאנטיגן. קבוצות הטיפול השונות של תאים לאחר 16 ימים של תרבית משותפת כוללות ספציפיות, לא ספציפיות וביקורת. הקבוצה הספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs פועמים של RV; הקבוצה הלא ספציפית מוגדרת כלימפוציטים בתרבית משותפת עם MoDCs שאינם פועמים באנטיגן; וקבוצת הביקורת מוגדרת כלימפוציטים בתרבית ללא MoDCs.

  1. הוסף מדיום תרבית שלם למקטע הלימפוציטים הנאיבי המדולל (תאי CD14- ) כדי להשיג ריכוז תאים של 2 × 106 תאים / מ"ל.
    הערה: ספור את התאים החיים בתרבית התאים CD14 שנשמרו בתווך תרבית שלם בצלחת של 24 בארות מאז איסופם כדי להעריך את נפח התווך הדרוש להשגת ספירת התאים הרצויה.
  2. ביום השביעי, קחו צלחת סטרילית של 24 בארות, וזרעו את הבארות עם 1 מ"ל של תרחיף תאי לימפוציטים נאיבי (2 × 106 תאים/מ"ל) בתוספת 1 מ"ל של תרחיף MoDC בפולס אנטיגן או ללא פעימות אנטיגן (1 × 105 תאים/מ"ל).
    הערה: הנפח הכולל בכל באר יהיה 2 מ"ל עם יחס של 1:20 MoDCs ללימפוציטים לכל באר.
  3. לדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
  4. העשרה ורסטימולציה בתרבית עם MoDCs בפולסי אנטיגן
    1. לאחר הדגירה של תרבית לימפוציטים MoDC-פועמת אנטיגן, ביום 9, להשלים כל באר עם 20 ng/mL רקומביננטי IL-2, ולהמשיך לדגור עוד 120 שעות (5 ימים דגירה).
    2. ביום ה-14, העבירו 1 מ"ל של התרבית המשותפת לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 7 דקות.
    3. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את כדורית התא עם 1 מ"ל של MoDCs דופקי אנטיגן או לא פועמים (1 × 105 תאים/מ"ל). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג, ומעבירים את מתלי התאים בחזרה לבארות המיועדות להם.
      הערה: בשלב זה, הנפח הכולל בכל באר הוא 2 מ"ל.
    4. המשך עם הדגירה ב 5% CO2 ו 37 ° C במשך 48 שעות. לאחר הדגירה ביום ה -16, התרבות המשותפת מוכנה לניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה, qPCR ו- ELISA.
      הערה: עבור כל 2 מ"ל בכל באר של תרבית לימפוציטים MoDC, 1 מ"ל של תאים מרחפים מוכתמים עבור ציטומטריית זרימה, 1 מ"ל משמש למיצוי RNA, והסופרנאטנטים משניהם משמשים עבור ELISA.

5. ניתוח ציטומטרי זרימה

הערה: צבעו את התאים בסמנים מתאימים/mAb לפני הפעלת הדגימות על ציטומטר זרימה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ריאגנטים (צביעת mAb ופקדי איזוטיפ), ערכה, מכשיר ותוכנה המשמשים לניתוח ציטומטריית זרימה.

  1. פרוטוקול צביעת ציטומטר זרימה
    הערה: בצע צביעה של פני השטח של התא עבור PBMCs ולימפוציטים ומונוציטים נאיביים באמצעות anti-CD14 mAb (שלב 1.2.6). לצביעת פני התא של MoDCs נאיביים, השתמש ב- mAb ספציפי ל- CD86, ספציפי ל- CD40 וספציפי ל- MRC II. עבור צביעת פני התא של תאים מהיום 16 תרביות משותפות, להשתמש אנטי CD4, אנטי CD8, אנטי CD25 mAbs; עבור צביעה תוך תאית, להשתמש אנטי Ki-67 mAb. יתר על כן, להכתים את התאים עם בקרת איזוטיפ שלילי mAb או ללא mAb (FMO: פלורסנט מינוס אחד). ההבדל העיקרי בעת צביעה עבור פני השטח וסמנים תוך תאיים הוא כי עבור סמנים פני התא, התאים חייבים להיות מוכתמים עם mAb משטח ספציפי לפני צביעה חיה / מת (L / D) או כל תהליך אחר. עם זאת, צביעה תוך תאית מבוצעת לאחר צביעת L/D ודורשת קיבוע בתוספת שלב חדירה כדי לאפשר חדירה תוך תאית.
