$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל האורגניזמים הרב-תאיים על פני כדור הארץ, כולל בעלי חיים וצמחים, התפתחו מאאוקריוטים חד-תאיים ~ לפני 1.7 מיליארד שנים1. להבדיל מפרוקריוטים פרימיטיביים, לתאים אוקריוטיים יש גרעין הקשור לממברנה ואברונים רבים סגורים בקרום בתוך הציטופלזמה שלהם, כולל מיטוכונדריה, מנגנון גולגי, הרטיקולום האנדופלזמי (ER), ליזוזומים ושלפוחית. אברונים אלה יוצרים תאים בהם ממוקמים פונקציות ביולוגיות מיוחדות ופעילויות מטבוליות יעילות ביותר. בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, רוב האברונים התוך-תאיים מכילים מבנים פונקציונליים הנופלים תחת גבול עקיפה של האור, מה שהופך את ההדמיה שלהם למאתגרת2. טכניקות תיוג מיקרוסקופיות וביולוגיות חדשניות מתחילות לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורות עדינות במיוחד ודינמיקה in vivo של אברונים. אוסף זה מאגד שיטות עדכניות שהצליחו לתייג ולדמות אברונים תוך-תאיים שונים על פני מינים שונים, ובכך קידמו את הבנתנו את הבקרה המרחבית-זמנית של ביולוגיה של אברונים.
בעשורים האחרונים, הפיתוח של חיישנים פלואורסצנטיים ותיוג חלבונים בתאים חיים הקלו מאוד על הבנת הדינמיקה של רשתות תוך-תאיות, העברת אותות ואינטראקציות בין תאים. על ידי שימוש בשיטות סינתטיות אנאורגניות מתקדמות, ננו-גבישים מוליכים למחצה פלואורסצנטיים בגודל ננו, הידועים גם בשם נקודות קוונטיות או QD, הומצאו כסוג חדש של מדווחים אופטיים. בדרך כלל, חלקיקי QD הם בגודל של 2-10 ננומטר ויש להם רגישות גבוהה לאור, יציבות וציטוטוקסיות נמוכה לתאים. חלקיקי QD הופיעו כחלופות לצבעים אורגניים וחלבונים פלואורסצנטיים להדמיית תהליכים תוך-תאיים ברזולוציה גבוהה. בפרוטוקול של Aishwarya et al., המחברים מתארים תיוג חיסוני בתיווך QD ואחריו הדמיה עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)3. על ידי ביצוע תיוג QD ממוקד נוגדנים והדמיה תחת TEM ברזולוציה גבוהה, המחברים הדמיינו בהצלחה את לוקליזציה של Sigmar1 על אברוני תאים מרובים בתאי לב של עכברים בוגרים והדגישו את העשרתו על הליזוזומים והממברנות המיטוכונדריאליות. בנוסף להדגשת הרזולוציה הגבוהה והרגישות הגבוהה של QD-TEM, המחברים מזכירים גם מספר חסרונות של השיטות. לדוגמה, טטרוקסיד האוסמיום המשמש בתיוג חיסוני בתיווך QD הורס באופן בלתי הפיך את תכונות הדגימה, והאופטימיזציה של שלבי הקיבוע וחשיפת האנטיגן היא מרכיב מרכזי אך מאתגר להבטחת תמונות באיכות גבוהה.
מלבד QD, צבעים רבים אחרים יושמו בהצלחה לתיוג אברונים בתאים חיים. שיטות אלה הקלו על הדמיה חיה של תהליך הטרנספורמציה או הטרנסלוקציה של אברוני התא in vivo. לפעמים, מספר צבעים ספציפיים לאברונים משמשים להמחשת סוגים שונים של אברונים בו זמנית. בפרוטוקול של Liu, Li et al.4, המחברים מספקים פרוטוקול מפורט לצביעה והדמיה חיה של מיטוכונדריה וליזוזומים בתאי פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEF) על ידי שימוש בשני צבעים שונים: MitoTracker Green ו-LysoTracker Red4. במחקר זה, שני הצבעים הראו רגישות פלואורסצנטית גבוהה ויציבות ספציפית למיטוכונדריה ולליזוזומים, בהתאמה. יתר על כן, המחברים צפו ותיעדו בהצלחה את התהליך התאי הקריטי in vivo של מיטופגיה המושרה על ידי קרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומטוקסי) פנילהידרזון (FCCP) בתאי MEF באמצעות הפרוטוקול. בדיון, המחברים מזכירים כי ניתן ליישם את הפרוטוקול עם קווי תאים שונים או תאים מרקמות על ידי אופטימיזציה של ריכוז הצבע וזמן הצביעה.
