מאמר שיטה

דיסקציה של עכברים במערכת העצבים המרכזית וההיקפית

DOI:

10.3791/64974

⸱

24 בפברואר 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Functional Genomics, Université de Sherbrooke, 2Department of Dermatology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Department of Pathology, Université de Sherbrooke, 4Centre de Recherche du Centre Hospitalier de Universitaire de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 5Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 6UTSW Comprehensive Neurofibromatosis Clinic, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 7Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשלמת דיסקציה של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של עכברים. הרקמות המנותחות מנותחות עוד יותר ביישומים במורד הזרם, כגון צילום תמונות גסות או היסטולוגיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של בעלי חיים מייצגים את סוס העבודה של תחום מדעי המוח. למרות זאת, כיום, עדיין אין פרוטוקול שלב אחר שלב לניתוח מערכת עצבים שלמה של מכרסמים, וגם אין סכימה שלמה המייצגת אותה הזמינה באופן חופשי. קיימות רק שיטות לקצירת המוח, חוט השדרה, גנגליון שורש גבי ספציפי והעצב הסיאטי (בנפרד). כאן, אנו מספקים תמונות מפורטות וסכימה של מערכת העצבים של העכברים המרכזית וההיקפית. חשוב מכך, אנו מתארים הליך חזק לביצוע הנתיחה שלו. השלב שלפני הדיסקציה של 30 דקות מאפשר לבודד את מערכת העצבים השלמה בתוך החוליה עם שרירים נקיים מקרביים ועור. דיסקציה של 2-4 שעות עוקבת אחריו תחת מיקרוסקופ מיקרו-דיסקציה כדי לחשוף את חוט השדרה ועצבי בית החזה, ולבסוף לקלף את כל מערכת העצבים המרכזית וההיקפית מהפגר. פרוטוקול זה מייצג צעד משמעותי קדימה בחקר האנטומיה והפתופיזיולוגיה של מערכת העצבים ברחבי העולם. לדוגמה, ניתן לעבד עוד יותר את גנגליוני השורש הגבי המנותחים ממודל עכברים מסוג נוירופיברומטוזיס מסוג I לצורך היסטולוגיה כדי לחשוף שינויים בהתקדמות הגידול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד את מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של העכבר בחתיכה אחת. כיום אין פרוטוקול לניתוח כל מערכת העצבים של מכרסם כדי לחקור אותו ברמה גלובלית. מדעני מוח משתמשים בדרך כלל בעצב הסיאטי כתחליף לכל עצב היקפי1, ובגנגליונים L3 עד L52 כתחליף לכל גנגליון. באמצעות שיטות אלה, לא ניתן להסיק אם התוצאות ספציפיות לעצב/גנגליון המסוים. מכיוון שידוע שלפחות חלק מהפתולוגיות העצביות אינן משפיעות על כל העצבים והגנגליונים באותה מידה 3,4,5, יש לפתח טכניקה שתאפשר בידוד של מערכת העצבים השלמה של המכרסמים כדי לחקור אותה ברחבי העולם.

במהלך השנים פיתחנו ושכללנו שיטה לניתוח מערכת העצבים המרכזית וההיקפית השלמה של עכברים. השלב הראשון הוא בעצם דיסקציה גסה של העכברים כהכנה לשלבי המיקרו-דיסקציה תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. בשלבים 2 עד 4, חוט השדרה ועצבי בית החזה נחשפים, המוח מנותח וכל חוט השדרה והעצבים ההיקפיים מתקלפים מהפגר.

שיטה זו עוצמתית כאשר היא משולבת עם הדמיה או היסטולוגיה כדי לתעד כל שינוי מקרוסקופי או מיקרוסקופי 6,7,8,9. מדעני מוח המעוניינים לסקור שינויים גלובליים או לערוך ניסויים שאינם מונעי השערות צריכים להשתמש בשיטה זו כדי לסקור את מערכת העצבים העולמית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, מוסד מוסמך של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנה למיקרו-דיסקציה (טרום דיסקציה)

