זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

Summary

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

Abstract

במהלך העשור האחרון, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה אפשרה אפיון מעמיק של מערכות ביולוגיות במגוון רחב של יישומים. פרוטאום פני התא ("surfaceome") במחלות אנושיות הוא בעל עניין משמעותי, שכן חלבוני ממברנת הפלזמה הם המטרה העיקרית של רוב הטיפולים המאושרים קלינית, כמו גם מאפיין מפתח שבאמצעותו ניתן להבחין באופן אבחנתי בין תאים חולים לרקמות בריאות. עם זאת, אפיון ממוקד של חלבוני הממברנה ופני השטח של התא נותר מאתגר, בעיקר בשל המורכבות של ליזטים תאיים, המסווים חלבונים מעניינים על ידי חלבונים אחרים בעלי שפע גבוה. כדי להתגבר על מחסום טכני זה ולהגדיר במדויק את פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים באמצעות פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסה, יש צורך להעשיר את הליזאט של התא לחלבוני פני התא לפני הניתוח על ספקטרומטר המסה. מאמר זה מציג זרימת עבודה מפורטת לתיוג חלבוני פני התא מתאי סרטן, העשרת חלבונים אלה מהליזאט של התא, והכנת דגימה לאחר מכן לניתוח ספקטרומטריית מסה.

Introduction

חלבונים משמשים כיחידות הבסיסיות שבאמצעותן מתבצעות רוב הפונקציות התאיות. אפיון המבנה והתפקוד של חלבונים רלוונטיים הוא צעד חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים. במהלך העשור האחרון, התקדמות בטכנולוגיית ספקטרומטריית מסה, תוכנות ניתוח ומסדי נתונים אפשרו זיהוי ומדידה מדויקים של חלבונים בקנה מידה רחב של פרוטאום¹. ניתן להשתמש בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה במגוון רחב של יישומים, החל מניתוח מדעי בסיסי של מסלולים ביוכימיים, לזיהוי מטרות תרופות חדשות בסביבה תרגומית, ועד לאבחון וניטור מחלות במרפאה². בעת סינון מטרות תרופות חדשות, אפיון הפרוטאום של פני התא חשוב במיוחד, כאשר למעלה מ-65% מהתרופות האנושיות המאושרות כיום מכוונות לחלבונים³. תחום האימונותרפיה לסרטן מסתמך לחלוטין גם על אנטיגנים ספציפיים לסרטן על פני התא כדי למקד ולחסל באופן ספציפי תאי גידול⁴. פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה יכולה אפוא לשמש ככלי מבטיח לזיהוי חלבונים חדשים על פני התא לקראת התערבויות טיפוליות.

עם זאת, ישנן מספר מגבלות בעת שימוש בשיטות פרוטאומיקה קונבנציונליות לסקר תאי גידול עבור מטרות חלבון חדשות על פני התא. דאגה עיקרית היא שחלבונים על פני השטח מהווים חלק קטן מאוד מכלל מולקולות החלבון בתא. לכן, שברים של חלבונים אלה מוסווים על ידי שפע גבוה של חלבונים תוך-תאיים בעת ביצוע ניתוח ספקטרומטריית מסה של מחלקת הליזאט⁵. מגבלה זו מקשה על אפיון מדויק של פרוטאום פני התא עם זרימת עבודה מסורתית של פרוטאומיקה. כדי להתמודד עם אתגר זה, יש צורך לפתח דרכים להעשרת חלבוני פני התא מתוך הליזאט של התא השלם, לפני ניתוח על ספקטרומטר המסה. שיטה אחת כזו כוללת חמצון ותיוג ביוטין של חלבוני פני התא הגליקוזיליים בתאים השלמים, והעשרה לאחר מכן של חלבונים ביוטיניליים אלה מהליזאט עם משיכת נויטרווידין, תהליך שזכה לכינוי "לכידת פני התא"⁶. מכיוון ש~85% מחלבוני פני התא של יונקים נחשבים לגליקוזילציה⁷, זה משמש כשיטה יעילה להעשרת פרוטאום פני התא מתוך כל התא ליזאט. מאמר זה מתאר זרימת עבודה שלמה, החל מתאים מתורבתים, של תיוג ביוטין על פני התא, ולאחר מכן הכנת דגימה לניתוח ספקטרומטריית מסה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1). על פני מספר שכפולים, שיטה זו מספקת כיסוי חזק של פרוטאום פני התא של דגימה מסוימת. שימוש בשיטה זו לאפיון פרוטאום פני התא של תאים גידוליים ובריאים יכול להקל על גילוי אנטיגנים חדשים על פני התא לזיהוי מטרות אימונותרפיות פוטנציאליות⁸.

