מאמר שיטה

גישות מבוססות ספקטרומטריית מסה לניתוח מבנה חלבון מסדר גבוה

647 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64979

⸱

3 במרץ 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

Espino, J. A., Jones, L. M. טביעת רגל של חלבון רדיקלי הידרוקסיל in vivo לחקר אינטראקציות חלבון ב- Caenorhabditis elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (158), e60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. אפיון חלבונים תאיים עם חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים בתוך התא. כתב העת לניסויים חזותיים. (157), e60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. גישות ספקטרומטריות מסה לחקר מבנה החלבון ואינטראקציות באבקות ליופיליזציה. כתב העת לניסויים חזותיים. (98), e52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דאוטריום (HDX-MS) לחקירת אנזימים ביוסינתטיים של פפטידים. כתב העת לניסויים חזותיים. (159), e61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. תיוג קוולנטי עם דיאתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה. כתב העת לניסויים חזותיים. (172), e61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L.M. חממת פלטפורמה עם שלב XY נע: פלטפורמה חדשה ליישום חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים בתוך התא. כתב העת לניסויים חזותיים. (171), e62153 (2021).

Haupt, C. et al. שילוב של קישור צולב כימי וספקטרומטריית מסה של קומפלקסים חלבונים שלמים כדי לחקור את הארכיטקטורה של מכלולי חלבון מרובי תת-יחידות. כתב העת לניסויים חזותיים. (129), e56747 (2017).

Lento, C. et al. ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דאוטריום ליינון אלקטרוספריי שנפתרה בזמן לחקר מבנה החלבון והדינמיקה. כתב העת לניסויים חזותיים. (122), e55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. טביעת רגל רדיקלית של חלבון הידרוקסיל ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים. כתב העת לניסויים חזותיים. (172), e61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. מאפשר פיצוי בזמן אמת בחמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים. כתב העת לניסויים חזותיים. (163), e61580 (2020).

Chaihu, L. et al. חילופי מימן/דאוטריום מבוססי אלקטרופורזה נימית לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. כתב העת לניסויים חזותיים. (172), e62672 (2021).

מאמר מערכת

מבנה מסדר גבוה יותר (HOS) הוא היבט חשוב באפיון חלבון מכיוון שהוא קשור קשר הדוק לתפקוד החלבון. ספקטרומטריית מסה (MS) היא אחת משיטות המפתח להערכת חלבון HOS1. למרות שגישות מבוססות MS אינן מסוגלות לפתור את מבנה החלבון ברזולוציה אטומית, יש להן את היתרונות של רזולוציה מרחבית בינונית עד גבוהה, ספציפיות גבוהה, דרישות כמות דגימה נמוכה, תפוקה גבוהה ויכולות פרוטאומיקה.

גישות טביעת רגל חלבון מבוססות MS מעריכות את החלבון HOS על ידי ניתוח פני השטח הנגישים לממס של החלבון, והן בדרך כלל משולבות עם גישות תיוג כימיות שונות. תיוג הפיך, כגון על ידי חילופי מימן-דאוטריום (HDX), מכוון למימן אמיד עמוד השדרה בחלבון 1,2. תיוג בלתי הפיך משתמש בכימיקלים המכוונים לשאריות חומצות אמינו ספציפיות3 או ברדיקלים המתייגים מגוון שאריות שונות במהירות תגובה גבוהה יותר1. קישור צולב כימי הוא גם חלק מקטגוריית התיוג הבלתי הפיך, אך התכונה הדו-ערכית שלו מאפשרת קביעת אילוצים מרחביים בין שני אתרים צולבים, מה שמציע תובנות טופולוגיות ייחודיות 4,5. ניתן לשלב את כל הגישות הללו ליצירת "ארגז כלים", מה שהופך את הטרשת הנפוצה לכלי רב ערך להבהרת חלבון HOS.