  1. בצע הרדמה עם 5% איזופלורן, ולאחר מכן המתת חסד עם 2% איזופלורן ו-10 psi של CO2 עד שאין סימנים חיוניים.
    הערה: אין לבצע פריקת צוואר הרחם, מכיוון שהדבר פוגע בחוט השדרה ובגנגליונים הצוואריים.
  2. הנח את העכבר המומת עם הפנים כלפי מעלה (מבט קדמי) על משטח חיתוך, ורסס את הפרווה ב-70% אתנול.
  3. לאחר מכן, הצמד את הגפיים העליונות והתחתונות, באמצעות ארבעה סיכות בקוטר קטן כדי להחזיק את העכבר במקומו במהלך הדיסקציה.
  4. בעזרת מספריים כירורגיים חותכים את העור מהבטן התחתונה לגרון.
  5. מקלפים את העור כדי לחשוף את האיברים הפנימיים, ומשתמשים בסיכות נוספות כדי לשמור על העור מכל צד תוך חשיפת חלל הבטן.
  6. חתכו את כלוב בית החזה כדי לחשוף את הלב והריאות.
  7. בעזרת זוג מלקחיים אנטומיים סטנדרטיים, אחזו בוושט ובקנה הנשימה, וחתכו ממש מעל המלקחיים.
  8. לאחר מכן, התחל לקלף את כל האיברים הפנימיים בגישה גולגולתית לזנב. לשם כך, חתוך את הסרעפת לאורך עמוד השדרה כדי להסיר את כל האיברים הפנימיים בחתיכה אחת.
  9. שחרר את העכבר ושטוף דם עכבר עודף מחלל הבטן בכיור.
  10. הנח את העכבר עם הפנים כלפי מטה (אחורי view). הצמד את הגפיים העליונות והתחתונות, באמצעות ארבעה סיכות כדי להחזיק את העכבר במקומו במהלך הדיסקציה.
  11. בעזרת מספריים כירורגיים מקלפים את העור מהראש לגפיים האחוריות.
  12. חשוף את העצב הסיאטי השמאלי (הגפה התחתונה).
    1. חותכים את השרירים פתוחים בחלק התחתון של הגפה התחתונה השמאלית.
    2. אתר וחשוף את העצב הסיאטי על ידי הסרת השריר סביבו.
    3. חתכו בזהירות את העצב הסיאטי בהסתעפות העצב הסוראלי, הטיביאלי והפרונאלי, וחסכו את כלי הדם.
    4. המשיכו לבודד את העצב הסיאטי באמצעות מלקחיים אנטומיים סטנדרטיים ומספריים עדינים במיוחד של בון, עד שהוא הופך מקביל לעמוד השדרה ומשאיר עצב חופשי של כ -2 ס"מ.
    5. הכנס את המספריים הכירורגיים במקביל לחוט השדרה, וחתוך את הירך.
    6. נקע את הירך על ידי פירוק עצם העצה ועצם הירך בעזרת אצבעות.
      הערה: במהלך תהליך זה, נדרש לעצור לעתים קרובות כדי למשוך בעדינות את העצב הסיאטי באמצעות מלקחיים כדי למנוע הפרעה.
    7. בסוף, קרעו בעדינות את הגפה האחורית מפגר העכבר, והשאירו עצב סיאטי באורך של כ -4 ס"מ.
      הערה: במהלך תהליך זה, אתר את עצב L2 והקניט אותו מהגפה האחורית כדי למנוע נזק ל-L2. חזור על שלב 1.12 עבור צד ימין.
  13. לחשוף את העצבים הברכיאליים (הגפיים העליונות).
    1. תפעל את פגר העכבר בידיים, ולא על משטח ישר (כרית דיסקציה).
    2. אתר את מקלעת הזרוע השמאלית על ידי התגרות בשומן ובשרירים בבית השחי השמאלי.
    3. לאחר האיתור, חותכים את ההסתעפויות העיקריות של מקלעת הזרוע (רדיאלית, בית השחי, סופראסקפולרית) ואת השלכות המשנה שלהן סביב האולנה בעזרת מספריים בון עדינים במיוחד, ומשאירים עצבים חופשיים של כ -1.5 ס"מ. מקלפים בעדינות את המקלעת מהגפה השמאלית העליונה.
    4. נקע את הגפה השמאלית העליונה; ודא שהוא נטול עצבים. חזור על שלב 1.13 עבור הצד הימני.
  14. חשפו את המוח.
    1. כעת, מקם את העכבר עם הפנים כלפי מעלה (מבט קדמי)
    2. הכניסו להב אחד של המספריים העדינים במיוחד של בון לפה, וחתכו את הלסת התחתונה דרך הגרון.
    3. הסר את הלסת התחתונה על ידי חיתוך נוסף מהלחיים לגרון.
    4. לאחר מכן, חותכים את עצם הגולגולת העוברת מאוזן אחת לשנייה.
      הערה: היזהר להימנע מלהיכנס עמוק מדי ולפגוע במוח.
    5. חותכים ומסירים את החך ועצמות האף כדי לפתוח את הגולגולת.
    6. חותכים את חוליית C1 בבסיס הגולגולת, משחררים את המוח הקטן ואת תחילת חוט השדרה.
    7. לבסוף, חתכו את הגולגולת לרוחב עד העין, והסירו את חלקי הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
      הערה: שמור את המוח בחלל שלו עד שהעצבים מתקלפים.
  15. הסר כל שומן או שרירים מיותרים מהפגר. מניחים את הפגר בפורמלין 10% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטיפות קצרות של 1x מי מלח עם פוספט (PBS) עד שאין יותר ריח מקבע, והמשיכו לשלב הבא.
    הערה: אם מערכת העצבים מנותחת בשבועיים הקרובים, אחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-PBS. אחרת, אחסן אותו בפורמלין 10% ללא הגבלת זמן. השתמש תמיד במכסה מנוע כימי בעת מניפולציה של פורמלין.