Protocol

הערה: תאי פלסמציטומה AMO1 שימשו לניסוי פרוטאום זה על פני התא. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול גם עבור סוגי תאים אחרים, כולל מגוון רחב של קווי תאים מתלים ודבקים⁹, כמו גם סוגים שונים של דגימות ראשוניות¹⁰. עם זאת, מספרי תאים (חומר מוצא לניסוי) בדרך כלל צריכים להיות מותאמים לכיסוי פרוטאום שווה ערך. לפרטים הקשורים לחומרים וציוד, עיין בטבלת החומרים. לפרטים הקשורים למאגרים ותמיסות ריאגנטים והרכבם, ראה טבלה 1.

1. תיוג פני התא עם ביוטין

1. ספרו את התאים המתורבתים והגלולה כ-3.5 ×-10⁷ תאים חיים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב-500 × גרם, 24 מעלות צלזיוס).
   הערה: תאי הפלסמציטומה AMO1 הועברו עם מדיה טרייה כל 3 ימים לפני הקציר.
2. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח קרים (4 מעלות צלזיוס) של Dulbecco עם חוצץ פוספט (D-PBS) (ללא סידן, ללא מגנזיום), וצנרת בעדינות למעלה ולמטה.
3. גלולה את התאים שוב (כמו בשלב 1.1) וחזור על שלב הכביסה (שלב 1.2) פעם נוספת (שתי כביסות בסך הכל).
4. לאחר הכביסה השנייה, גלולה את התאים (כמו בשלב 1.1) והשעתה אותם ב-990 מיקרוליטר של D-PBS קר על ידי פיפטינג עדין.
5. הכן תמיסת מלאי של 160 מ"מ נתרן מטאפריודט (NaIO₄) מראש. מפצלים ל-50 מיקרוליטר ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת נתרן מטאפריודט של 160 מ"מ לתרחיף התא בשלב 1.4, ערבב היטב ודגר על רוטור מקצה לקצה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
6. לאחר השלמת הדגירה, גלו את התאים (כמו בשלב 1.1), שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של D-PBS קר. חזור על שלב כביסה זה פעמיים (שלוש כביסות בסך הכל). לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את התאים ב -989 מיקרוליטר של D-PBS.
7. הכינו מראש תמיסת מלאי של 100 מ"מ ביוציטין הידרזיד. מפצלים ל-50 מיקרוליטר ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. הוסף 1 מיקרוליטר של אנילין ו-10 מיקרוליטר של 100 מ"מ ביוציטין הידרזיד לתרחיף התא בשלב 1.6, ערבב היטב ודגירה על רוטור מקצה לקצה למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
8. לאחר השלמת הדגירה, גלו את התאים (כמו בשלב 1.1), שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של D-PBS קר. חזור על שלב כביסה זה פעמיים (שלוש כביסות בסך הכל).
9. לאחר השטיפה השלישית, שאפו את הסופרנטנט בזהירות עם פיפט, והקפיאו את כדור התא על ידי הנחת הצינור בנוזל N₂. הנח את הגלולה הקפואה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, עד שהיא מוכנה להמשיך עם ליזה ומשיכה.

