$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
אינטראקציות ביומולקולריות הן שחקני מפתח בתהליכים ביולוגיים ולכן היבט חשוב מהותי במדעי החיים. טכניקות פלואורסצנטיות הפכו לחלק מהשיטות החזקות והמיושמות ביותר לחקירה והבנה של תהליכים אלה. גישות פלואורסצנטיות במבחנה מציעות פוטנציאל לזיהוי בזמן אמת של אינטראקציות מולקולריות חוץ-תאיות ותוך-תאיות, המהווה יתרון גדול על פני גישות אחרות. זה שימש למגוון אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-חומצת גרעין וחלבון-ממברנה, הממלאות תפקידים מכריעים בוויסות תהליכים תאיים.
אוסף זה נותן סקירה כללית של טכניקות ויישומים שונים מבוססי פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציות ביומולקולריות ומרחיב את הבנתנו את התהליכים התאיים.
רייזר ואחרים מתארים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לניתוח קינטיקה תאית מתאים בודדים באמצעות רכישה ועיבוד אוטומטי של תמונה (הדמיית תאים חיים על מערכי תאים בודדים [LISCA]). באמצעות טכניקה זו, מדווחים פלואורסצנטיים מספקים קריאה שנפתרה בזמן של תהליכים ביולוגיים עצמאיים שונים כגון ביטוי גנים של תא בודד לאחר טרנספקציה, תגובה תאית במפלי איתות, אירועים אפופטוטיים או התמיינות תאי גזע. המחברים מבצעים הדמיה במערכי תאים מבודדים באמצעות מיקרוסקופ סריקת זמן-lapse, מה שמוביל למאות מסלולי תאים בודדים ומספיק נתונים לניתוח סטטיסטי. עקבות זמן פלואורסצנטיות של תא בודד יעזרו לחוקרים להבין טוב יותר את מנגנוני העברת הגנים ולפתור הטרוגניות תאית - סימן היכר של מערכות ביולוגיות מורכבות המוכתבות בדרך כלל על ידי תנודות מהותיות.
Konate et al.2 מדווחים על שיטה ביופיזיקלית לאפיון האינטראקציה, ההפרעה ו/או החדירות של פפטידים הממברנים באינטראקציה. בפרוטוקול שלהם הם מתארים במדויק את השלבים השונים לניסוח וטיהור ליפוזומים ולאפיון דליפת פלואורסצנטיות. השיטה מיושמת עם פפטיד חודר תאים (CPP) הנקרא WRAP בשילוב עם RNA מפריע קטן (siRNA) או בשילוב עם פפטיד טיפולי חזק (iCAL36) ומושווה ל-CPP הידוע, חדירה. טכניקה זו מציגה יתרונות מרובים. זה מהיר ופשוט ליישום. זה מאפשר שליטה הדוקה בהרכב קרום השומנים כדי לחקות סוגים שונים של קרומי תאים. ניתן להתאים את הפלואורופורים בהתאם לפפטיד המעניין ולתכונות דליפת הממברנה שלו. לבסוף, המדגם יציב ביותר לאחר ההכנה. הרבגוניות של הטכניקה הופכת אותה לגישה שימושית לחקור שאלות ביולוגיות שונות הנוגעות לנזק לתאים או אספקת תרופות.
נוכחותו של פוספטידילסרין (PS) בקרומי תאי יונקים חשובה בתהליכי איתות שונים כגון אפופטוזיס של תאים או בגיוס חלבונים לתיקון הממברנה. ההעברה והשינויים בהתפלגות PS על פני השטח של ממברנות הפלזמה הם שאלת מפתח ש-Ikhlef et al.3 מתמודדים איתה במאמרם. הם מתארים פרוטוקול למדידה בזמן אמת הובלה והחלפה של שומנים PS ו-PI-4-P על ידי חלבון השמרים הרקומביננטי Osh6p. השיטה משתמשת בחיישנים פלואורסצנטיים כדי לזהות אם חלבון העברת שומנים (LTP) מחלץ או מעביר שומנים בממברנות מלאכותיות לאורך שיפוע בין שלפוחיות השומנים. פרוטוקול זה מאפשר עבודה עם ליפידים ללא תווית כדי לאפשר קשירה נכונה של שומנים ל-LTP. בנוסף, מושגת רזולוציית זמן טובה יותר בהשוואה לשיטות קונבנציונליות, כגון מבחנים מבוססי רדיואקטיביות או ספקטרומטריית מסה. שיטה זו תעזור לחוקרים להבין טוב יותר את מיצוי והחלפת השומנים בין אברונים וממברנות שונות.
העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) היא שיטה רבת עוצמה לחקר מערכות ביו-מולקולריות. ניתן ליישם טכניקה זו על מולקולות בודדות (למשל, smFRET) ומאפשרת מדידה של מרחקים מוחלטים בתוך ביומולקולות. Abdelhamid et al.4 מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב כיצד לבצע smfBox, מערך קונפוקלי שפותח לאחרונה המסוגל למדוד את יעילות ה-FRET בין שני צבעים על מולקולות בודדות המפוזרות בחופשיות. הם מראים כיצד ליישם ולהשתמש בטכניקת smFRET מהכנת הדגימה ועד להגדרת המכשיר, היישור, רכישת הנתונים והניתוח. יתר על כן, הם מתארים כיצד לקבוע את גורמי התיקון הנדרשים למדידות מרחק מדויקות הנגזרות מ-FRET. כאן, השיטה מיושמת על דופלקסים של DNA המפזרים באופן חופשי וניתן להרחיב אותה למגוון רחב של יישומים כגון חקר שינויים קונפורמטיביים של חלבון או אינטראקציות חלבון-DNA.
תהליכים ביולוגיים כרוכים באינטראקציות ביומולקולריות מגוונות ורבות מאוד המשאירות מקום רב לפיתוח בדיקות או חיישנים חדשים מבוססי פלואורסצנטיות. אוסף זה מציע לחוקרים סקירה כללית של החידושים וההתפתחויות בשיטות מבוססות פלואורסצנטיות. כל מאמר שופך אור על שיטה אחרת המבוססת על פלואורסצנטיות, ומדגיש עד כמה בדיקות פלואורסצנטיות הפכו חשובות ורב-תכליתיות. האוסף מתאר שיטות אלה ובכך מעודד שימוש נרחב בהן בקרב קבוצות ותחומי מחקר שונים.