הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64934

⸱

15 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

תקציר

הצומת הנוירומוסקולרית דרוזופילה (NMJ) התפתחה כמערכת מודל רבת ערך בתחום מדעי המוח. היישום של מיקרוסקופ קונפוקלי ב - Drosophila NMJ מאפשר לחוקרים להשיג מידע סינפטי, המקיף הן נתונים כמותיים על שפע סינפסות והן תובנות מפורטות לגבי המורפולוגיה שלהם. עם זאת, ההתפלגות המפוזרת והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח האולטרה-סטרוקטורלי. מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. ההליך מתחיל בהנחת רשת מתכת בבסיס בקבוק או מבחנה בעלת תחתית שטוחה, ולאחר מכן מיקום דגימות זחלים קבועות על הרשת. רשת שינוי נוספת מונחת מעל הדגימות, כדי להבטיח שהן ממוקמות בין שתי רשתות השינוי. הדגימות הקבועות מיובשות היטב ומוחדרות לפני שממשיכים בהליך ההטבעה. לאחר מכן הטבעה של הדגימות בשרף אפוקסי מתבצעת באופן יריעה שטוחה, המאפשרת הכנת שרירים למיקום וחתך. כתוצאה מצעדים אלה, ניתן לדמיין את כל השרירים של זחלי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ אור, ובכך להקל על המיקום והחתך הבאים. עודף שרף מוסר לאחר איתור השרירים ה- 6 וה- 7 של חלקי הגוף A2 ו- A3. מבוצעת חתך טורי דק במיוחד של השריר ה- 6 או ה- 7.

מבוא

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחת השיטות האידיאליות ביותר לחקר מבנה העל של חומרים ביולוגיים שיכולים להדגים חזותית ומדויקת את המבנה הפנימי של תאים ברמה ננומטרית1. עם זאת, בשל מורכבות תהליך הכנת הדגימה והעלות הגבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים אינו פופולרי כמו מיקרוסקופ אור. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הובילה לשיפור משמעותי באיכות התמונה, במקביל להפחתה יוצאת דופן בעומס העבודה הנלווה. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ אלקטרונים תפס תפקיד חשוב בקידום הידע המדעי בתחומים מגוונים2.

דרוזופילה הוא מודל חייתי מצוין לביצוע מניפולציות גנטיות כדי לשלוט במדויק בביטוי המרחבי והזמני של גני מטרה3. חוץ מזה, לדרוזופילה יש את היתרונות של תקופת גדילה קצרה וגידול קל בהשוואה למודלים של יונקים; לכן, דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב במחקר מורפולוגיה 4,5.

בזחלי דרוזופילה, בוטוני צומת נוירומוסקולרי (NMJ) מופצים באופן נרחב בשרירים 6,7, ו immunostaining של NMJ יכול בקלות לספק מידע על כמות סינפסה ומורפולוגיה 8,9 . בוטי NMJ הממוקמיםבשרירים 6/7 של מקטעי A2 ו- A3 מתאימים היטב למחקר כמותי ומורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אור. הסיבה לכך היא גודלם ושפע10,11. לכן, זחלי דרוזופילה NMJ נחשבים מודל שימושי למחקר מדעי המוח12.

עם זאת, זה מאתגר לצפות NMJ bouton ultrastructure על ידי TEM. מכיוון שחלון הסריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת צר, קשה למקם את הבוטונים NMJ המפוזרים באופן נרחב13. הסיבה השנייה היא שדופן הגוף של דרוזופילה רגישה לסלסול במהלך שלב התייבשות האלכוהול של פרוטוקול הכנת הדגימה7.

מחקרים מסורתיים בדרך כלל בחרו בשרירים בין השרירים ה-6 וה-7 של קטעי A2 ו- A3 כחומרים לדוגמה בגלל השפע והגודל שלהם14,15. השריריםה-6 וה-7 במקטעי A2 ו-A 3 גדולים יותר מהשרירים האחרים ומכילים יותר בוטונים. עם זאת, כאשר הדגימות הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים, דגימות קבועות נטו להיות דקות ונוטות לסלסל, מה שהוביל למיקום לא נכון של השריריםה -6 וה-7 של קטעי A2 ו- A3.

אנו מדווחים בזאת על הליך עיבוד חדש היעיל יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית של הכנת הדגימות 7,16, בכך שהוא מאפשר לדגימות להישאר שטוחות במהלך ההתייבשות שלאחר מכן, ובכך להקל על מיקום טוב יותר של הצמתים העצביים-שריריים של זחל דרוזופילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: שיטת הכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת המשמשת במאמר זה דווחה בעבר16. חשוב לציין כי הבחירה של ריאגנטים ואת התאמת המינון נחוצים בהתאם המדגם. ישנם ריאגנטים כימיים רעילים רבים המשמשים בתהליך הכנת הדגימה, ולכן, המפעיל צריך לנקוט באמצעי הגנה מסוימים, כגון לבישת ביגוד מגן וכפפות ופעולה במכסה מנוע.