2. ליזיס תאים ומשיכת ביוטין

1. הפשירו את כדור התא הקפוא על קרח.
2. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה פי 2 לגלולה, ערבב היטב ומערבולת למשך 30 שניות
   הערה: ייתכן שיידרשו פיפטינג ומערבולת נמרצים כדי ליז את הגלולה במלואה. פסולת בלתי מסיסה (כלומר, DNA) מקובלת, מכיוון שהיא מוסרת בשלב הסוניקציה שלאחר מכן.
3. סוניקציה של התא ליזאט על קרח (שלוש התפרצויות, 20 שניות כל אחת, 60% מחזור עבודה).
4. צנטריפוגה את הליזאט כדי לגלול את כל הפסולת שנותרה (10 דקות ב-17,200 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס).
5. בזמן שהליזאט צנטריפוגה, הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי שרף אגרוז נויטרווידין לעמוד סינון. חבר את העמוד לסעפת ואקום, החל ואקום עדין ושטוף את החרוזים על ידי הזרמת 3 מ"ל של מאגר כביסה 1 מעליהם.
6. הסר את עמוד הסינון מסעפת הוואקום, מכסה את התחתית והוסף את ליזט התא המובהר לעמוד עם החרוזים. מכסים את החלק העליון של העמוד, ודוגרים את הליזאט עם החרוזים על רוטור מקצה לקצה למשך 120 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס><. הערה: בעת מכסה את החלק העליון של העמוד, החזק בחוזקה את המכסה התחתון במקומו, אחרת הוא עלול להיעקר וליזאט התא עלול לדלוף במהלך הדגירה.
7. הכן מאגרי כביסה 1, 2 ו-3 (כ-5 מ"ל מכל מאגר כביסה לכל דגימה, עיין בטבלה 1), והנח אותם באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס
8. לאחר סיום הדגירה של הליזאט, הנח את עמוד הסינון בחזרה על סעפת הוואקום, החל ואקום עדין ושטוף את החרוזים על ידי הזרמת 5 מ"ל של מאגר כביסה 1 מעליהם.
   הערה: ניתן להשתמש ביותר מ-5 מ"ל של מאגרי הכביסה לכביסה; כביסה נוספת עלולה להפחית את הרקע, כריכה לא ספציפית על החרוזים.
9. חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה 2.
10. חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה 3.
11. לאחר שמאגר הכביסה הסופי זרם כולו דרך החרוזים, הסר את העמוד מהסעפת. הוסף לחרוזים 100 מיקרוליטר של תמיסת "ליז" והעביר אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה קושר חלבון נמוך של 1.7 מ"ל עם פיפט. סובב בקצרה את הצינור כדי ליישב את החרוזים, והסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה מבלי להפריע לחרוזים המיושבים.
    הערה: הריאגנטים בשלב זה ובכל השלבים הבאים משתמשים בערכת הכנת דגימות פרוטאומיקה זמינה מסחרית. הערכה מספקת זרימת עבודה אופטימלית ופשוטה להכנת דגימות. עם זאת, ניתן לבצע שלבים אלה גם ללא תלות בערכה, תוך שימוש בזרימת עבודה מסורתית של פרוטאומיקה כמתואר ב-Verma et al.⁹. אם החרוזים נשארים דבוקים לצד או לתחתית העמוד, אפשר לחרוזים שהועברו לצינור להתייצב, והשתמש בתמיסת "ליז" נוספת בצינור כדי להעביר את החרוזים הנותרים.
12. מניחים את הצינור על גוש חום/שייקר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ומנערים בחום של 1,000 סל"ד למשך 10 דקות
    הערה: שלב זה נדרש להפחתה ואלקילציה של שאריות ציסטאין לפני העיכול.

3. עיכול חלבונים

1. השעו מחדש את הטריפסין המיובש (שפופרת "עיכול" בערכה, המאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס) על ידי הוספת 210 מיקרוליטר של תמיסת "השעיה". שלח את התמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הטריפסין המיובש מושעה מחדש.
2. לאחר השלמת הדגירה, הוסף לחרוזים 50 מיקרוליטר מתמיסת הטריפסין התלויה. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נערו במהירות של 500 סל"ד למשך 90 דקות לפחות כדי לעכל את החלבון.
3. לאחר השלמת העיכול, העבירו את התמיסה המכילה את החרוזים לעמוד ספין, והכניסו את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מ"ל. סובב את הצינור (500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר [RT]) כדי להפריד את תמיסת הפפטיד המעוכלת מהחרוזים.
   הערה: בשלב זה, ניתן לבצע טיפול ב-PNGase על החרוזים לאחר הפרדתם מתמיסת הפפטיד, כדי לחסל שברי פפטיד ביוטיניליים מחרוזי הסטרפטווידין. לאחר מכן ניתן להעביר את דגימת הפפטיד הזו קדימה לאורך שארית זרימת העבודה כדגימת פפטיד נפרדת ומשנית שניתן לנתח ולהשוות עם הדגימה הראשונית מטריפסיניזציה על חרוזים. גישת PNGase עשויה לספק נתונים משלימים לטריפסיניזציה על חרוזים, בהתחשב בספציפיות הנוספת עבור אספרגינים N-גליקוזיליים שנלכדו על סמך שינוי שרשרת צד הניתנת לזיהוי MS¹². עם זאת, החיסרון של גישת פליטה רציפה זו הוא הדרישה לזמן כפול מזמן מכשיר ספקטרומטר המסה לניתוח דגימה.
4. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת "עצור" כדי לעצור את תגובת העיכול ולהחמיץ את תמיסת הפפטיד.

