הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

3.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64989

⸱

17 במרץ 2023

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.

תקציר

קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.

מבוא

הודג'קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרחב במחקר מדעי 6,9. המצאת טכניקת מהדק הטלאים, שהתרחשה בסוף שנות השבעים באמצעות מחקרים שיזמו ארווין נהר וברט סאקמן, אפשרה לחוקרים להקליט תעלות יונים בודדות ופוטנציאלים או זרמים של קרום תוך תאי כמעט בכל סוג של תא באמצעות אלקטרודה אחת בלבד 9,10,11,12. הקלטות מהדק טלאי יכולות להתבצע על מגוון תכשירי רקמות, כגון תאים בתרבית או פרוסות רקמה, במצב מהדק מתח (החזקת קרום התא במתח מוגדר המאפשר הקלטה, למשל, של זרמים תלויי מתח וזרמים סינפטיים) או במצב מהדק זרם (המאפשר הקלטה, למשל, של שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה המושרה על ידי זרמי יונים, פוטנציאלי פעולה, ותדירות פוטנציאל פוסט-סינפטי).

השימוש בטכניקת מהדק הטלאי איפשר מספר תגליות בולטות. ואכן, הממצאים הראשוניים על התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעינים הפריוונטריקולריים האנטרו-ונטרליים (AVPV/PeNKisspeptin), הידוע גם בשם האזור הפרי-חדרי הרוסטרלי של החדר השלישי (RP3V), וגרעין הארקואט של ההיפותלמוס (ARHkisspeptin)13,14,15 הם בעלי עניין מיוחד. בשנת 2010, Ducret et al. ביצעו את ההקלטות הראשונות של נוירונים AVPV/PeNKisspeptinבעכברים באמצעות כלי אלקטרופיזיולוגי אחר, טכניקת מהדק טלאי תאים רופפים. מחקרים אלה סיפקו תיאור חשמלי של נוירוניקיספטין AVPV/PeN והראו כי דפוסי הירי שלהם תלויים במחזור הייחום16. בשנת 2011, Qiu et al. השתמשו בטכניקת מהדק טלאי התא כולו כדי להדגים כי נוירוניקיספפטין ARH מבטאים זרמי קוצב לב אנדוגניים17. לאחר מכן, גוטש ועמיתיו הראו כי נוירוני קיספפטין מפגינים פעילות ספונטנית ומבטאים הן זרמי סידן מסוג H (קוצב לב) והן זרמי סידן מסוג T, דבר המצביע על כך שנוירוניקיספפטין ARH חולקים תכונות אלקטרופיזיולוגיות עם נוירוני קוצב אחרים של מערכת העצבים המרכזית18. בנוסף, הוכח כי נוירוניקיספפטין ARH מפגינים קצבי ירי דימורפיים מינית וכי נוירוניקיספטין AVPV/PeN מפגינים פוטנציאל קרום מנוחה בימודאלי (RMP) המושפע מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP (KATP)19,20. יתר על כן, נקבע כי סטרואידים גונדל משפיעים באופן חיובי על הפעילות החשמלית הספונטנית של נוירוני קיספפטין בעכברים 19,20,21. העבודות הראשונות החוקרות את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין מוזכרות 16,17,18,19,20. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקת מהדק טלאי של כל התא כדי להדגים אילו גורמים/נוירומודולטורים מספיקים כדי לווסת את הפעילות החשמלית של נוירוני קיספפטין (איור 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

בהתחשב בחשיבותה של טכניקה זו לחקר תאי עצב הדרושים להתרבות, בין סוגי תאים אחרים שאינם מכוסים כאן, מאמר זה מתאר את השלבים הבסיסיים לפיתוח טכניקת מהדק טלאי התא כולו, כגון הכנת התמיסות, ניתוח וחיתוך המוח, וביצוע אטימת קרום התא להקלטות. יתר על כן, נדונים נושאים רלוונטיים לגבי הטכניקה, כגון יתרונותיה, מגבלות טכניות ומשתנים חשובים שיש לשלוט בהם לביצוע ניסויי אופטימלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו ובוצעו בהתאם להנחיות האתיות שאומצו על ידי המכללה הברזילאית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת פתרונות

