$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
במהלך העשור האחרון, יש גל של עניין ביישום מיקרוסקופ ראמאן קוהרנטי (CRM) להדמיית תאים ורקמות 1,2. CRM היא טכניקת הדמיה כימית רבת עוצמה עם שתי גרסאות פופולריות: מיקרוסקופ קוהרנטי נגד פיזור רמאן סטוקס (CARS) ומיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה (SRS). SRS פופולרי יותר ויותר בהשוואה ל-CARS מכיוון שהוא פחות מושפע מהפרעות רקע שאינן ראמאן ויש לו תלות ליניארית בריכוז3. CRM רוכש מידע רטט מולקולרי בדומה לספקטרוסקופיה של ראמאן, אך מציע מהירות רכישה משופרת משמעותית4. זה מושג על ידי עירור רטט קוהרנטי באמצעות זוג לייזרים פועמים בעוצמת שיא גבוהה. מכיוון ש-CRM מספק מיפוי כימי ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, הוא מצא יישומים חשובים באבחון סרטן, מטבוליזם של שומנים, חילוף חומרים של תאים, הובלת תרופות ועודרבים אחרים 5,6,7,8. עם זאת, צוואר בקבוק מרכזי אחד המעכב אימוץ נרחב של הטכניקה הוא המורכבות הטכנית שלה והיעדר פרוטוקולים סטנדרטיים. למרות שכבר קיימים לייזרים ומיקרוסקופים מסחריים, כמעט כל המערכות המשמשות כיום בתחום כרוכות ברמות שונות של התאמה אישית של לייזרים, אופטיקה, מיקרוסקופים וגלאים, מה שיוצר חסם משמעותי לחוקרים המעוניינים להיכנס לתחום או לאמץ טכנולוגיה זו. חוסר הגישה מעכב עוד יותר יישומים ביולוגיים. מטרת אוסף שיטות זה היא לספק דוגמאות מפורטות והדרכה לגבי מכשור, גישות הדמיה חדשות ויישומי הדמיית תאים או רקמות במבחנה/in vivo. כללנו שבעה פרסומים של מומחים בתחום המסוכמים כאן.
קלארק ועמיתיו מציגים השוואה זו לצד זו של SRS היפרספקטרלי ו-CARS במונחים של רגישות, רזולוציה מרחבית ורזולוציה ספקטרלית9. שתי הטכניקות מיושמות עם מיקוד ספקטרלי של לייזרי פמטו-שניות, גישה נפוצה המשתמשת בלייזרי פמטו-שניות בפס רחב ציוץ ספקטרלי כדי להשיג רזולוציית רמאן צרת פס. השוואה ישירה מאפשרת הערכה של הבדלי זיהוי ובחירה אופטימלית של השיטה ליישומי הדמיה כימית שונים.
De la Cadena et al. מפרסמים שיטת SRS מולטיפלקס חדשה שיכולה לרכוש תמונות SRS בפס רחב במהירות10. הטכניקה מבוססת על זיהוי מגבר נעילה רב-ערוצי דיפרנציאלי מותאם אישית, המאפשר זיהוי של עד 32 ערוצים בו זמנית. בנוסף, מוצג אפיון רעש מפורט, ומודגמת שיטת זיהוי מאוזנת לביטול רעשי לייזר. פרוטוקול זה מספק הדרכה מעשית למשתמשים המעוניינים לבנות מערכות SRS מרובות.
שי ועמיתיו מדגימים את השימוש בצבעי ראמאן מרובים מאוד בהדמיית SRS11. עם שיפור קדם-תהודה, הם מדגימים ש-SRS יכול לספק רגישות הניתנת להשוואה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית. שיטה זו עוקפת את גבול הערוצים הניתנים לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומאפשרת ניטור של חלבונים רבים בו זמנית ולימוד האינטראקציות ביניהם. הדרכה מפורטת על עיבוד הדגימה וצביעה בצבע רמאן ניתנת כדי להקל על אימוץ שיטה עוצמתית זו.
מיאו ועמיתיו מציגים הדמיית רטט של רקמה נפוחה וניתוח (VISTA), טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה המשלבת SRS עם מיקרוסקופ הרחבה12. VISTA עוקף מכשולים הקשורים להדמיה פלואורסצנטית ומשיג הדמיה נפחית ברזולוציה גבוהה ללא תוויות בדגימות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית של עד 78 ננומטר. הם מנצלים עוד אלגוריתם למידה עמוקה כדי להשיג פילוח רב-רכיבי, כולל אגרגטים של חלבונים בתאים וברקמות המוח.