    1. מעבירים 1 מ"ל של תרחיף תאים לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, בעת עיבוד התאים מתרבית משותפת של לימפוציטים MoDC, שמור את הסופרנאטנט לניתוח ELISA.
    2. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. לאסוף את התאים שיורית באמצעות 1 מ"ל של PBS, ולשלב את זה עם גלולה resuspended.
    3. הוסף 10 מ"ל PBS לצינור 15 מ"ל המכיל את התאים, ערבב על ידי פיפטינג וצנטריפוגה במשך 7 דקות ב 850 x גרם.
    4. השליכו את הסופר-נטנט וחזרו על שלב 5.1.3.
    5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו בזהירות את כדורית התא עם המתלה השיורי (כ-180 מיקרוליטר) שנותר לאחר פירוק הסופרנטנט.
    6. מעבירים את מתלה התא לצלחת V בעלת 96 בארות, ואטמו את הבארות כדי למנוע שפיכה.
    7. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הצלחת מעל מיכל פסולת כדי לרוקן את בארות הנוזלים, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להבטיח סילוק נוזלים עודפים.
    8. יש להוסיף 25 μL של תערובת מאסטר לצביעת פני השטח לכל באר, ולערבב בעדינות באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לדגור בחום של 4°C למשך 30 דקות.
      הערה: כדי להכין תערובת מאסטר לצביעת משטח עבור באר אחת, הוסף 2.5 μL של mAb משטח ל- 20 μL של מאגר FACS.
    9. הוסף 200 μL של חיץ FACS לכל באר, וצנטריפוגה ב 1,400 × גרם למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, רוקנו את הבארות מנוזלים על ידי ניקוז, והקישו על הצלחת על נייר סופג כדי להסיר נוזלים עודפים.
    10. הוסף 100 μL של תמיסת צביעה L/D לכל באר. מערבבים היטב באמצעות פיפטה, ולאחר מכן דגירה ב 4 ° C במשך 15 דקות בחושך.
      הערה: עבור באר יחידה, יש להמיס 0.25 μL של צבע L/D ב-100 μL של חיץ FACS. צבע L/D מסייע להבחין בין תאים חיים ומתים.
    11. הוסף 100 μL של מאגר FACS. מכסים את הבארות במכסה, וצנטריפוגות את הצלחת למשך 1,400 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    12. חזור על שלב 5.1.11.
    13. מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר (מסופקת עם הערכה), ומערבבים עם פיפטה לפני הדגירה על הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 10 דקות.
    14. הוסף 150 μL של 1x permebilization-wash buffer (PW) שסופק עם הערכה, ולכסות את הבארות עם המכסה.
      הערה: כדי להכין 10 מ"ל של 1x PW buffer, לדלל 1 מ"ל של 10x perm buffer ב 10 מ"ל של dH2O.
    15. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    16. הוסף 200 μL של 1x PW, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    17. עבור צביעה תוך תאית, להוסיף 25 μL של צביעה תאית תערובת אב צביעה (Ki-67 mAb אנטי אנושי) לכל באר. מערבבים היטב, ודגרים על הצלחת במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח בחושך.
      הערה: כדי להכין תערובת אב צביעה תוך תאית לבאר אחת, הוסף 1 μL של Ki-67 mAb ל- 24 μL של 1x PW. סמן הצביעה התוך-תאי משמש רק בעת עיבוד תאים מהיום ה-16 לתרבית משותפת. צביעה תוך תאית אינה נעשית בעת עיבוד PBMCs, לימפוציטים נאיביים, מונוציטים ו- MoDCs נאיביים.
    18. לאחר הדגירה, יש להוסיף 200 μL של 1x PW לכל באר. מערבבים עם פיפטה וצנטריפוגה 1,400 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    19. הוסף 200 μL של חיץ FACS, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 1,400 × גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והקישו על הצלחת על נייר סופג.
    20. השהה מחדש את גלולת התא ב -200 מיקרוליטר של מאגר FACS, והעבר את התוכן של כל באר לצינורות ציטומטר זרימה סטריליים נפרדים. השתמש 300 μL של חיץ FACS לכל באר כדי לאסוף את התאים שיורית. התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה.