ארגנו את אוסף השיטות הזה כדי להציג את ההתקדמות האחרונה בתחום ניתוח HOS של חלבון מבוסס טרשת נפוצה. קבוצת המאמרים הראשונה מציגה גישות מבוססות HDX. חביבי ות'יבודו6 מתארים גישה קלאסית יחסית של HDX-MS מלמטה למעלה. עם חילופי מימן-דאוטריום (H/D) בתמיסה בזמני חילופין מרובים ואחריהם עיכול פפסין על העמודה, ניתן לקבוע את רמת ספיגת הדאוטריום ברמת הפפטיד. בעת ביצוע ניסויים דיפרנציאליים (כלומר, מצבים קשורים לעומת מצבים לא קשורים), פפטידים המראים רמות ספיגת דאוטריום מוגברות או מופחתות מייצגים אזורים שחווים שינויים ב-HOS. המחברים משתמשים בסינתזה של לנתיפפטיד כדי להדגים יפה את זרימת העבודה של HDX-MS.

מלבד הגישה מלמטה למעלה, HDX-MS יכול להתבצע גם בצורה מלמעלה למטה, מה שמאפשר לאנליסטים ליישם אסטרטגיות הפרדה שונות ברמת החלבון השלם. Chaihu et al.7 משתמשים באלקטרופורזה נימית כדי להפריד בין מצבי חלבון או פרוטאופורמים שונים המתקיימים יחד בתמיסה. חלבונים עוברים את חילופי ה-H/D במהלך האלקטרופורזה תוך כדי נדידה בנימים בתמיסת האלקטרוליטים ברקע ה-deuterate, ולאחר מכן ניתוח MS מלמעלה למטה ופיצול פאזות גז כדי להעריך את רמות ספיגת הדאוטריום הן ברמה הגלובלית והן ברמת השבר. לבסוף, ישנן גם שתי שיטות נוספות באוסף זה המדגישות שיטות שונות של חילופי H/D, כלומר החלפה לכוח ליופילי8 והחלפה לאחר יינון אלקטרו-ספריי9.

קבוצת המאמרים השנייה עוסקת בשיטת התיוג הבלתי הפיכה. ביניהם, חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) משתמש ברדיקלים כמיני תיוג כדי לסמן את פני החלבון10,11. בפועל, מי חמצן עוברים פוטו-אקטיבציה באמצעות לייזר כדי לייצר רדיקלים הידרוקסיליים, המשמשים כמיני התיוג הפעילים. Misra ו-Sharp12 מציגים אסטרטגיה לדוסימטריה רדיקלית שבה אדנין משמש כמדווח על הריכוז הרדיקלי ומערכת דוזימטריה רדיקלית מקוונת משמשת לניטור תגובת האדנין. זה מאפשר פיצוי בזמן אמת של ריכוזי רדיקלי ההידרוקסיל, ובכך לנרמל את תנאי התגובה כדי לספק קריאה מדויקת. לאחר מכן, ויינברגר וצ'אה שיתפו פעולה עם קבוצת שארפ כדי לפתח פלטפורמת FPOP13 ללא לייזר. על ידי החלפת הלייזר המסוכן במקור אור פלזמה ושילובו עם דוזימטריה רדיקלית מקוונת ומערכת אוטומטית לאיסוף דגימות, הם מפתחים ומספקים פתרון משולב לחוקרים שצריכים לאפיין חלבון HOS.

שלושת המאמרים של קבוצתו של ג'ונס 14,15,16 בוחנים את האפשרות להביא את טביעת הרגל של FPOP וחלבונים למחקרי in vivo. היתרון של גישה זו הוא חסר תקדים, מכיוון שהיא מאפשרת לנתח את החלבון HOS בסביבה הטבעית. היישום המוצלח של טביעת רגל בתאים14 וב-Caenorhabditis elegans15 פותח אפשרויות חדשות למעקב אחר ה-HOS של הפרוטאום כולו במצבו המקורי, ובכך מאפשר הבנה עמוקה של החלבון HOS שלא ניתן להשיג באמצעות כלים אחרים.

שיטה חשובה נוספת לתיוג בלתי הפיך משתמשת בריאגנטים כימיים המכוונים לשאריות חומצות אמינו ספציפיות3. Kirsch et al.17 מדווחים על זרימת עבודה מנוצלת היטב של טביעת רגל חלבונית באמצעות תיוג קוולנטי. באמצעות דיאתילפירוקרבונט כמגיב התיוג, המחברים חוקרים את השינויים בחלבון HOS על ידי תיוג כמה סוגים של שאריות חומצות אמינו על פני החלבון. באמצעות ניסויים דיפרנציאליים ואחריהם עיכול פרוטאוליטי וניתוח טרשת נפוצה מלמטה למעלה, זרימת העבודה יחד מאפשרת זיהוי שינויים בנגישות הממסים, הקשורים ישירות לשינויים ב-HOS.

לבסוף, קישור צולב כימי הוא גישה חשובה נוספת המשתמשת בריאגנטים כימיים דו-ערכיים כדי לסמן חלבונים 4,5. קישורים צולבים כימיים משמשים לקישור צולב של שני חלבונים הקרובים זה לזה מרחבית ולעתים קרובות יוצרים קומפלקס מבני. Haupt et al.18 מדווחים על פרוטוקול שבו הם מדגימים את השימוש בקישורים צולבים כימיים להבנת הארכיטקטורה של קומפלקסים של חלבונים. ניתן לנתח את קומפלקס החלבון הצולב בשתי רמות שונות. באמצעות עיכול פרוטאוליטי ואחריו זיהוי טרשת נפוצה, הדיפפטידים הצולבים חושפים את אתרי האינטראקציה של קומפלקס החלבון. בעת ניתוח הדגימה הצולבת דרך מסה שלמה, המידע הסטויכיומטרי על יחידות המשנה של החלבון בתוך הקומפלקס זמין.

לסיכום, היינו עדים להתפתחות משמעותית בכלים מבוססי טרשת נפוצה לניתוח HOS של חלבונים במהלך שלושת העשורים האחרונים. טביעת רגל בלתי הפיכה והפיכה בשילוב עם ניתוח טרשת נפוצה משלימים זה את זה, ויחד הם תורמים באופן משמעותי לאפיון חלבון HOS. העבודות הכלולות באוסף שיטות זה מייצגות שיטות אמנות בתחום ניתוח HOS של חלבונים מבוססי טרשת נפוצה; מחקרים אלה הם משאב רב ערך עבור חוקרים המנסים להשתמש בגישות מבוססות טרשת נפוצה כדי לענות על שאלות קריטיות. מנקודת מבט רחבה יותר, שילוב נתוני טביעת רגל בתחזיות מבניות הוא קריטי לשבירת גבול הרזולוציה המרחבית בשיטות מבוססות MS. קיימות עבודות חלוציות הממחישות את ההיתכנות של גישה כזו19,20. בנוסף, שילוב פלטפורמה הוא גם קריטי, מכיוון שגישות אלה משלימות זו את זו ומספקות תובנות מנקודות מבט שונות21,22. השיטות המדווחות בקובץ זה מדגימות את כוחו של אינטגרציה כזו, ותהיה התפתחות מתמדת בכיוון זה. עם כל ההתקדמות הללו, הגישה המבוססת על טרשת נפוצה גדלה מעבר לקביעת המשקל המולקולרי, וצמיחה מתמשכת תיראה בתחום זה בעשורים הקרובים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

למחברים אין אישורים.

מקורות

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Protein InteractionsHydroxyl Radical FootprintingPhotochemical OxidationHydrogen-deuterium ExchangeCovalent LabelingProtein AnalysisElectrospray IonizationChemical Cross-linkingMulti-subunit AssembliesConformational Characterization
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.