  1. הכנת פתרון פנימי
    הערה: התמיסה הפנימית ממלאת את המיקרופיפטה המהדקה ובאה במגע עם פנים התא (ראו דוגמה באיור 2). הפתרונות הפנימיים עשויים להשתנות בהתאם לסוג הפעילות שיש למדוד33.
    1. בחר את הפתרון הפנימי בהתחשב במטרה הניסיונית שלו ובסוג הרשומה המתאים. כדי לרשום את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, השתמש בתמיסה הפנימית המורכבת מ 120 mM K-gluconate, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl ו- 4 mM (Mg)-ATP. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, כפי שניתן בטבלה 1.
    2. השתמש מספיק מים deionized כדי להגיע 90% מהנפח הסופי של התמיסה. נפח זה יבטיח מספיק מקום כדי להתאים את ה- pH ואת האוסמולריות.
    3. לאחר הוספה וערבוב יסודי של כל המרכיבים, התאימו את ה-pH ל-7.2-7.3 עם 5 M KOH באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות סביב 275-280 mOsm (להתאים, אם יש צורך, למטה בלבד).
    4. הכינו את התמיסה הפנימית מראש ואחסנו בטמפרטורה של 8 מעלות צלזיוס. הוסף את ה- ATP ביום הניסוי. אחסנו את התמיסה הפנימית המכילה ATP בטמפרטורה של -20°C (1 מ"ל aliquots) למשך 3-4 חודשים.
  2. הכנת תמיסת חיתוך
    1. הכינו תמיסת חיתוך המכילה 238 mM סוכרוז, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.0 mM NaH 2 PO4, 10 mM גלוקוז, 1.0 mM CaCl 2 ו-5.0 mM MgCl2. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, כפי שמוצג בטבלה 2. הנפח המדויק של פתרון זה להיות מוכן יהיה תלוי בגודל של תא החיתוך.
    2. תוך ערבוב כל המלחים במים נטולי יונים, רוויים כל הזמן בקרבוגן (95% O 2 ו-5% CO2). חבר צינורות פוליאתילן (קוטר חיצוני של 1.57 מ"מ [OD] x קוטר פנימי של 1.14 מ"מ [ID]) לגליל קרבוגן כדי לספק קרבוגן לתמיסת החיתוך. החזק את הקצה הפתוח של הצינור בתוך הכד המכיל את תמיסת החיתוך.
    3. לאחר ערבוב כל המרכיבים היטב, להתאים את ה- pH ל 7.3 עם 10% חומצה חנקתית באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות 290-295 mOsm (להתאים, במידת הצורך, למטה בלבד). לאחר מכן, מצננים את התמיסה ל 0-2 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת פתרון aCSF להקלטות
    1. הכן תמיסת נוזל שדרה מוחי מלאכותי (aCSF) להקלטות המכילות 124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 1.2 mM MgSO4, 5 mM גלוקוז ו- 2.5 mM CaCl2. שקלו את כל המלחים לפי הנפח הסופי הרצוי, המופיע בטבלה 3.
    2. תוך ערבוב כל המלחים במים נטולי יונים, רווי כל הזמן בקרבוגן (95% O 2 ו-5% CO 2), כמתואר בשלב 1.2.2.
    3. לאחר הוספה וערבוב של כל המרכיבים, התאימו את ה-pH ל-7.3 (ניתן להשתמש ב-10% חומצה חנקתית) באמצעות מד pH. השתמש אוסמומטר כדי לבדוק את האוסמולריות, אשר צריך להיות 290-300 mOsm. לאחר מכן, לשפוך את aCSF בכוס ולשמור באמבט מים ב 30 ° C.