  2. הפעלת הדגימה על ציטומטר זרימה
    הערה: הדגימות הופעלו על ציטומטר זרימה (באמצעות לייזרים של 488 ננומטר, 638 ננומטר ו- 405 ננומטר) על פי מדריך היצרן35. עיין במדריך לקבלת פרטים, פתרון בעיות והתאמה אישית של הפרוטוקול.
    1. בצע הליכי ניקוי שגרתיים לפני ואחרי קריאת הדגימות.
      הערה: אין לדלג על מיקום בעת טעינת הצינורות במכשיר.
      1. עבור מחזור הניקוי, השתמש בסך הכל בארבעה צינורות, כאשר הצינור הראשון מכיל מגיב ניקוי זרימה ושלושת הצינורות הנותרים מכילים dH2O; כל צינור יהיה 3 מ"ל. במהלך ריצת הניקוי, קבל נתונים עם קצב זרימה בינוני למשך כדקה אחת על ידי לכידת 100,000 אירועים לכל צינור מתחת ל- 330 V עבור פיזור קדימה (FSC) לעומת 265 V עבור פיזור צדדי (SSC).
        הערה: אין לדווח על לכלוך או אירועים סלולריים במהלך הניקוי; במקרה כזה, בצעו שוב את שלב הניקוי. להפעלת הדגימות, ודא שכל הדגימות נמצאות בהשעיה הומוגנית לפני קבלת הנתונים מכיוון שהדבר מבטיח קריאה מדויקת.
    2. כדי לחבר ולהפעיל את הציטומטר, לחץ על כפתור היישום הממוקם בפינה השמאלית של פס הכותרת. מהתפריט הנפתח של היישום , בחר באפשרות Cytometry ולחץ על האפשרות Power On.
      הערה: מהתפריט הנפתח של היישום , האפשרות פתח מאפשרת למשתמשים לעיין בבדיקות שתוכנתו מראש, בעוד שהאפשרות פרוטוקול חדש מאפשרת למשתמשים ליצור פרוטוקולים חדשים.
    3. בתחילה לטעון את דגימת הבקרה השלילית במחזיק multi-tube. בחר פרוטוקול חדש והתבונן ברשימת העבודה בצד שמאל של סביבת העבודה /המסך.
    4. ברשימת העבודה, הגדר את מיקום הדגימה במחזיק הרב-צינורות, ותן שם לדגימה ולפרוטוקול לזיהוי.
    5. מלוח החומרה הממוקם בצד שמאל של סביבת העבודה, התאם ובחר פרמטרים מרובים כגון הגלאים (FSC, SSC ו- 10 טווחי פלואורסצנציה), המתחים (V ) והרווחים של מכפילי האור, והשטח-גובה-רוחב (AHW) של האות.
      הערה: ההגדרות הבאות עבור הגלאים נבחרו בהתבסס על הניסוי והמכשיר בו נעשה שימוש: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. מלוח הבקרה של רכישת המכשירים הממוקם מתחת לפס הכותרת, התאם את האפשרויות עבור קצב זרימה (בינוני), זמן (5 דקות) ואירועים (ראה שלב 5.2.8) הרצויים לזיהוי. לחץ על האפשרות רכוש יחיד כדי לאפשר למכשיר לצייר / להפעיל את הדגימה ולהציג את התצוגה המקדימה בזמן אמת של האירועים שזוהו.
    7. מהתצוגה המקדימה בזמן אמת, התאם את סף הפלואורסצנטיות (מתח ורווח) ואת גודל התא כדי לצייר בסופו של דבר שערים סביב אוכלוסיית התאים הרצויה תוך אי הכללת פסולת תאית.
      הערה: FSC מסייע להבחין בין תאים על בסיס גודל, ובכך מאפשר למשתמשים להבדיל בין תאים של המערכת החיסונית, כגון מונוציטים ולימפוציטים; מונוציטים גדולים יותר ומראים עוצמת FSC גבוהה יותר בהשוואה ללימפוציטים.
    8. לרכוש סך של כ-5,000 MoDC חיים, 50,000 לימפוציטים חיים ו-50,000 אירועי מונוציטים חיים.
    9. לאחר שכל הפרמטרים מותאמים בהתייחסות למדגם הבקרה השלילית, לחץ על עצור ושמור את הפרוטוקול.
