כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים
במאמר זה
סיכום
תקציר
קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.
מבוא
הודג'קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו ובוצעו בהתאם להנחיות האתיות שאומצו על ידי המכללה הברזילאית לניסויים בבעלי חיים.
1. הכנת פתרונות
- הכנת פתרון פנימי
הערה: התמיסה הפנימית ממלאת את המיקרופיפטה המהדקה ובאה במגע עם פנים התא (ראו דוגמה באיור 2). הפתרונות הפנימיים עשויים להשתנות בהתאם לסוג הפעילות שיש למדוד33.- בחר את הפתרון הפנימי בהתחשב במטרה הניסיונית שלו ובסוג הרשומה המתאים. כדי לרשום את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, השתמש בתמיסה הפנימית המורכבת מ 120 mM K-gluconate, 1 mM NaCl, 5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לחקור את ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי (hGH) על הפעילות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים, ביצענו רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים בפרוסות מוח והערכנו אם הורמון זה גורם לשינויים חריפים בפעילות של תאי עצב מסוג AVPV/PeNקיספפטין ו-ARHקיספפטין. במחקר זה נעשה שימוש בנקבת Kiss1-Cre/GFP בוגרת (שלב הדיזטרוס) ובעכברים זכרים36. בעלי חיים שלמים בגונדה נבחרו לניסויים, שכן המאפיינים של נוירוני קיספפטין ההיפותלמיים שלהם עשויים להשתנות בהתאם לרמות סטרואידים מין
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם זיהוי מטרות פוטנציאליות לחומרים טיפוליים 11,39,40,41 . בתחום הרפואה, א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין להצהיר על ניגוד עניינים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של סאו פאולו [מספרי מענק FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ועל ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>תרכובות עבור aCSF, תמיסות פנימיות וחיתוך | |||
| ATP | סיגמא אולדריץ'/שונות | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/שונות | C7902 | |
| D-(+)-גלוקוז | סיגמא אולדריץ'/שונות | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/שונות | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/שונים | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/שונים | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma Aldrich/שונים | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/שונים | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/שונים | M9272 | |
| MgSO4 | סיגמא אולדריץ'/230391 | ||
| NaCl | סיגמא אולדריץ'/שונות | S5886 | |
| NaH2PO4 | סיגמא אולדריץ' / שונים | S5011 | |
| NaHCO<תת>3< / תת> | סיגמא אולדריץ' / שונים | S5761 | |
| חומצה חנקתית | סיגמא אולדריץ' / שונים | 225711 | זהירות |
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' / שונים | S1888 | |
| <חזק>ציוד< / חזק> | |||
| שולחן אוויר | TMC | 63-534 | |
| מגבר | התקנים מולקולריים | Multiclamp 700B | |
| מחשב | מגוון-DIGIDATA | ||
| 1440 מערכת רכישת נתונים ברעש נמוך | התקנים מולקולריים | DD1440 | |
| משאבה פריסטלטית דיגיטלית | Ismatec | ISM833C | |
| כלוב פאראדיי | TMC | 81-333-03 | |
| מצלמת הדמיה | Leica | DFC 365 FX | |
| מיקרומניפולטור | סאטר מכשירים | Roe-200 | |
| חולץ מיקרופיפטה | Narishige | PC-10 | |
| מיקרוסקופ | Leica | DM6000 FS | |
| אוסטאוטום | Bonther equipamentos & Tecnologia/שונים | 128 | |
| תא התאוששות | וורנר אינסטרומנטס / מכשירי הרווארד | - ניתן לייצר בתוך | |
| הבית תא הקלטה | וורנר אינסטרומנטס | 640277 | |
| מרית | פישר סיינטיפיק / שונים | FISH-14-375-10; דג-21-401-20 | |
| ויברטום | אמבט מים Leica | VT1000 S | |
| פישר סיינטיפיק / מגוון | איזוטמפ | ||
| <חזק>תוכנה ומערכות | |||
| AxoScope 10 תוכנה | התקנים מולקולריים-קומנדר | ||
| תוכנה LAS X מערכת שדה רחב | Leica-Image | קליטה וניתוח | |
| MultiClamp 700B | התקנים מולקולריים | MULTICLAMP 700B | Commander תוכנה |
| PCLAMP 10 תוכנה עבור WINDOWS | התקנים מולקולריים | Pclamp 10 אלקטרודה סטנדרטית | |
| <חזקה>כלים | |||
| Ag/AgCl, גלולה, 1.0 מ"מ | וורנר אינסטרומנטס | 64-1309 | |
| מלקחיים המוסטטיים מעוקלים | שונים-LOCTITE | ||
| /שונים | - | ||
| מספריים לעריפת ראשים | שונים-נייר | ||
| סינון | שונים-נימי | ||
| זכוכית (מיקרופיפטה) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| מספריים איריס | Bonther equipamentos & Tecnologia/שונים | 65-66 | |
| פיפטה מזכוכית פסטר | סיגמא אולדריץ'/מגוון | CLS7095B9-1000EA | |
| צלחת פטרי | שונות-צינורות | ||
| פוליאתילן | וורנר אינסטרומנטס | 64-0756 | |
| סכין גילוח לדיסקציה של המוח | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| סכין גילוח לוויברטום | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| מספריים | Bonther equipamentos & Tecnologia/different | 71-72, 48,49; | |
| פטמת סיליקון | מגוונת-עוגן | ||
| פרוסה | וורנר אינסטרומנטס | 64-0246 | |
| מסנני מזרק | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μ מ |
| פינצטה | Bonther equipamentos & Tecnologia/different | 131, 1518 |
מקורות
- Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
- Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
- Gandini, M. A., Sandoval, A., Feli....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