2. דיסקציה מוחית וחיתוך

הערה: מאחר שמבני מוח שונים עשויים לדרוש חיתוך במישורים שונים (פרוסות קורונליות, קשת או אופקיות), הגישה המדויקת להשגת הפרוסות תלויה באזור המעניין במוח. בדרך כלל, לחקור את התאים המבטאים Kiss1 בתאי AVPV/PeN ו-ARH (כאן נקובים כנוירוני קיספפטין AVPV/PeN ונוירוניקיספפטין ARH; איור 2A,B), פרוסות מוח קורונליות (200-300 מיקרומטר) מיוצרות בדרך כלל 17,19,20,21,34. תאי העצב AVPV/PeNKisspeptin ממוקמים במרחק של כ-0.5 עד -0.22 מ"מ מהברגמה, בעוד שתאי העצב מסוג ARHkisspeptin נמצאים במרחק של -1.22 עד -2.70 מ"מ. ניתן לקבוע את מיקום הגרעינים באמצעות אטלס מוח סטריאוטקסישל עכבר 35 או אטלס ייחוס המוח של עכבר אלן (http://mouse.brain-map.org/). במחקר זה נעשה שימוש בנקבת Kiss1-Cre/GFP בוגרת (שלב הדיזטרוס) ובעכברים זכרים36.

  1. הסרת מוח
    1. הכינו את אתר הדיסקציה ואת הכלים הדרושים לחילוץ המוח: מספריים לעריפת ראש, מספריים של קשתית, מספריים מעוקלים של Castroviejo, אוסטאוטום, פינצטה, מרית, נייר פילטר, צלחת פטרי, סכין גילוח ודבק ציאנואקרילט.
    2. לפני ביצוע הפרוסות, להכין את הספסל שבו הדיסקציה תבוצע, כמו כל ההליכים הבאים חייב להתבצע במהירות. ודא שיש לך גישה למכשיר חיתוך כגון ויברטום.
    3. הכינו תא הקלטה כדי לשמור על פרוסות המוח לפני חיתוך הרקמה. לרכוש תא הקלטה, מידות אמבטיה של 24 מ"מ x 15 מ"מ x 2 מ"מ (l x w x h), ממותג מסחרי (טבלה של חומרים) או לעשות אחד בבית.
      הערה: ניתן לייצר תא התאוששות פנימי באופן הבא: לחתוך צלחת 24 בארות כך תשע בארות זמינות. הדביקו מסך ניילון לבסיס תשע הבארות. עם שאר צלחת הבאר, לעשות בסיס כך החלק התחתון של הניילון הוא חופשי. הבסיס המותאם הזה יכול להיות ממוקם בתוך של 500 מ"ל שמכילה את ה-aCSF (איור משלים 1).
    4. לאחר הכנת הכל, להרדים את בעל החיים עם הרדמה בשאיפה באמצעות 4%-5% isoflurane. ההרדמה צריכה להיות בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה. זמן קצר לאחר שבעל החיים אינו נייד, בצעו בדיקות צביטת זנב וכפה כדי לוודא שבעל החיים מורדם עמוק.
    5. ערפו במהירות את ראשיהם של העכברים בזמן שהלב עדיין פעיל כדי להגביר את יכולת הקיום של התא. קצרו את המוח במהירות לאחר עריפת ראשכם.
    6. בעזרת מספריים כירורגיים, בצע חתך בעור בחלק העליון של גולגולת החיה, מהקאודל לרוסטרל, והסר את הקרקפת מראשה של החיה. לאחר מכן, לחתוך את הצלחת interparietal לאורך תפר sagittal עם מספריים הקשתית ולהסיר את עצם העורף. החליקו את האוסטאוטום מתחת לעצם הקודקוד ומשכו אותו החוצה בעדינות עד שהמוח נחשף.
    7. לאחר חשיפת המוח, הפוך את הראש, הורד בעדינות את המוח כדי לדמיין את העצב הטריגמינלי בכל צד, ואז חתוך את העצב הטריגמינלי באמצעות מספריים מעוקלים Castroviejo. לאחר הדמיה של ההיפותלמוס, זהה את עצב הראייה וחתך אותו בעדינות.
      הערה: היזהר בעת חיתוך עצב הראייה, שכן משיכה שלו תקרע את אזור ההיפותלמוס הסמוך המכיל את גרעין AVPV/PeN.
    8. לחתוך את החלק הקדמי ביותר של האונה הקדמית ולהסיר את המוח לחלוטין. מיד לטבול את המוח בתמיסת חיתוך עד רכישת פרוסות.
  2. חיתוך דגימות מוח
    1. הניחו את המוח על נייר פילטר (נתמך על צלחת פטרי) כדי לייבש את התמיסה העודפת. לאחר מכן, עם סכין גילוח חיתוך חד, לבצע חתך העטרה המפריד את גזע המוח עם המוח הקטן משאר הרקמה.
    2. לאחר מכן, הדביקו את החלק הקאודלי של המוח לבסיס הוויברטום ומלאו את החדר של מכשיר החיתוך בתמיסת החיתוך/aCSF מקוררת ל-0-2 מעלות צלזיוס. במהלך ההליך, ארזו קרח יבש סביב תא הוויברטומה כדי לשמור על תמיסת החיתוך קרה.
    3. הכנס את סכין הגילוח לוויברטום והגדר את פרמטרי החיתוך המתאימים של המכשיר: מהירות = 3, תדר = 9 והזנה = 250 מיקרומטר. השתמש בפיפטת העברה אקרילית (פיפטה הפוכה מזכוכית פסטר המחוברת לטיט סיליקון) כדי להעביר את הפרוסות לתא ההתאוששות (המתואר בשלב 2.1.3) במהלך הליך חיתוך הרקמות. המתן 60 דקות לשחזור רקמות לאחר רכישת הפרוסה.