1. הליך נתיחה, קיבוע והשמה

  1. דיסקציה
    1. נתחו את הזחלים הנודדים בסוף ה-3 בתמיסת ינואר וקבלו את כל דופן הגוף על פי הנהלים הסטנדרטיים17. הכן את הפתרון של יאן באופן הבא: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM סוכרוז, 5mM HEPES, pH 7.4
      הערה: דופן הגוף של זחלי דרוזופילה מתייחסת לכיסוי החיצוני או הכסות של שלב הזחל של זבוב הפירות דרוזופילה. זה כולל את הקוטיקולה, תאי האפידרמיס והרקמות הבסיסיות היוצרות את השלד החיצוני של הזחל. דופן הגוף מספקת תמיכה והגנה מבנית ומשמשת חיץ בין גוף הזחל לסביבה החיצונית17.
  2. קיבוע
    1. תקן את דופן גוף הזחל בתא הדיסקציה ב 4 מעלות צלזיוס לילה עם הקיבוע. להכנת הקיבוע, ערבבו 2% גלוטראלדהיד ו-2% פורמלדהיד במאגר נתרן קקודילט 0.1M (pH 7.4)
    2. שטפו את הדגימות מספר פעמים עם מאגר נתרן קקודילט.
    3. מכינים 1% OsO4 במאגר קקודילט. תקן את הדגימות ב 1% OsO4 במשך 2 שעות, ולאחר מכן מספר שטיפות במים מזוקקים.
      הערה: קיבוע כפול עם אלדהידים ו-OsO4 מספק הגנה טובה יותר לאולטרה-מבנה תאי. חוץ מזה, OsO4 יכול להכתים את רקמת הדגימה, מה שמאפשר לניגודיות בין האור לדגימה להיות ברורה יותר18.
    4. הכתימו את דגימות הצומת העצבית-שרירית של דרוזופילה באורניל אצטט רווי של 2% במשך שעתיים, ולאחר מכן בצעו מספר שטיפות עם מים שעברו דה-יוניזציה (איור 1A).
  3. מיקום לדוגמה
    1. חותכים שתי חתיכות עגולות של רשת מתכת בגודל דומה (גודל נקבוביות 270 מיקרומטר) עם מספריים.
    2. הניחו מראש רשת מתכת (270 מיקרומטר) בבסיס בקבוק בעל תחתית שטוחה.
    3. הניחו את דגימות הזחלים הקבועות על הרשת ולאחר מכן הניחו עליהן רשת נוספת כך שהדגימות יונחו בין שתי הרשתות.

2. התייבשות

הערה במאמר זה נעשה שימוש בשיטת התייבשות שיפוע אתנול.

  1. יש לייבש את הדגימות בשיפוע ריכוז הולך וגדל של אתנול ברצף (50%, 70%, 85%, 95% פעם אחת, 100% פעמיים), כל אחת למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  2. שטפו את הדגימות פעמיים עם פרופילן אוקסיד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בכל פעם (איור 1C).

3. הסתננות

הערה: חדירה היא אחד השלבים הדרושים להכנת דגימת TEM. ההסננה מאפשרת החלפה הדרגתית של התווך המייבש בתווך ההטבעה בדגימה כדי לאפשר מילוי של הצטלבות התא עם מדיום ההטבעה19.

  1. הניחו את הדגימות בתמיסה מעורבת של פרופילן אוקסיד ושרף אפוקסי ביחס של 1:1 ו-1:2 למשך שעה כל אחת, ולאחר מכן שרף אפוקסי טהור למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

4. הטבעה

  1. הכינו סרט פוליאתילן וחתכו אותו לריבוע גדול (כ -5 × 5 ס"מ) ותמיכה מלבנית חלולה קטנה (כ -2 × 2 ס"מ). הדביקו את הריבוע הקטן עם הריבוע הגדול.
  2. מקמו מראש מספיק שרף אפוקסי במרכז הריבוע הגדול.
  3. הניחו את הדגימות בשרף אפוקסי שהוצב מראש כשצד השריר פונה כלפי מעלה. השתמש בסטריאוסקופ.
  4. הוסיפו כמה טיפות של שרף לדגימות ואז כסו אותן בסרט PE (קצת יותר גדול מהספייסר) (איור 1D-E).
  5. פילמרי הדגימות ב-37°C, 42°C ו-60°C במשך 24 שעות בהתאמה (איור 1F).

