$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
מבחינה היסטורית, מדענים הסתמכו במידה רבה על מחקרים בבעלי חיים כדי לקבוע אם מוצר רפואי (כלומר, תרופה או מכשיר רפואי) בטוח לפני שניסו אותו על בני אדם. בעוד שניסויים בבעלי חיים עדיין מוצדקים במצבים רבים, מציאת חלופות היא רצויה מאוד. עם ההתקדמות האחרונה במדע ובהנדסה, פיתוח חלופות לניסויים בבעלי חיים אפשרי מתמיד. התמקדות מחודשת בפיתוח שיטות חלופיות אנושיות במבחנה להערכת בטיחות לב מיוחסת לפחות בחלקה להתקדמות בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC). ניתן לייצר תאי לב אנושיים במעבדה באמצעות דגימת דם או עור פשוטה ממטופל, מה שמניב קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iPSC-CMs) המתאימים לבדיקות חזקות בתפוקה גבוהה. התקדמות בהנדסת רקמות תלת מימדית, טכנולוגיות מערך מיקרואלקטרודות, הדמיית תאים חיים וטכנולוגיות אחרות היו גם חיוניות לפיתוח הפרוטוקולים הכלולים באוסף זה.
הפרוטוקול של Gerges et al.1 מיישם שיטה אופטית לא פולשנית (MyoBLAZER) כדי להעריך שינויים בהתכווצות בקרדיומיוציטים חדריים ראשוניים אנושיים בוגרים. התאים הם בקצב חשמלי, וניתוח תמונה מודד את קיצור הסרקום על פני מספר תאים במקביל. שיטה זו יכולה לאסוף עקומות ריכוז-תגובה כל 30 דקות לכל תרכובת לכל מכשיר, ומספקת נתוני יחסי מבנה-פעילות. שיטה אופטית לא פולשנית זו מסייעת בשימור הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה של קרדיומיוציטים אנושיים בוגרים במהלך הקרנה בתפוקה גבוהה. בנוסף, השימוש בקרדיומיוציטים בוגרים אנושיים יכול לספק חלק תרגומי קריטי לחיזוי התכווצות.
המתודולוגיה של Lickiss et al.2 מציגה טכנולוגיית התכווצות ועכבה/פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP) היברידית, המוסיפה תכונות פרו-התבגרות משמעותיות לפלטפורמה סטנדרטית בתעשייה של 96 בארות על ידי שימוש במצע תרבית תאים רך, גמיש ומבוסס סיליקון. הגישה הוכיחה את עצמה כמוצלחת על ידי ביסוס מחדש של התגובה האינוטרופית החיובית הפיזיולוגית לאיזופרוטרנול ב-hiPSC-CMs בריאים הזמינים מסחרית, אשר נעדרת ביודעין בתרבית הסטנדרטית (מצע נוקשה) ללא צורך במערכת תלת מימד. המערכת ההיברידית מאפשרת מדידה ישירה של כוח ההתכווצות (mN/mm2), קצב פעימה, כמו גם צפיפות ושלמות התא החד-שכבתי. הוא גם מתמודד עם האתגרים של מערכת תלת מימד מסורתית (כלומר, תפוקה נמוכה, צרכי הדרכה ניכרים), ומפחית את הזמן והעלויות הדרושים להשלמת הבדיקה.
האוסף כולל גם עבודה של Feaster et al.3, המדגימים שיטה חוץ גופית, בעלת תפוקה גבוהה ולא פולשנית להערכת טיפול באפנון התכווצות לב (CCM) בקרדיומיוציטים דו-ממדיים של תאי גזע אנושיים המצופים על מזרן מטריג'ל גמיש, באמצעות מיקרוסקופיה מבוססת וידאו ללא בדיקה. המחברים מדגישים את ההשפעות החריפות של CCM על תכונות ההתכווצות של hiPSC-CMs בריאים וחולים. כלי זה מציע שיטה בעלות נמוכה להבנת הבטיחות או היעילות של CCM, ויכול להפחית את התלות במחקרים בבעלי חיים ולסייע בקבלת החלטות רגולטוריות של מכשירים רפואיים לאלקטרופיזיולוגיה של הלב.
הפרוטוקול המעודן של Schaefer et al.4 מתאר הרחבה חדשה למערכת מערך המיקרו-אלקטרודות הסטנדרטית (MEA) המתעדת בדרך כלל את פוטנציאל השדה החוץ-תאי ב-hiPSC-CMs, ומאפשרת הקלטות פוטנציאל פעולה תוך-תאיות על ידי פתיחת ממברנות התא עם פולסים של קרן לייזר ננו-שנייה. מכשיר זה כולל לא רק יתרונות MEA סטנדרטיים (כלומר, ניטור התפשטות אותות, ניסויים אקוטיים וכרוניים), אלא גם מאפשר תובנה לגבי צורת פוטנציאל פעולה תוך-תאית ללא שימוש בפולסים חזקים של שדה חשמלי לאלקטרופורציה של תאים.