4. התפלת פפטידים

1. בעזרת מתאם צינור, הנח עמוד התפלה בצינור מיקרו-צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מ"ל. הוסף את כל תמיסת הפפטיד המחומצת לעמודה. סובב את העמודה (3,800 × גרם למשך 3 דקות) כך שהתמיסה תזרום דרך העמודה. הפפטידים קשורים כעת לעמוד; השליכו את הזרימה.
2. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת "שטיפה 1" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). השלך את הזרימה.
3. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת "שטיפה 2" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). השלך את הזרימה.
4. העבירו את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ומסומן בנפח 1.7 מ"ל עם קושר חלבון נמוך. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת "Elute" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הוסף עוד 100 מיקרוליטר של תמיסת "Elute" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הפפטידים נפלטים כעת מהעמוד לתוך הצינור.
5. מניחים את תמיסת הפפטיד בצנטריפוגת ואקום ומניחים לה להתייבש למשך הלילה. הנח את הפפטידים המיובשים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לכמות, ונתח על ספקטרומטר המסה.

5. השעיה וכימות של פפטידים

1. השעו מחדש את הפפטידים המיובשים ב-20 מיקרוליטר של ממס A (0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל).
2. צנטריפוגה את הפפטידים המרחפים מחדש (17,200 × גרם למשך 10 דקות) כדי לזרוק כל פסולת בלתי מסיסה.
3. הכן תקני פפטידים לבדיקת כימות פפטיד קולורימטרי.
   1. מניחים 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פפטידים של 1,000 מ"ג/מ"ל בבאר אחת של צלחת של 96 בארות.
   2. בצע דילול סדרתי בן שבעה שלבים בצלחת עם מים נטולי יונים (DI), כדלקמן, עם 5 מיקרוליטר מכל תקן לבאר: 1,000 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/מ"ל, 125 מ"ג/מ"ל, 62.5 מ"ג/מ"ל, 31.25 מ"ג/מ"ל ו-15.625 מ"ג/מ"ל. מניחים 5 מיקרוליטר מי DI בבאר שמינית לריק.
4. הנח 4 מיקרוליטר של מי DI בשלוש בארות נפרדות של צלחת 96 הבארות. הוסף 1 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המרחפת לכל באר, לנפח כולל של 5 μL.
   הערה: בעת פיפטינג של תמיסת הפפטיד לכימות, פיפטינג בזהירות מהחלק העליון של התמיסה כדי למנוע הפרעה לפסולת שקועה.
5. חשב כמה מגיב עובד דרוש (45 מיקרוליטר נדרש לבאר). הכן את הנפח הנדרש של מגיב העבודה של הבדיקה הקולורימטרית; מערבולת המגיב העובד כדי להבטיח ערבוב נכון של הרכיבים.
6. הוסף 45 מיקרוליטר של המגיב העובד לכל אחת מבארות הסטנדרט והדגימה.
   הערה: הפוך את התקנים לכפולים, והשתמש בצנרת רב-ערוצית כדי להבטיח הבדל מינימלי בתזמון הוספת המגיב לבארות.
7. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
8. נתח את הצלחת בקורא צלחות אוטומטי. השתמש בערכי הספיגה שנרשמו עבור הדגימות הסטנדרטיות כדי ליצור עקומה סטנדרטית ליניארית. קבע את המשוואה של העקומה הסטנדרטית וערך R². אם ערך R² סביר (≥0.95), השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז הפפטידים המרחפים, תוך התחשבות בדילול פי חמישה בלוחית הבדיקה הקולורימטרית.

6. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) של הפפטידים המעוכלים

1. התאם את ריכוז דגימות הפפטיד ל-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר על ידי הוספת ממס A, והעביר 10 מיקרוליטר לתוך צינור קושר חלבון נמוך של 0.6 מ"ל.
2. הנח את הצינור בדגימה האוטומטית של LC.
3. הגדר את הפרמטרים LC ו-MS/MS, לפי <מחלקה חזקה="xfig">איור 2 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 3.
4. הזרקו 5 מיקרוליטר (1 מיקרוגרם) של דגימת הפפטיד לתוך מערך LC-MS/MS לניתוח.
   הערה: הגדרות LC-MS/MS המוצגות כאן מייצגות רק את האיורים. בהתאם לזמינות מכשירי LC ו-MS, משתמשים יכולים לשנות את ההגדרות עבור שיפוע LC ופרמטרים MS/MS כדי לקבל כיסוי פרוטאום עמוק. עבור מאמר זה, ניתוח נתוני MS בוצע באמצעות MaxQuant https://www.maxquant.org/, ניתוח נתונים משני בוצע באמצעות https://maxquant.net/perseus/ פרסאוס, וניתוח מסלול באמצעות https://reactome.org/.