    10. כעת טען את כל הדגימות על המעמיס מרובה הצינורות. הגדר כל דגימה ברשימת העבודה, והחל את הפרמטרים המותאמים ביחס לבקרה השלילית על כל הדגימות בניסוי. לחץ על האפשרות רכוש כדי לאפשר את כל הדגימות בניסוי לרוץ ברציפות.
    11. לאחר רכישת הנתונים מכל הדגימות, שמור והפוך לנתונים קריאים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה המאפשרת יצירת היסטוגרמות דו-פרמטריות ומונו-פרמטריות רציפות.

6. ניתוח ביטוי רנ"א שליח (mRNA)

  1. מיצוי RNA
    הערה: חלץ את סך כל הרנ"א מהתרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC-פועמים באנטיגן (ספציפי), מהתרבות המשותפת של לימפוציטים MoDC ללא פעימות אנטיגן (לא ספציפי), מתרבית הלימפוציטים ללא MoDCs (בקרה), ומלימפוציטים נאיביים (CD14-תאים שבודדו לפני תרבית משותפת). עבור מיצוי RNA, להכין אתנול באמצעות מים ללא RNase. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על ערכת המיצוי והריאגנטים.
    1. העבר 1 מ"ל של תרחיף תאים מצלחת התרבית המשותפת של לימפוציטים MoDC (~ 1 × 106 תאים / מ"ל) לצינור סטרילי 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
    2. שמור את supernatant עבור ELISA. להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של PBS, ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל. אסוף תאים שיוריים באמצעות 1 מ"ל של PBS.
    3. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 500 × גרם.
      הערה: יש לטפל בכל הדגימות בעדינות כתאים חיים עד לביצוע ליזה התאית באמצעות חיץ הליזיס המסופק בערכה. מוות תאי משחרר RNases שמבצע הידרוליזה מהירה של תבניות הרנ"א הדרושות לכימות במורד הזרם. חיץ RLT ממקם תאים בתמיסה המעכבת RNases.
    4. מוסיפים 350 μL של חיץ ליזה לכל באר ריקה, ודגרים במשך 2-3 דקות כדי ליזה את התאים הדבקים שלא נקטפו בשלבים הקודמים.
    5. לאחר השלמת הצנטריפוגה בשלב 6.1.3, השליכו את הסופרנטנט ושלבו את גלולת התא עם 350 מיקרוליטר של חיץ ליזיס שנוסף בשלב 6.1.4.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הצינורות ב -80 ° C או להמשיך עם מיצוי RNA (השלבים הבאים).
    6. פיפטה 350 μL של 70% אתנול לליזט בשלב 6.1.5. הנפח הסופי לדגימה הוא 700 μL.
    7. הכנס את עמוד החילוץ בתוך צינור איסוף של 2 מ"ל (מצורף לערכה).
    8. מעבירים את 700 מיקרוליטר הדגימה לכל עמודת חילוץ, וצנטריפוגה ב-10,000 × גרם למשך 15 שניות. השליכו את הזרימה בצינור האיסוף, והחזירו אותה לעמוד הסיבוב.
    9. בעמודת החילוץ, הוסף 350 μL של חיץ כביסה מחמיר (מסופק בערכה), וצנטריפוגה ביותר מ -10,000 × גרם למשך 15 שניות. מחק את הזרימה.
    10. הוסף 80 μL של תערובת דגירה DNase I לכל דגימה על הממברנה של עמודת החילוץ, ולאפשר לו להגדיר במשך 15 דקות ב 20-30 ° C.
      הערה: כדי להכין תערובת דגירה של DNase I לדגימה, הוסף 10 μL של תמיסת מלאי DNase I ל- 70 μL של מאגר DNase לקבלת נפח סופי של 80 μL. ערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, ולאחר מכן סיבוב קצר בצנטריפוגה.
    11. שטפו את עמוד השאיבה עם 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה מחמיר, ולאחר מכן צנטריפוגה בעוצמה של 10,000 × גרם למשך 15 דקות. יש להשליך את הזרימה בצינור האיסוף לאחר הצנטריפוגה.
    12. יש לשטוף את עמוד החילוץ 2x עם 500 μL של חיץ שטיפה עדין בכל פעם ועם צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 15 שניות ופעם שנייה במשך 2 דקות. השליכו את הזרימה לאחר כל צנטריפוגה.