2. חשיפה לחוט השדרה

  1. כדי לחשוף את חוט השדרה, השתמש בגישה גולגולת לזנב. כדי להסיר כל חוליה ושכבת השריר שלה מעל, חתכו בעמדות השעה עשר ושתיים בצד הגחון, בעזרת מספריים קפיציים של ואנאס. שבב את החוליה באמצעות מיני מלקחיים של דומונט. המשך בתהליך זה דרך חוליות צוואר הרחם ובית החזה.
  2. עבור החלק המותני, חותכים את התהליך הרוחבי מכל צד של החוליה. לאחר מכן, חתכו במצבים של שתיים ועשר על ידי החדרת להב של זוג מספריים קפיציים של Vannas לתעלת החוליות. הסר את הרקמות, תוך שימת לב לעצבים שלעיתים דבוקים לעצמות.
  3. המשך באופן דומה עבור החלק הזנבי.

3. חשיפה לעצב בית החזה

  1. שים את הפגר מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה כדי לדמיין את הצד הקדמי.
  2. בעזרת מספריים קפיציים של Vannas, חותכים לאורך כל צלע (מעצם החזה ועד הגפיים התחתונות) כדי לחשוף את העצבים ההיקפיים.
  3. לאחר מכן, חותכים את החוליה משני צידי הגנגליון (לרוחב) כדי לחשוף את הגנגליון.

4. עצב היקפי מתקלף

  1. כדי לקלף את חוט השדרה ולעקור עוד יותר את העצבים ההיקפיים, השתמש במלקחיים המיני של דומונט כדי לגלגל בעדינות את חוט השדרה ולשלוף את העצבים בזה אחר זה, החל מהחלק הזנבי של חוט השדרה.
    הערה: לפני הקילוף, ניתן לבצע קיבוע נוסף בפורמלין 10% למשך 15 דקות ב-RT, ולאחר מכן שטיפות קצרות של 1x PBS עד שאין יותר ריח מקבע, כפי שבוצע בשלב 1.15.
  2. עבור החלק החזי, משוך את העצב בזווית של 90 מעלות (בניצב לחוט השדרה).
  3. עבור מקלעת הזרוע, חותכים את החוליה ליד העצב, כדי לפנות מקום לעצב.
    הערה: לא ניתן לעבור את מקלעת הזרוע מתחת לחוליה, כמו באזור בית החזה.
  4. הסר את עודפי השרירים כדי לנקות את העצבים.
  5. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים בסך הכל, או ללא הגבלת זמן בפורמלין 10% ב-RT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכרסמים היו חיוניים להבנתנו את הביולוגיה והפתופיזיולוגיה של מערכת העצבים10. באופן מעניין, אף שיטה אינה מציגה את הדיסקציה המלאה של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית של מכרסם כדי להעריך את האנטומיה והשונות הפתולוגית במודל בזמן אמת 1,2,11. איור 1 מציג סקירה כללית של שלב 1 עד שלב 4 (ההכנה למיקרו-דיסקציה, חשיפה לחוט השדרה, חשיפה לעצב בית החזה וקילוף עצב היקפי). בשלב 1, כל הקרביים מוסר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי למנוע את התייבשות השרירים והעצבים, יש להשרות את הפגר ב- PBS כל 10 דקות. בעת פריקת הגפיים התחתונות (שלב 1.12.6), חשוב תמיד לראות את מקלעת העצב הסיאטית ו-L2 באופק כדי למנוע נזק/קריעה. כאשר מנתחים את המוח (שלב 1.14.4), זה קריטי להימנע מלהיכנס עמוק מדי כדי לא לפגוע במוח. כאשר מנתחים את גנגליוני השורש הגבי והעצבים ההיקפיים בכלל, קריטי להשתמש במיני מלקחיים איכותיים (לא פגומים) של Dumont כדי למנוע פגיעה במבני העצבים.

במקום שלב קיבוע פורמלין של 15 דקות 10%, זלוף פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא הצהירו על ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JPB הוא חוקר FRSQ J1 וזוכה פרס המחקר לחוקרים מוקדמים ממשרד ההגנה האמריקאי. LQL מחזיקה בפרס קריירה למדעני רפואה מקרן Burroughs Wellcome ופרופסור לדרמטולוגיה ע"ש תומאס ל. שילדס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Dumont מיני מלקחייםכלים מדעיים עדינים#11200-10
מספריים נוספים של בוןכלים מדעיים עדינים#14084-08
פורמלין 10%פישר מדעי#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
מלקחיים אנטומיים סטנדרטייםכלים מדעיים עדינים#91100-12
מספריים כירורגייםכלי מדע עדינים#140001-12
מספריים קפיצים של Vannasקנט סיינטיפיק#INS600124

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים