Method Article

חקר תפקודי רקמת השומן

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

Cho, D. S., Doles, J. D. הכנת תאי אב שומן מרקמות שומן אפידידימליות של עכבר. כתב העת לניסויים חזותיים. (162), doi: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. בידוד של תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממאגרי שומן תוך-בטניים של עכברים. כתב העת לניסויים חזותיים. (162), doi: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. בידוד של אדיפוציטים ברי קיימא ושבר כלי דם סטרומלי מרקמת שומן קרביים אנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים. כתב העת לניסויים חזותיים. (164), doi: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. חקר מבנה רקמת השומן על ידי ניקוי מתילסליצילט והדמיה תלת מימדית. כתב העת לניסויים חזותיים. (162), doi: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. ניתוח לימפה ורשת דם במהלך השמנת יתר. כתב העת לניסויים חזותיים. (165), doi: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד השומן. כתב העת לניסויים חזותיים. (171), doi: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. בידוד, התפשטות והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס. כתב העת לניסויים חזותיים. (171), doi: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. תרבית אדיפוציטים תלת מימדית כמודל לחקר שיפוץ רקמת שומן לבנה המושרה על ידי קאשקסיה. כתב העת לניסויים חזותיים. (167), doi: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן באדיפוציטים אנושיים באמצעות סינון ואולטרה-צנטריפוגה. כתב העת לניסויים חזותיים. (170), doi: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השמנת יתר, המאופיינת בעלייה במסת רקמת השומן (AT) ובעיצוב מחדש פרו-דלקתי של תאי חיסון AT, עלתה כבעיה מרכזית בבריאות הציבור ברחבי העולם מכיוון שהיא מגדילה באופן דרמטי את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2 ומחלות כבד. לפיכך, חקר מבנה ותפקוד AT הפך לאתגר קליני חשוב. באוסף שיטות זה, אנו מציגים מספר שיטות חדישות שפותחו כדי לחקור את המבנה והתפקוד של AT בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

AT היא רקמה הטרוגנית המורכבת ממספר אוכלוסיות תאים כולל אדיפוציטים בוגרים, תאי אב שומן (APCs), אבות פיברו-דלקתיים (FIPs), תאי אנדותל ותאי חיסון. לכן, על מנת לאפיין רקמה זו, ניתן לבצע פנוטיפ של תא בודד. במאמריהם, Cho et al. ו-Peics et al. מספקים פרוטוקולים לבידוד ואפיון APCs לבנים של עכברים תושבים על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)1,2. שלב זה הוא מרכזי לא רק בספירת מספר ה-APCs המקומיים, המהווה גורם חשוב בקביעת יכולת התרחבות AT, אלא גם בחקירה נוספת של תפקודם של תאים אלה ברמת התא הבודד. Peics et al. מספקים גם שיטה לבודד FIPs2 לבנים של עכברים, תאים מייצרי קולגן שאינם אדיפוגניים שעשויים לתרום להתפתחות פנוטיפ פרו-דלקתי הידוע כממלא תפקיד בתפקוד לקוי של AT. באופן דומה, אסטרדה-גוטיירז ואחרים מתארים פרוטוקול לבידוד בו-זמנית של אדיפוציטים בוגרים ברי קיימא ותאי שבר כלי דם סטרומלי מביופסיות AT קרביים אנושיים3. בסך הכל, פרוטוקולים אלה הם תקן הזהב ליצירת תרחיף תא בודד מ-AT אנושי ועכבר, שהוא הצעד הקריטי הראשון לספירה נוספת ופנוטיפ פונקציונלי של תת-אוכלוסיות תאי ה-AT השונות.

הקשר בין המבנה לפונקציה רלוונטי מאוד ב-AT. סימן היכר של תפקוד לקוי של AT במהלך השמנת יתר קשור לעלייה בגודל השומן ולשיפוץ עמוק של ה-AT. שיפוץ זה משפיע לא רק על אוכלוסיות השומן ותאי החיסון, אלא גם על רשת הלימפה וכלי הדם. כדי להעריך את השינויים הללו בכל ה-AT, גילרון ועמיתיו מפתחים פרוטוקול סליקה AT פשוט מאוד, זול ומהיר4. פרוטוקול פשוט זה מדמיין באופן תלת מימדי את המורפולוגיה של AT של עכבר שלם וביופסיות AT אנושיות גדולות. זה כולל את הרשתות העצביות וכלי הדם, השומנים והתפלגות תאי החיסון המולדים והאדפטיביים, שהם כולם פרמטרים חשובים למחקר בהשמנת יתר ובפתולוגיות הקשורות אליה. כדי לאפיין את ההשפעה של השמנת יתר על כלי הלימפה וכלי הדם של AT, Czepielewski et al. מספקים שיטה in vivo לצביעה בו זמנית של העץ הלימפטי וכלי הדם על ידי הזרקת לקטינים מצומדים פלואורוכרום5. פרוטוקול זה מספק דרך לנתח את המורפולוגיה in vivo של שתי הרשתות, כולל הצפיפות, הנפח וההסתעפות שלהן. מעניין ששילוב אסטרטגיית תיוג זו עם הליך ניקוי AT4 מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של כל העכבר AT בתלת מימד (3D)5. בסך הכל, גישות אלו יכולות לאפיין את מבנה ה-AT בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, ולקבל תובנה לגבי המתאם בין מבנה AT לתפקוד.

בשל ההטרוגניות הגבוהה ויכולת השיפוץ האדירה שלו, ניתוח תפקודם של אדיפוציטים בתוך AT in vivo אינו פשוט, ולכן פותחו מספר מערכות תרבית. היתרון העיקרי של כל מערכות תרבית התאים הללו הוא רמת השליטה הגבוהה על אוכלוסיית התאים והמיקרו-סביבה. Jager et al. מפתחים פרוטוקול פשוט למניפולציה של ביטוי RNA ב-3T3-L1 אדיפוציטים בוגרים מובחנים6. למרות שמערכת תרבית זו רחוקה מהתנאים הפיזיולוגיים האידיאליים, אדיפוציטים 3T3-L1 נשארים פונקציונליים ביחס לאיתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה וליפוליזה. לכן, פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה למניפולציה של ביטוי חלבון ו-RNA שאינו מקודד ולחקור את תפקידם בתפקודי אדיפוציטים. כדי להתקרב לתנאים פיזיולוגיים אידיאליים, פורת ועמיתיו מתארים שיטה ליצירת אדיפוציטים בוגרים פונקציונליים על ידי שימוש בתאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המתקבלים מקוק רזוס AT7. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבודד ADSCs ראשוניים וכיצד לגרום לשגשוג והתמיינות שלהם. המחברים מציעים עוד כי ניתן להתאים הליך זה למינים אחרים. למרות שמערכת תרבית זו קרובה יותר לתנאים פיזיולוגיים אידיאליים בהשוואה לקו התאים 3T3-L1, האדיפוציטים הבוגרים שמקורם ב-ADSCs ראשוניים גדלים בדו-ממד, השונה מ-in vivo. כדי להתמודד עם בעיה זו, בטיסטה ג'וניור ואחרים מספקים פרוטוקול יעיל למערכת תרבית רקמות בהדפסה תלת מימדית8. בעבודה זו, המחברים מייצרים אדיפוספרואידים מתאי שבר כלי דם סטרומלי של עכברים, והם מבדילים בין קודמני אדיפוציטים ישירות בתוך מערכת תרבית תלת מימדית זו. גישה זו קרובה באופן בלתי הפיך לתנאים פיזיולוגיים אידיאליים מאשר שיטת התרבית הדו-ממדית, אך יש לקחת בחשבון את המחסור בכלי דם שעשויים להביא חומרים מזינים לאדיפוציטים במרכז הספרואידים. ויסות ביטוי חלבון ו-RNA שאינו מקודד, כמתואר6, בתוך מערכות תרבית אלה עשוי להוביל לתובנה נוספת על התפקיד התפקודי של מטרות אלה באדיפוציטים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, מערכת כה מורכבת עדיין לא הוקמה. העניין העיקרי של מערכות תרבית ex vivo/in vitro אלה הוא רמת השליטה הגבוהה על המיקרו-סביבה, הכוללת גם את הגורמים המופרשים על ידי התאים. מבחינה זו, הפרוטוקול של Akbar et al. מבודד ומאפיין את השלפוחיות החוץ-תאיות (EVs) המופרשות על ידי אדיפוציטים אנושיים9. לאחרונה, EVs נמצאו כמווסתים מטבוליים חשובים; שיטה זו היא חובה לניתוח ההשפעה המטבולית של EVs אלה שמקורם באדיפוציטים במצבים מטבוליים שונים.

באוסף השיטות הנוכחי, אנו נותנים סקירה כללית של פרוטוקולים חדישים המכסים מספר היבטים של ניתוח AT, כולל מערכות תרבית ex vivo ו-in vitro , חקר רקמות שלמות תלת מימדיות וניתוח תאים בודדים. למרות שאף מערכת תרבית אינה מושלמת, חשוב לבחור את מערכת התרבות המותאמת לשאלה הביולוגית. לכן, אוסף שיטות זה מספק ארגז כלים גדול של נהלים לבידוד, הבחנה ומניפולציה של אדיפוציטים במבחנה. שילוב כל השיטות השונות המתוארות כאן יוביל לתובנה לגבי המורפולוגיה והתפקוד של AT.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה לז'אן-פרנסואה טנטי ולמיריי קורמונט על תמיכתם המדעית ותשומותיהם. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד'אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות לעתיד Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01), ותוכנית החוקרים הצעירים ל-J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) ול-J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose TissueAdipose Progenitor CellsMurine Adipose DepotsViable AdipocytesStromal Vascular FractionObesity AnalysisAdipocyte FunctionExtracellular VesiclesAdipocyte Culture ModelRNA AnalysisMacrophage Phenotyping3D Imaging

Related Articles