על ידי שימוש במבני מדווח המורכבים מחלבונים ספציפיים לאברונים המאוחים לתגים פלואורסצנטיים, ניתן לצפות בדינמיקה של אברונים ובדפוסי ביטוי in vivo ללא תיוג חיסוני. בפרוטוקול של Liu, Zhu et al.5, המחברים מספקים פרוטוקול מפורט להדמיה של רוב סוגי האברונים התת-תאיים בשמרים הניצנים החיים, Saccharomyces cerevisiae5. למתחילים העובדים עם שמרים מתחילים, פרוטוקול זה מועיל ללמוד כיצד לזהות לוקליזציה תת-תאית של חלבון ולעקוב אחר אברונים מעניינים באמצעות הדמיית זמן-lapse. מגבלה של הפרוטוקול היא שרוב המבנים המשמשים בפרוטוקול אינם יכולים לשמש לתיוג אברונים במינים אחרים. עבור סוגים שונים של תאים אוקריוטיים, עדיין יהיה צורך לאמת דפוסים ספציפיים לאברונים של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי צביעה חיסונית של נוגדנים.
בדיקת ספיגת נוגדנים פותחה לראשונה עבור תיוג חי ספציפי של איתות Notch/Delta אנדוזומי במבשרי איברי החישה של Drosophila notum6. בשל האופי הרגיש למינון של איתות Notch/Delta, ביטוי מבנה מדווח בתוך תאים אינו מתאים להמחשת איתות Notch/Delta in vivo, מכיוון שעותק נוסף של הגן המותך על ידי המדווח יפריע לאיתות הרגיל, ובתורו, לגורל התא. בפרוטוקול של Zhao ו-Guo7, המחברים מיישמים את בדיקת ספיגת הנוגדנים להדמיית סחר אנדוזומי Notch/Delta באבות הגליה הרדיאלית של מוח דג הזברההמתפתח 7. בפרוטוקול, לאחר הזרקת נוגדן מצומד נגד DeltaD-Atto647N בדיוק לחדר המוח האחורי העוברי של 24 hpf (שעות לאחר ההפריה), כל תהליך הסחר האנדוזומי נרשם באמצעות נוגדן אנטי-DeltaD-Atto647N המופנם לאורך המיטוזה של אבות גליה רדיאליים. במחקר נמצא כי בדיקת ספיגת הנוגדנים לא הפריעה לאיתות Notch/Delta. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להמחיש איתות אחר של קולטני ליגנד ממברנה, בהינתן שקיים נוגדן לתחום החוץ-תאי של החלבון המבוקש.
ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופ הרחבה (ExM), הכוללות הרחבה פיזית של הדגימה בתוך הידרוג'ל מתנפח, אפשרו להשתמש במיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים להדמיה ברזולוציה גבוהה. מאז המצאתו, ExM נבדק עם סוגים רבים ושונים של דגימות ביולוגיות8. אחד האתגרים העיקריים של ExM הוא אובדן האות הפלואורסצנטי במהלך שלבי הפילמור והעיכול. ה-ExM לשימור תוויות שפותח לאחרונה פתר את הבעיה עם עוגנים תלת-פונקציונליים9. בפרוטוקול של Park et al.10, המחברים מתארים כיצד לבצע ExM לשימור תוויות (LR-ExM) עם קבוצה של עוגנים תלת-פונקציונליים10. הפרוטוקול משפר את הדמיית מיקרוסקופ ההרחבה לא רק על ידי מניעת אובדן אותות אלא גם על ידי קידום תיוג ביעילות גבוהה עם תגי SNAP או CLIP. במחקרם, המחברים הדגימו בהצלחה LR-ExM רב-צבעוני עבור מגוון מבנים תת-תאיים והשיגו רזולוציה חד-מולקולרית בשילוב LR-ExM עם מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ברזולוציה גבוהה (STORM).
עם ההתפתחות המהירה של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה והופעתן של טכניקות תיוג פלואורסצנטיות חדשניות, אנו יכולים לצפות לשיפורים נוספים בשיטות ובפרוטוקולים להדמיית אברונים תוך-תאיים ברזולוציה חסרת תקדים. מאמצים אלה צפויים להביא לפריצות דרך חדשות בהבנת הדינמיקה והתפקודים של אברונים תוך-תאיים.