מאז הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים ושיפור התוכנה והחומרה, מיקרוסקופ אלקטרונים קריו (cryo-EM) הפך לטכניקה המאפשרת באופן שגרתי לחוקרים לקבוע את המבנה של מקרומולקולות לפרטים כמעט אטומיים 1,2. האצה זו הואצה על ידי סדרה מהירה במיוחד של פיתוחים חדשים, מהכנת דגימות ועד איסוף ועיבוד נתונים. כדי לאפשר דמוקרטיזציה רחבה של טכניקה זו למי שאינם מומחים, נוצרו צינורות יעילים ונגישים יותר. באופן מדהים, פחות מ-10 שנים לאחר "מהפכת הרזולוציה", cryo-EM הפכה לטכניקה חיונית לאפיון חלבונים, הן באקדמיה והן בתעשייה 3,4.
אחד ההיבטים המדהימים ביותר של קהילת המחקר של cryo-EM, היה הנכונות לשתף בגלוי פרוטוקולים, אסטרטגיות ותוכנה5. הפתיחות הזו של הטכנולוגיה והמומחיות תרמה משמעותית לקצב הפיתוח המהיר מאוד, אך כמה צווארי בקבוק ממשיכים למנוע ממנו להיות נגיש במלואו. באוסף שיטות זה, אנו שואפים לתאר כמה מההתפתחויות האחרונות בהכנת רשתות המתאימות לניתוח מבני על ידי cryo-EM, שהוא, יחד עם גישה לחומרת ניתוח הנתונים, צוואר הבקבוק העיקרי לפרויקטים רבים. אנו דנים גם בפרוטוקולים חדשים הנמצאים כעת בפיתוח בתחום זה, לגישות חדשות בניתוחי cryo-EM.
כאמור לעיל, אחד מצווארי הבקבוק הנוכחיים ליישום שגרתי של cryo-EM במעבדה הוא הכנת דגימות. ניתן להיתקל במספר בעיות ברמת יישום הדגימה לרשתות: לרוב, הכיוון המועדף של הדגימה בקרח, והדנטורציה שלה בממשק אוויר-מים. מיגון הדגימה מממשק אוויר-מים הוא פתרון אחד לבעיה זו, על ידי שימוש בסרטי תמיכה של פחמן או גרפן המונעים פיזית מהדגימה להיות במגע עם האוויר. כדי להקל על היישום של סרטים דקים על רשתות, דה מרטין גארידו ואחרים פיתחו בלוק ציפה תומך המיוצר על ידי מדפסת תלת מימד המאפשר ליישם טיפות קטנות של מים ודגימה בצורה מבוקרת. באמצעות בלוק זה, שכבות הגרפן והפחמן מופקדות בצורה זולה וידידותית למשתמש.
דרך נוספת למנוע את הנזק בממשק אוויר-מים היא להגביל את זמן החשיפה של החלבון לאטמוספירה. לשם כך, שני מכשירים שונים, שפותחו על ידי Klebs et al.7 ו-Budell et al.8, משתמשים בגישות חדשות להכנת רשת מהירה (עד 10 אלפיות השנייה), ומפחיתים את הסבירות לבעיות בכיוון החלקיקים. יתרון נוסף של מכשירים אלה הוא האפשרות לבצע ניסויים שנפתרו בזמן, חזית חדשה ומרגשת למחקרים מבניים.
בגישה מנוגדת, Nguyen et al.9 מדווחים על שיטה להקפאת רשתות לניתוח cryo-EM בהיעדר מכשירים מסחריים או מותאמים אישית, שהם יקרים מאוד או קשים לבנייה. הם מראים כיצד ניתן להשיג רשתות באיכות דומה באמצעות מכשיר זול תוצרת בית שאינו דורש מכשור יקר, התורם לדמוקרטיזציה של cryo-EM.
ב-cryo-EM, הדגימה המעניינת היא לא תמיד חלבון, אלא יכולה להיות מולקולה קטנה או מערכת ביולוגית גדולה כמו תא שלם. הכנת דגימות כאלה היא ייחודית, והיא דורשת שלבים ספציפיים, כמו גם אסטרטגיות שונות באיסוף נתונים.
עבור עקיפה אלקטרונית של מיקרו-קריסטל (MicroED), הדגימה הנחקרת היא כימיקל קטן שנמצא בדרך כלל בצורה של אבקה. האבקה מוחלת ישירות על רשת EM כדי לשמור על צורה גבישית. לאחר מכן איסוף הנתונים מתבצע במצב עקיפה, כפי שמוצג על ידי מרטינוביץ' וגונן10. לעומת זאת, תאים שלמים עבים מדי לניתוח cryo-EM. כדי לטפל בכך, ביסון ועמיתיו מדווחים על שיטה לשימוש ב-SEM כדי לקדוח פיזית לתוך דגימה כזו, על מנת להשיג חתכים דקים המתאימים למחקרים מבניים11.
מהדגימה למבנה, חשוב לשמור תיעוד עבור כל שלב בתהליך שכן פרמטרים רבים משתנים עבור כל דגימת חלבון מריכוז החלבון ועד להגדרות המיקרוסקופ וניתוח הנתונים. לשם כך, Wypych et al.12 פיתחו כלי ניהול מידע מבוסס אינטרנט המאפשר למשתמשים לארגן את זרימת העבודה שלהם ולעקוב אחר כל הפרטים הדרושים לפרסומים עתידיים. זה קריטי במיוחד מכיוון שהאוטומציה הופכת נפוצה יותר ויותר ב-cryo-EM, במיוחד במסגרות התעשייה.
Cryo-EM התקדמה בקצב יוצא מן הכלל בעשור האחרון, הן בחזית החומרה והן בחזית התוכנה. כדי להבטיח הפצה נרחבת של שיטות עבודה מומלצות, ואימוץ נרחב של שיטות חדשות, יש צורך במערכת פרוטוקולים שקופה. גיליון מיוחד זה יתרום למאמץ זה.