    13. צנטריפוגו את העמוד במהירות מרבית למשך דקה אחת כדי לייבש את הממברנה, והשליכו את צינור האיסוף.
    14. מניחים את עמוד החילוץ בצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל.
    15. פיפטה 50 μL של מים נטולי RNase על קרום העמוד, ולדגור במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: עבור ריכוזי RNA מתחת ל-100 ננוגרם, יש להפחית את נפח ה-elution ל-30 μL, ולשלול מחדש את קרום עמוד החילוץ באמצעות המוצר מהאלוציה הראשונה כדי לרכז את המוצר הסופי.
    16. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם למשך דקה אחת כדי להוציא את הרנ"א.
    17. למדוד את ריכוז RNA על ידי זיהוי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות 0.5-2 μL של דגימה. התאם את ריכוז הרנ"א הסופי ל-0.1-1 מיקרוגרם/μL באמצעות מים נטולי RNase.
    18. אחסן את aliquots RNA ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. סינתזה של DNA משלים
    1. סנתז DNA משלים (cDNA) מ-RNA תבנית מופק בהתאם לפרוטוקול היצרן שסופק עם הערכה (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים).
      הערה: סיכום של הריאגנטים ואמצעי האחסון שבהם נעשה שימוש מוצג בטבלה 1 ובטבלה 2. פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.
  3. תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז
    1. עבור qPCR, הפעל את דגימות cDNA בטריפליקטים. כמת את רמות התמליל של mRNA בקר עבור Ki-67 ו- IFN-γ באמצעות ערכות פריימר ספציפיות בהתייחסות לגן GAPDH , כפי שמוצג בטבלה 3.
      הערה: פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.

7. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

  1. עבד את תרביות העל שנאספו עשירות בחלבוני הפרשה לכימות IFN-γ באמצעות ELISA.
    הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על השימוש בערכה. פרוטוקול מלא מפורט בקובץ משלים 1.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. לנתח את הנתונים, ולעשות איורים גרפיים של עיצוב ניסיוני באמצעות תוכנה מסחרית. השתמש במבחן לא פרמטרי לא מזווג לניתוח השוואתי. שקול ערכי P < 0.05 כמובהקים סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתודולוגיה זו מתארת את הדור במבחנה של MoDCs בקר להערכת אנטיגנים מועמדים לחיסון לפני ביצוע מחקרי in vivo. איור 1 מדגים את התוכנית הניסיונית של יצירת MoDC בקר ואת היישום של MoDCs עבור בדיקות במבחנה. באמצעות טכניקת מיון תאים מבוססת מגנטיות, ניתן היה לאסוף כ -26 מיליון מיוציטים CD14+ מה- PBMCs שנקטפו, אשר בודדו בעבר מ -50 מ"ל של דם בקר. מקטע התא המדולל ללא מונוציטים CD14+ היה עשיר בלימפוציטים ושימש כמקור לתאי T נאיביים CD4+ ו- CD8+ (מקט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מדגים שיטה מתוקננת במבחנה לייצור ופנוטיפ של MoDC בקר והשימוש בהם לאחר מכן במדידת האימונוגניות של החיסון של חיסון מסחרי (למשל, RV). MoDCs של בקר יכולים לשמש ככלי לסינון אנטיגנים פוטנציאליים של חיסונים נגד מחלות בקר וחיזוי ההשפעה הקלינית הפוטנציאלית שלהם בהתבסס על תגובות חיסוניות לפני שמתקדמים לקראת ניסויים בבעלי חיים in vivo . ה-MoDCs שנוצרו זוהו על סמך המאפיינים המורפולוגיים, הפנוטיפיים והתפקודיים שלהם. הראינו כי מונוציטים של MoDCs שמקורם בבקר CD14+ הציגו תכונות שנצפו