אספינוזה ואחרים מציגים את השימוש בהדמיית SRS דו-צבעונית בזמן אמת של חלבונים ושומנים ליישומי אבחון רקמות13. הדמיית SRS בשני צבעים יכולה ליצור תמונות שוות ערך ל-H&E עבור יישומי פתולוגיה. פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של יישום טכניקת אפנון אורתוגונלית ומיקוד ספקטרלי להדמיית SRS דו-צבעונית בו זמנית. המרה של תמונות SRS דו-צבעוניות לתמונות פסאודו-H&E מודגמת גם עם רקמת מוח של עכבר כדי להמחיש יישומי אבחון רקמות.
יואן ועמיתיו מפרסמים מערכת תא גמישה להדמיית SRS ארוכת טווח של תאים חיים14. רוב תאי התצפית הקיימים של תאים חיים מיועדים להדמיית שדה בהיר ופלואורסצנטי. הם אינם תואמים לזיהוי SRS בגלל הדרישה למטרה ומעבה NA גבוהים. המחברים מדגימים הדמיית SRS של 24 שעות עם התא הגמיש, ששמר על טמפרטורה קבועה, CO2 ולחות.
לבסוף, וו ואחרים מדגימים בו זמנית פלואורסצנציה דו-פוטונית in vivo (TPEF) והדמיית SRS15. שתי מערכות לייזר נפרדות משולבות כדי להשיג רגישות אופטימלית לשתי שיטות ההדמיה כדי לספק מידע משלים. in vivo להדמיית SRS של רקמות יש אתגרים ייחודיים בגלל הצורך בזיהוי אפי של אור מפוזר לאחור. פרוטוקול זה דן בפרטים של ההגדרה האופטימלית של מיקרוסקופ TPEF-SRS וכיצד ניתן להשתמש בו להדמיה in vivo של חוט השדרה של העכבר.
אוסף פרסומים זה מייצג את המצב המתקדם ביותר במכשור CRM והתקדמות טכנית. חוקרים המתעניינים הן בפיתוח שיטות והן ביישומים ימצאו אוסף זה שימושי להשוואת הגדרות ולקביעת אמות מידה (רגישות, רזולוציה וכו') לבנייה או אופטימיזציה של מערכות משלהם. ההנחיות ושיטות העבודה המומלצות הניתנות בפרוטוקולים אלה יודיעו על יישומי המבחנה והיישומים הקיימים והעתידיים. האימוץ בקנה מידה גדול של טכנולוגיית ה-CRM עדיין ממתין ליישומים מרכזיים וחדשניים ולמסחור של פתרונות CRM מלאים. עם זאת, סטנדרטיזציה של גישות הדמיה ומדדים חיונית כדי להבטיח שחזור ואמינות ולהקל על יישום רחב יותר של CRM16.
תחום ה- CRM צומח במהירות מהירה. ההתפתחויות הטכניות הדוחפות את מגבלת הרגישות, הספציפיות והרזולוציה ממשיכות להניע את הטכנולוגיה לטריטוריות חדשות. לדוגמה, הרזולוציה המרחבית של SRS מתחילה לעלות על גבול העקיפה17,18. הרגישות של SRS קדם-תהודה אלקטרונית מתקרבת כעת לזו של פלואורסצנטיות19. בהשוואה לפלואורסצנטיות, ל-CRM יתרונות ברורים. לדוגמה, השימוש במעקב אחר דאוטריום איפשר לראשונה מחקר in vivo של דינמיקה מטבולית של מולקולות קטנות ברזולוציה תת-תאית20. עם תגים קטנים, ניתן לבצע זיהוי Raman מרובה מאוד של 24 או יותר מטרות מסומנות21. ההתקדמות בבינה מלאכותית מאפשרת יכולות חדשות ל-CRM על ידי מינוף תוכן המידע הגבוה והתכונות הספציפיות למולקולריות כדי לפלח ולסווג אובייקטים עם הבדלי תכונות מרחביים וספקטרליים עדינים22. יחד, ההתקדמות הטכנית הללו ב-CRM עומדת להאיץ ולהרחיב יישומים בהדמיה ביולוגית וביו-רפואית כאחד.