Results

עבור ניסוי זה, אפיינו את פרוטאום פני התא של קו תאי גידול על ידי תיוג חלבוני ממברנה N-glycosylated של תאים שלמים בביוטין, והעשרת החלבונים המסומנים הללו מליזאט התא כולו עם משיכת נויטרווידין (איור 1). יתר על כן, ביצענו ניתוח פרוטאום באמצעות LC-MS/MS כדי לאפיין חלבונים מועשרים על פני התא. בניגוד לניתוח פרוטאום של תא שלם, כאן, המטרה הייתה לאפיין רק חלבונים על פני התא. לפיכך, התחלנו עם קלט דגימה של 3.5 × 10⁷ תאי פלסמציטומה AMO-1. השגנו ריכוז פפטיד סופי של ~630 ננוגרם/מיקרוליטר ...

Discussion

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה שאיפשר אפיון בלתי מוטה של אלפי חלבונים לא ידועים בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו מאפשרת לנו לזהות ולכמת את החלבונים, כמו גם ללקט מגוון תובנות לגבי יכולות המבנה והאיתות של תאים ורקמות, על ידי אפיון מגוון החלבונים הקיימים בדגימה מסוימת. מעבר לפרופיל חלבון גלובלי בדגימה, ספקטרומטריית מסה מאפשרת לנו לאפיין שינויים שונים לאחר תרגום (PTMs) בחלבונים אלה, ומספקת הצצה עמוקה עוד יותר לשלבי מסלולי האיתות ודינמיקת החלבון שאינם זמינים בעת ניתוח ברמת DNA או RNA^1<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ערכות חזקות>
96X iST ערכת הכנת דוגמאות	PreOmics	P.O.00027	Proteomics ערכת הכנת דוגמאות. כולל ריאגנטים להפחתה, אלקילציה ועיכול. כלול גם עמודי התפלה וריאגנטים.
פפטיד קולורימטרי כמותי של פירס	תרמו	23275	כולל תקני פפטידים ורכיבים של ריאגנטים עובדים.
<ריאגנטים חזקים>
אצטוניטריל	פישר	A955-1
אמוניום ביקרבונט	Millipore Sigma	09830-1KG
ביוציטין הידרזיד	ביוטיום	90060
D-PBS (ללא מלחי סידן ומגנזיום)	מתקן תרבית תאים UCSF	CCFAL003-225B01
חומצה פורמית	Honeywell	94318
מעכב פרוטאז ופוספטאז מעכב קוקטייל לשימוש חד פעמי	תרמו	1861280
קיבולת גבוהה נויטרווידין אגרוז שרף	תרמו	29204
מתקן תרבית תאים	מלוח פוספט	CCFAL001-22J01
RIPA מאגר ליזה, 10x	Millipore Sigma	20-188
נתרן כלורי	פישר	BP358-212
נתרן מטאפריודאט	אלפא Aesar	13798
טריפן כתם כחול (0.4%)	Gibco	15250-061
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038
אוריאה (דרגת פרוטאומיקה)	VWR	M123-1KG
<חזק>ציוד
TC20 אוטומטי תא מונה	Bio-Rad	1450102
PrismR מיקרוצנטריפוגה	Labnet International	C2500-R-230V
סוניקטור	VWR	ברנסון סוניפייר 240
ואקום סעפת		Promega Promega Vac-Man
רועד Heatblock	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
מסובב מקצה לקצה	Labnet	אקדח מתכוונן מסובב
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC ו-UHPLC
Q Exactive Plus היברידי Quadrapole Orbitrap ספקטרומטר מסה	תרמו	IQLAAEGAAPFALGMBDK
קורא מיקרופלייט	Biotek	Biotek Synergy 2
רכז ואקום	Labconco	7810010
<חזק>אספקה
1.5 מ"ל חלבון LoBind צינורות	Eppendorf	22431081
1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עמודי
סינון	Bio-Rad	7326008
עמודי ספין	תרמו	ברקוד 69725