ב-DCs, כגון דנדר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר אוולין וודאק וד"ר אנג'ליקה לויסטש (AGES) על תמיכתם בקביעת מצבם הבריאותי של בעלי החיים ועל אספקת BTV, ד"ר ברנהרד ריינלט על אספקת דם בקר, וד"ר בהראני סטיפלי וד"ר ויליאם דנדון מהסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית על עצות מועילות לגבי ניסויי PCR בזמן אמת ועריכת שפה, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מאגר ACK LysingGibco, Thermo FisherA1049201מאגר אמוניום-כלוריד-אשלגן לליזה של שאריות RBCs ב-PBMC Fraction
BD Vacutainer Heparin TubesBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 מ"ל, תוסף נתרן הפרין 158 יחידות USP, צינור זכוכית,
ערכת גידול תאים דנדריטיים בקרBio-Rad, בריטניהPBP015KZZקוקטייל ציטוקינים המורכב מבקר רקומביננטי IL-4 ו-GM-CSF
בקר IFN-γ ערכת ELISABio-RadMCA5638KZZשימוש בערכת למדידת IFN-γ ביטוי בתרבית סופרנטנט
CD14 נוגדןBio-RadMCA2678Fעכבר אנטי-בקר CD14 נוגדן חד שבטי, שיבוט CC-G33, איזוטיפ IgG1
CD25 נוגדןBio-RadMCA2430PEעכבר אנטי בקר CD25 נוגדן חד שבטי, שיבוט IL-A11, איזוטיפ IgG1
CD4 נוגדןBio-RadMCA1653A647נוגדן חד שבטי CD4 נגד בקר לעכבר, שיבוט CC8, איזוטיפ IgG2a
CD40 נוגדןBio-RadMCA2431Fעכבר נגד בקר CD40 נוגדן חד שבטי, שיבוט IL-A156, איזוטיפ IgG1
CD8 נוגדןBio-RadMCA837Fעכבר אנטי בקר CD8 נוגדן חד שבטי, שיבוט CC63, איזוטיפ IgG2a
CD86 נוגדןBio-RadMCA2437PEעכבר אנטי בקר CD86 נוגדן חד שבטי, שיבוט IL-A190, איזוטיפ IgG1
CFX96 מגע בזמן אמת PCR מערכת זיהויביו-רד-תרמימחזורי PCR מכונת
קורנינג צינור צנטריפוגהבז קורנינג 352096 & 35207015 מ"ל ו-50 מ"ל, תחתית חרוטית פויפרופילן בהירות גבוהה, בוגרת, סטריאלית, מכסה בורג איטום, צינור בז
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028ערכת קיבוע/חדירות עם BD golgiPlug, שימוש לצביעה של תא ציטומטר זרימה
אתנולסיגמא אולדריץ'1009832500Absolute לניתוח EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064מוסמך, מומת
בחום Ficoll Plaque PLUSGE Health Care Life Sciences, ארה"ב341691מדיום בידוד לימפוציטים
FlowClean חומר ניקויבקמן קולטר, מדעי החייםA64669500 מ"ל
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, ארה"ב-תוכנת היסטוגרמה ציטומטרית זרימה
FlowTubes/ FACS  (מיון תאים בודדים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) שפופרתפלקון קורנינג 3522355 מ"ל, מבחנה פוליסטירן סטרית, תחתונה עגולה עם מכסה הצמד מסננת תאים, שימוש בניתוח ציטומטריית זרימה
Fluoresceinisothiocynat-DextranSigma Aldrich, גרמניה60842-46-8FITC-dextran MW
Gallios Flow CytometerBeckman Coulter-FlowCytometer Machine
Shell 96-Well PCR PlatesBio-RadHSP960196 באר, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאיתלבן/שקוף
CD14 מיקרו-חרוזים אנושייםMiltenyi Bioteck, גרמניה130-050-201מיקרו-חרוזים 2 מ"ל מצומדים לאיזוטיפ נוגדן CD14 חד-שבטי אנטי-אנושי IgG2a, המשמש לבחירת מונוציטים בקר מ-PBMCs
KaluzaBeckman Coulter, גרמניה-זרימהציטומטר תוכנה לניתוח נתונים צבעוניים
MACS ColumnMiltenyi Bioteck, גרמניה130-042-401מיון תאים פעילים מגנטיים או קולום הפרדת תאים מג'נטים חיסונית להפרדה של אוכלוסיות תאי CD14 שונות על בסיס אנטיגנים על פני התא
MHC Class II DQ DR נוגדן פולימורפיBio-RadMCA2228Fעכבר נגד כבשים MHC Class II DQ DR פולימורפי: FITC, שיבוט 49.1, איזוטיפ IgG2a, תגובתי צולבת עם
צינור מיקרוצנטריפוגהSigma AldrichHS43251.5 מ"ל, תחתית חרוטית, בוגר, צינור סטריאלי
מיקרוסופט פאוור פוינטמיקרוסופט-האיוריםהגרפיים של עיצוב ניסיוני
עכבר IgG1 שלילי בקרה: FITC עבור CD14, CD40 נוגדןBio-RadMCA928Fבקרת איזוטיפ CD14 ו-CD40 נוגדן חד שבטי 
עכבר IgG1 שלילי בקרה: PE עבור נוגדן CD86Bio-RadMCA928PEבקרת איזוטיפ CD86 נוגדן חד שבטי CD86
עכבר IgG1 שליטה שלילית: RPE עבור נוגדן CD25Bio-RadMCA928PEבקרת איזוטיפ CD25 נוגדן חד שבטי CD25 
עכבר IgG2a שליטה שלילית: FITC עבור נוגדן MHC Class IIBio-RadMCA929Fבקרת איזוטיפ עבור נוגדן חד שבטי MHC Class II 
Nobivac כלבתMSD בריאות בעלי חיים, UK-1ומיקרו; L/mL של חיסון מומת בתרבית תאים המכיל > 2 I.U./mL זן נגיף כלבת
אטמים אופטייםBi0-RadTCS08030.2 מ"ל צינור PCR שטוח רצועות 8 כובעים, אופטי, אולטרה-ברור, תואם למכונת qPCR
פניצילין-סטרפטומיציןGibco, תרמו פישר15140122100 מ"ל
מאגר פוספט מלח (PBS)Gibco, תרמו פישר10010023pH 7.4, ריכוז
פי 1פריזמה - תוכנת GraphPad 5 דוטמטיקה-סטטיסטיקה
תוכנה מטוהר אנטי אנושי Ki-67 נוגדןBiolegend, ארה"ב350501נוגדן חד שבטי, צולב תגובתי עם פרה, שיבוט ki-67
עכבר מטוהר IgG1 k איזוטיפ Ctrl נוגדןBiolegend400101בקרת איזוטיפ לנוגדנים חד שבטיים Ki-67
READIDROP Propidium IodideBD Bio Sciences1351101סמן תאים חיים/מתים המשמש לזרימה ציטומטרית, צבע מגיב אמין
רקומביננטי Human IL-2 חלבוןR& D System, ארה"ב202-IL-010/CFInterleukin-2, 20 ננוגרם/מ"ל
RNeasy Mini KitQiagen74106שימוש בערכה למיצוי סך ה-RNA; מאגר RLT = מאגר ליזה; מאגר RW1 = מאגר כביסה מחמיר המכיל גואנידין; מאגר RDD = מאגר DNase; מאגר RPE = מאגר כביסה עדין; RNaseOUT = מעכב RNase.
RPMI 1640 בינוניSigma AldrichR8758מדיה לתרבית תאים עם L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט
SMART-servier אמנות רפואית Les Laboratories Servier-Licensedתחת ייחוס Creative Commons 3.0 רישיון לא מועבר
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, Ss07d fusion polymerase, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, צבעי נורמליזציה של ROX.
SuperScript III מערכת סינתזה של גדיל ראשוןInvitrogen, ערכת 18080051 Thermo Fisherלסינתזה cDNA
צלחת בדיקת תרבית רקמות 24TPP, שוויץ92024צלחת 24 בארות, מעוקרת על ידי קרינה, טיפול משופר בצמיחה, נפח 3.18 מ"ל
תמיסה כחולה טריפןGibco, תרמו פישר152500610.4%, 100 מ"ל, צבע להערכת כדאיות התא
UltraPure DNase/RNase מים מזוקקיםInvitrogen, תרמו פישר109770230.1 ומיקרו; m ממברנה מים מזוקקים מסוננים
VACUETTE Heparin צינורות איסוף דםThermo Fisher Scientific15206067VACUETTE צינורות איסוף הדם של הפרין הם בעלי חלק עליון ירוק ומכילים ליתיום, נתרן או אמוניום הפרין מיובשים בריסוס על הקירות הפנימיים ומשמשים בכימיה קלינית, אימונולוגיה וסרולוגיה. נוגד הקרישה הפרין מפעיל אנטיתרומבין, החוסם את מפל הקרישה ובכך מייצר דגימת דם/פלזמה מלאה.
WaterSigma AldrichW3500-1Lמסונן-סטרילי, bioReagent מתאים לתרבית תאים
בגודל 16 x 100 מ"מ Machine Hard בקר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCR

מאמרים קשורים