Method Article

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצומת הנוירומוסקולרית דרוזופילה (NMJ) התפתחה כמערכת מודל רבת ערך בתחום מדעי המוח. היישום של מיקרוסקופ קונפוקלי ב - Drosophila NMJ מאפשר לחוקרים להשיג מידע סינפטי, המקיף הן נתונים כמותיים על שפע סינפסות והן תובנות מפורטות לגבי המורפולוגיה שלהם. עם זאת, ההתפלגות המפוזרת והטווח החזותי המוגבל של ה- TEM מציבים אתגרים לניתוח האולטרה-סטרוקטורלי. מחקר זה מציג שיטת הכנת דגימות חדשנית ויעילה העולה על הגישה הקונבנציונלית. ההליך מתחיל בהנחת רשת מתכת בבסיס בקבוק או מבחנה בעלת תחתית שטוחה, ולאחר מכן מיקום דגימות זחלים קבועות על הרשת. רשת שינוי נוספת מונחת מעל הדגימות, כדי להבטיח שהן ממוקמות בין שתי רשתות השינוי. הדגימות הקבועות מיובשות היטב ומוחדרות לפני שממשיכים בהליך ההטבעה. לאחר מכן הטבעה של הדגימות בשרף אפוקסי מתבצעת באופן יריעה שטוחה, המאפשרת הכנת שרירים למיקום וחתך. כתוצאה מצעדים אלה, ניתן לדמיין את כל השרירים של זחלי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ אור, ובכך להקל על המיקום והחתך הבאים. עודף שרף מוסר לאחר איתור השרירים ה- 6 וה- 7 של חלקי הגוף A2 ו- A3. מבוצעת חתך טורי דק במיוחד של השריר ה- 6 או ה- 7.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ אלקטרונים הוא אחת השיטות האידיאליות ביותר לחקר מבנה העל של חומרים ביולוגיים שיכולים להדגים חזותית ומדויקת את המבנה הפנימי של תאים ברמה ננומטרית1. עם זאת, בשל מורכבות תהליך הכנת הדגימה והעלות הגבוהה, מיקרוסקופ אלקטרונים אינו פופולרי כמו מיקרוסקופ אור. ההתקדמות האחרונה בטכניקות מיקרוסקופיית אלקטרונים הובילה לשיפור משמעותי באיכות התמונה, במקביל להפחתה יוצאת דופן בעומס העבודה הנלווה. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ אלקטרונים תפס תפקיד חשוב בקידום הידע המדעי בתחומים מגוונים2.

דרוזופילה הוא מודל חייתי מצוין לביצוע מניפולציות גנטיות כדי לשלוט במדויק בביטוי המרחבי והזמני של גני מטרה

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: שיטת הכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת המשמשת במאמר זה דווחה בעבר16. חשוב לציין כי הבחירה של ריאגנטים ואת התאמת המינון נחוצים בהתאם המדגם. ישנם ריאגנטים כימיים רעילים רבים המשמשים בתהליך הכנת הדגימה, ולכן, המפעיל צריך לנקוט באמצעי הגנה מסוימים, כגון לבישת ביגוד מגן וכפפות ופעולה במכסה מנוע.

1. הליך נתיחה, קיבוע והשמה

  1. דיסקציה
    1. נתחו את הזחלים הנודדים בסוף ה-3 בתמיסת ינואר וקבלו את כל דופן הגוף על פי הנהלים הסטנדרטיים17. הכן את הפתרון של יאן באופן הבא: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM סוכרוז, 5mM HEPES, pH 7.4
      הערה: דופן הגוף של זחלי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דופן הגוף של זחל דרוזופילה מורכבת מ-30 סיבי שריר הניתנים לזיהוי המסודרים בתבנית רגילה ונראים כמו פרוסה דקה לאחר נתיחה וקיבוע21 (איור 1A). הדגימה נשארת שטוחה במהלך תהליך ההתייבשות עקב נוכחות רשתות המתכת (איור 1B, C). שריר גוף הזחל קבור בלוח דק עשוי משרף אפוקסי (איור 1D-G), אשר ממוקם בקלות ובדייקנות ומודבק לקפסולה מלאת השרף (איור 1.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות זחלי דרוזופילה נוטות להתכרבל במהלך התייבשות, מכיוון שהדגימות דקות, מה שמקשה על איתור מדויק של הצומת העצבית-שרירית, ובכך מגדיל את הקושי ועומס העבודה להכנת הדגימה. השיפור המסורתי הוא קיצור מדגם7, אך הדגימות עדיין היו מסולסלות בדרגות שונות.

בשיטה שלנו ישנם שני שלבים קריטיים: ראשית, הדגימות נשארות שטוחות לאורך כל תהליך ההתייבשות בשל הגבלת רשתות המתכת. מלבד זאת, בתהליך הפילמור ניתן לפילמר את הדגימה על ידי דחיפתה בין מוצרי הפלסטיק על מנת למנוע מהדגימה להתקפל ע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין מענק 32070811, ו אוניברסיטת דרום מזרח (סין) ניתוח מבחן קרן 11240090971. אנו מודים למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ולמרכז לניתוח מורפולוגי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת דרום-מזרח, נאנג'ינג, סין.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-אפוקסיפרופאןשנחאי לינג פנג ריאגנט כימי ושות', בע"מJYJ 037-2015סוכן חודר
דרוזופילה מניותבלומינגטוןאף אחדזני הדברת דרוזופילה מסוג פרא ששימשו במחקר זה היו כולם W1118, וגודלו על פי שיטות גידול סטנדרטיות
מבחנות זכוכית עם תחתית שטוחהHaimen Chenxing Experimental Equipment Company ללאמבחנות זכוכית עם תחתית שטוחה (בקבוק) עם פקק ספוג (או פקק בקבוקים)
K4M Cross-linker  Agar ScientificCat# 1924Bשרפי ההטמעה מבוססים על נוסחת אקרילט ומתאקרילט צולבת מאוד 
שרף K4M (מונומר B)  Agar ScientificLot # 631557מונומר שרף
סרט פוליווינילHaimen Chenxing חברת ציוד ניסיוני אף אחדסרט פוליאתילן שקוף הוא הטוב ביותר, עובי של כ 0.2 מ"מ
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 אפוקסיSPI02823-DAמאיץ
SPI-Chem NMASPISpI#02828-AFקשיח לאפוקסי
SPI-PON 812 אפוקסיSPISPI SPI#0259-ABמונומר
שרףרשת פלדה חנות גינון Yuhuiyuan (מקוונת)ללאנחושת או נירוסטה נטו
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורהיטאצ'י H-765011416692כל הרשתות (עליהן נאספו דגימות) הוכתמו בציטראט עופרת ונצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
מיקרוטום דק במיוחדLeica UC7 מיקרוטום דק595915כל פעולות החיתוך מתבצעות על מיקרוטום דק במיוחד של Leica UC7 באמצעות סכין יהלום
במיוחד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

Related Articles