הפרוטוקול של Berry et al.5 מתאר פלטפורמה חדשה המאפשרת ייצור ניתן לשחזור של רקמות שריר מהונדסות בתלת מימד (EMTs) למדידות כוח התכווצות ישירות. המכשיר יכול לזהות שינויים במיקרוניוטון בכוח ההתכווצות, ובכך להפוך אותו לכלי רב עוצמה לסינון תרכובות תלויות מינון. ניתן לרשום התכווצות ברקמת לב מבוססת hiPSC, כמו גם ברקמות שריר השלד, בעד 24 רקמות בו זמנית, וניתן לנתח את הנתונים לאורך שבועות או חודשים. לכן, נדרשות מיומנויות נוספות מינימליות או הכשרה לחוקרים.
לבסוף, הפרסום של Zhao et al.6 מתאר מערך של בדיקות פונקציונליות (פוטנציאל שדה חוץ-תאי, פוטנציאל פעולה, התכווצות וסידן) המותאמים לשימוש עם קרדיומיוציטים שניתן לייצר בבית על ידי מעבדות משתמשים. ניתן לעשות זאת באמצעות פרוטוקולי התמיינות ו-iPSCs שפורסמו בעבר הזמינים מהביובנק של מכון הלב וכלי הדם של אוניברסיטת סטנפורד (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), המספקים מגוון רחב של תאים "חולים" ותאי ביקורת. זוהי מערכת שלמה של שיטות להקלטות התכווצות הלב והאלקטרופיזיולוגיה העיקריות, כולל גישות סטנדרטיות (מהדק טלאי, מערכי מיקרואלקטרודות, בדיקות פלואורסצנטיות רגישות לסידן ומדידות התכווצות מבוססות וידאו).
לסיכום, בעוד שאוסף השיטות הנוכחי אינו מתיימר להיות שלם (וממשיך לגדול), זהו כבר סט מקיף יחסית של שיטות הממחישות אתגרים עכשוויים רבים בהתכווצות ורישומים אלקטרופיזיולוגיים בקרדיומיוציטים אנושיים. הוא כולל פרוטוקולים עבור קרדיומיוציטים אנושיים ראשוניים1, hiPSC-CMs זמינים מסחרית שמקורם בתורמים בריאים 2,3,4, כמו גם פרוטוקולים המותאמים לתאים הנושאים חתימה של מחלת לב מולדת 3,6. שיטות אלו משתרעות על פני תנאי תרבית תאים שונים, החל מתאים בודדים לניסויי מהדק טלאי6, ועד לחד-שכבות hiPSC-CM 2D קונבנציונליות על מצעים נוקשים 1,4, חד-שכבות קרדיומיוציטים דו-ממדיות על מצעים רכים וגמישים 2,3, ולבסוף, רקמות לב מהונדסות בתלת מימד5. השיטות הכלולות משתמשות בגישות שונות לרישום הפרמטרים הפיזיולוגיים הרלוונטיים ביותר של הלב, כגון התכווצות (נמדדת בעקיפין עם מבחנים מבוססי וידאו 1,3,6 או ישירות עם כוח התכווצות 2,5), פוטנציאל פעולה (בתא בודד באמצעות מהדק טלאי6, פוטנציאל שדה חוץ-תאי חלופי עם MEA 4,6או על ידי שימוש בגישה חדשה לנקב את התאים כדי להקליט הקלטות דמויות פוטנציאל פעולה עם מערכת MEA הסטנדרטית4), וארעי סידן (באמצעות בדיקות רגישות לסידן6)., יחד, שיטות אלה מספקות לא רק פרוטוקולים מפורטים שניתן לשחזר במעבדות אחרות, אלא גם ממחישות כמה מהאתגרים בשיטות לב אנושיות במבחנה, כגון: חוסר בשלות hiPSC-CM, במיוחד כאשר משתמשים בתרבית דו-ממדית סטנדרטית על מצע נוקשה; השפעות לא רצויות של בדיקות רגישות למתח פלואורסצנטי או סידן; תפוקה נמוכה של הקלטות פוטנציאל הפעולה הקונבנציונליות; קשיים בפירוש של רישומי משך פוטנציאל שדה סטנדרטיים; והיעדר בדיקות להערכת מכשירים רפואיים (למשל, לעומת תרופות). מעורר השראה לראות כמה מעבדות עובדות על שיפור השיטות הללו, מה שיוביל בהכרח להתאמה רחבה של שיטות אלה בעתיד.