5. הליך חלוקה

  1. הסר את החלקים העודפים של דופן גוף הזחל עם להב חד ושמור על טרפז, כולל קטע A2/A3 .
    הערה: הקו העליון צריך להיות ליד השרירה - 13, וקו הבסיס צריך להיות רחוק מהדגימה לשרף אפוקסי. הגובה בין הקו העליון לקו הבסיס הוא כ 5-8 מ"מ.
  2. הסירו את הטרפז משארית הדגימה והדביקו אותו לקפסולה מלאה בשרף עם דבק A/B.
  3. אשרו את מיקום השריריםה-6 וה-7 של מקטעי A2 ו-A 3 תחת מיקרוסקופ האור (איור 1G) ושמרו על המישור המשיק במקביל לשרירה-6 .
  4. חותכים חמישית מהמדגם לאורך שני הצדדים של קטע A3 .
    הערה: הסר את רוב שריר6 , ושמור על 1/3 מרוחב השרירהשביעי .
  5. בעזרת מיקרוטום דק במיוחד, הכינו חלק דק במיוחד של הדגימה החל מהשרירה-6 .
    הערה: עובי כל פרוסה הוא כ-90 ננומטר.
  6. מחברים כמה שיותר פרוסות לכל רשת נחושת.
  7. לבצע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כמתואר קודם16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דופן הגוף של זחל דרוזופילה מורכבת מ-30 סיבי שריר הניתנים לזיהוי המסודרים בתבנית רגילה ונראים כמו פרוסה דקה לאחר נתיחה וקיבוע21 (איור 1A). הדגימה נשארת שטוחה במהלך תהליך ההתייבשות עקב נוכחות רשתות המתכת (איור 1B, C). שריר גוף הזחל קבור בלוח דק עשוי משרף אפוקסי (איור 1D-G), אשר ממוקם בקלות ובדייקנות ומודבק לקפסולה מלאת השרף (איור 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דגימות זחלי דרוזופילה נוטות להתכרבל במהלך התייבשות, מכיוון שהדגימות דקות, מה שמקשה על איתור מדויק של הצומת העצבית-שרירית, ובכך מגדיל את הקושי ועומס העבודה להכנת הדגימה. השיפור המסורתי הוא קיצור מדגם7, אך הדגימות עדיין היו מסולסלות בדרגות שונות.

בשיטה שלנו ישנם שני שלבים קריטיים: ראשית, הדגימות נשארות שטוחות לאורך כל תהליך ההתייבשות בשל הגבלת רשתות המתכת. מלבד זאת, בתהליך הפילמור ניתן לפילמר את הדגימה על ידי דחיפתה בין מוצרי הפלסטיק על מנת למנוע מהדגימה להתקפל ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין מענק 32070811, ו אוניברסיטת דרום מזרח (סין) ניתוח מבחן קרן 11240090971. אנו מודים למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ולמרכז לניתוח מורפולוגי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת דרום-מזרח, נאנג'ינג, סין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-אפוקסיפרופאןשנחאי לינג פנג ריאגנט כימי ושות', בע"מJYJ 037-2015סוכן חודר
דרוזופילה מניותבלומינגטוןאף אחדזני הדברת דרוזופילה מסוג פרא ששימשו במחקר זה היו כולם W1118, וגודלו על פי שיטות גידול סטנדרטיות
מבחנות זכוכית עם תחתית שטוחהHaimen Chenxing Experimental Equipment Company ללאמבחנות זכוכית עם תחתית שטוחה (בקבוק) עם פקק ספוג (או פקק בקבוקים)
K4M Cross-linker  Agar ScientificCat# 1924Bשרפי ההטמעה מבוססים על נוסחת אקרילט ומתאקרילט צולבת מאוד 
שרף K4M (מונומר B)  Agar ScientificLot # 631557מונומר שרף
סרט פוליווינילHaimen Chenxing חברת ציוד ניסיוני אף אחדסרט פוליאתילן שקוף הוא הטוב ביותר, עובי של כ 0.2 מ"מ
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 אפוקסיSPI02823-DAמאיץ
SPI-Chem NMASPISpI#02828-AFקשיח לאפוקסי
SPI-PON 812 אפוקסיSPISPI SPI#0259-ABמונומר
שרףרשת פלדה חנות גינון Yuhuiyuan (מקוונת)ללאנחושת או נירוסטה נטו
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורהיטאצ'י H-765011416692כל הרשתות (עליהן נאספו דגימות) הוכתמו בציטראט עופרת ונצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
מיקרוטום דק במיוחדLeica UC7 מיקרוטום דק595915כל פעולות החיתוך מתבצעות על מיקרוטום דק במיוחד של Leica UC7 באמצעות סכין יהלום
במיוחד

מקורות

  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  3. Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
  4. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  5. Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
  6. Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).
  7. Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
  8. Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).
  9. Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
  10. Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
  11. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  12. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
  13. Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
  14. Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
  15. McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
  16. Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
  17. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).
  18. Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
  19. Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
  20. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
  21. Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
  22. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
  23. Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
  24. Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
  25. Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
  26. Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

תגיות

חיבור עצבי-שרירי של דרוזופילהחיתוך דק במיוחדהטמעה בשרף אפוקסימיקרוסקופיה קונפוקליתמיקום שריריםטכניקת רשת מתכתדופן הגוף של זחלמבנה סינפטי
אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.