במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי
במאמר זה
סיכום
תקציר
לחץ שכפול הוא סימן ההיכר של מספר סוגי סרטן השחלות. לחץ שכפול יכול לנבוע ממקורות מרובים, כולל הפסקות דו-גדיליות, התנגשויות שעתוק-שכפול או אונקוגנים מוגברים, וכתוצאה מכך באופן בלתי נמנע יצירת DNA חד-גדילי (ssDNA). כימות ssDNA, אם כן, מהווה הזדמנות להעריך את רמת לחץ השכפול בסוגי תאים שונים ובתנאים או טיפולים שונים הפוגעים בדנ"א. ראיות חדשות מצביעות גם על כך ש- ssDNA יכול להיות מנבא של תגובות לתרופות כימותרפיות המכוונות לתיקון DNA. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת המבוססת על אימונופלואורסנציה לכימות ssDNA. מתודולוגיה זו כוללת תיוג הגנום עם אנלוגי תימידין, ואחריו זיהוי מבוסס נוגדנים של האנלוגי בכרומטין בתנאים שאינם דנטורציה. ניתן לדמיין מתיחות של ssDNA כמוקדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מספר המוקדים ועוצמתם קשורים ישירות לרמת ssDNA הקיימת בגרעין. אנו גם מתארים צינור אוטומטי לכימות אות ssDNA. השיטה מהירה וניתנת לשחזור. יתר על כן, הפשטות של מתודולוגיה זו הופכת אותה למקובלת על יישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון תרופות ובדיקות גנטיות.
מבוא
דנ"א גנומי חשוף לעתים קרובות להתקפות מרובות ממקורות אנדוגניים ואקסוגניים שונים1. תדירות הנזק האנדוגני נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות תוצרי לוואי מטבוליים, כגון מיני חמצן תגובתי או אלדהידים, שהם גבוהים יותר באופן מהותי בסוגי סרטן מרובים, כולל סרטן השחלות 2,3. הכרחי שנזק לדנ"א ייפתר ביעילות; אחרת, זה יכול לטפח נגעים genotoxic, וכתוצאה מכך, מוטגנזה. יכולתם של תאים לתקן נגעים גנוטוקסיים תלויה בפונקציונליות של מסלולי תיקון דנ"א נטולי שגיאות ובוויסות יעיל של התקדמות מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א. יש לציין כי סרטני שחלות רבים נושאים מוטציות לא פעילות תפקודית ב-p53, ולכן יש להם מחסום G1/S פגום, מה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: קו תאי סרטן השחלות, OVCAR3, שימש בשלבים אלה, אך פרוטוקול זה חל באופן נרחב על קווי תאים רבים אחרים, כולל אלה שמקורם במקורות שאינם שחלתיים. סכמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 2.
1. ציפוי התאים
- הכינו כיסויים מצופים פולי-L-ליזין.
- הוסיפו כיסויים בקוטר 12 מ"מ לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל עם תמיסת פולי-L-ליזין, והניחו על נדנדה למשך 15 דקות.
- שאפו את הפתרון בתרבית רקמות. שטפו את הכיסויים על ידי הוספת מים סטריליים, והניחו את הצינור המכיל את הכיסויים בחזרה על הנדנדה למשך 5 דקות. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים.
- מורחים את הכיסויים המצופים על כלי סטרילי, ושואבים את שאריות ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תמונות מייצגות וכימות של מוקדי IdU מהגרעינים שמקורם בתאים לא מטופלים ובתאים שטופלו בהידרוקסיוראה של 0.5 מילימטר במשך 24 שעות מוצגים באיור 4. שני הגרעינים מוכתמים וניתנים לזיהוי בערוץ DAPI. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לחץ השכפול.
איור 1: מנגנוני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב לכלול כמה בקרות ניסיוניות כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. אלה כוללים דגימה ללא טיפול ב- IdU וכן דגימה ללא נוגדנים ראשוניים. שתי הבקרות השליליות אמורות להניב תאים המוכתמים על-ידי DAPI אך אינם מכילים אות IdU.
בהתבסס על תנאי הניסוי וקווי התאים שבהם נעשה שימוש, ייתכן שיהיה צורך בדילולי נוגדנים שונים כדי לקבל את האות הפלואורסצנטי הטוב ביותר. אות רב מדי עלול לגרום לחוסר יכולת לכמת מוקדים בודדים, בעוד שאות מועט מדי עשוי לגרום לכך שלא ניתן לזהות הבדלים ניסיוניים בין הדגימות. התאמת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
PV נתמכת על ידי מענק Pedal the Cause של מרכז הסרטן ע"ש אלווין ג'יי סייטמן באמצעות הקרן לבית החולים היהודי בארנס, מענק מחקר פיילוט ממרכז מרשה ריבקין לחקר סרטן השחלות, מענק לחקר הסרטן מקרן Mary Kay Ash וקרן V. NR נתמך על ידי מענק T32 להכשרת תאים וביולוגיה מולקולרית של NIH לאוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3% פרפורמלדהיד (PFA) | פישר סיינטיפיק | NC0179595 | 10 גרם סוכרוז + 100 מ"ל 10X PBS + מים ליצירת נפח ל-925 מ"ל. הוסף 75 מ"ל 40% PFA ללא מתנול, ערבב והכין מינון של 50 מ"ל לפני האחסון אחסון: אחסן ב-20 מעלות; C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 גרם/מול. עבור מלאי של 10 מ"מ: יש להמיס 3.541 מ"ג IdU ל-1 מ"ל 1 N אמוניה נוזלית אחסון: מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C |
| נוגדן נגד BrdU | BD Biosciences | 347580 | אחסון: יש לאחסן ב-4 מעלות; C |
| נוגדן משני נגד עכבר Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Scientific | A32766 | רגיש לאור - יש לשמור בחושך אחסון: יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | מיוצר על ידי הוספת מסה ספציפית לנפח PBS אחסון: אחסן ב-4 מעלות; C |
| כיסוי עגול זכוכית | מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית | 72230-01 | |
| ₪ GA3 תוכנה | ניקון | ||
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | אמצעי גדילה: RPMI בתוספת L-גלוטמין, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין בקר; סרום בקר עוברי לריכוז סופי של 20% ו-1X Pen Strep אחסון: אמצעי הקפאה: מצע גידול + 5% DMSO ומאוחסן ב-80 מעלות; C |
| תמיסת פולי-L-ליזין | Sigma Aldrich | P4832-50ML | אחסון: אחסן ב-4 מעלות; |
| C ProLong Diamond Antifade Mountant עם DAPI | Thermo Scientific | P36962 | אחסון: אחסן ב-4 מעלות; C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | אחסון: אחסן ב-4 מעלות; C |
| סיגמא אולדריץ | W3500-6X500ML | מסוננים סטריליים | אחסון: יש לאחסן ב-4 מעלות; ג |
מקורות
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamen....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