3. איטום תאים להקלטה

  1. ודא שכל חלקי הציוד (מיקרוסקופ, מגבר, דיגיטציה, מיקרומניפולטור ואחרים) מופעלים לפני תחילת ההקלטה.
  2. ממלאים את תא ההקלטה, של מותג מסחרי (Table of Materials), המחובר למיקרוסקופ בתמיסת aCSF להקלטות. השתמש במשאבת זילוח כדי לנקב כל הזמן את aCSF בקצב של 2 מ"ל / דקה.
  3. העבירו פרוסת מוח מעניינת (אחת בכל פעם) לתא ההקלטה. השתמשו בפיפטת העברה אקרילית (פיפטה הפוכה מזכוכית פסטר המחוברת לטיט סיליקון) כדי להעביר את פרוסות ההיפותלמוס לתא. השתמשו בעוגן פרוסה (רשימת חומרים) כדי להחזיק את הפרוסה כך שהיא לא תזוז במהלך זילוח aCSF.
  4. מניחים פרוסה במרכז תא ההקלטה המחוברת למיקרוסקופ. מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגעה מושלמת של מיקרופיפטת ההקלטה.
  5. השתמש בעדשה אובייקטיבית בעוצמה נמוכה של מיקרוסקופ טבילה (10x או 20x) כדי לסייע במיקום הפרוסה ואיתור אזור העניין.
  6. לאחר איתור האזור המעניין, העבירו את עדשת האובייקט לעדשה בעלת עוצמה גבוהה (63x) והתמקדו ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור היעד כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני השטח של פרוסת המוח20.
  7. כאשר תא יעד אפשרי ממוקם, סמן אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור תבנית, כמו ריבוע, מעל אזור העניין. סימן המסך של המחשב מסייע להנחות את מיקום המיקרופיפטה המקליטה אל התא.
  8. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא היעד, להרים את המטרה ולהציג את micropipette הקלטה מלא הפתרון הפנימי. בעת הצבת המיקרופיפטה במחזיק האלקטרודה, ודא כי התמיסה הפנימית נמצאת במגע עם אלקטרודת הכסף.
    הערה: להכנת מיקרופיפטה, מיקום ומיקום על מחזיק האלקטרודות, עיין בסעיף33.
  9. הפעל לחץ חיובי לפני השקעת המיקרופיפטה בתמיסת aCSF, כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה, באמצעות מזרק מלא אוויר 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה באמצעות צינור פוליאתילן (≈130 ס"מ יותר); החל כמעט 100-200 μL של אוויר.
  10. באמצעות micromanipulator, להנחות את micropipette מתחת למרכז המטרה. הזיזו את הכפתורים במיקרומניפולטור כדי להנחות את המיקרופיפטה על ציר X-Y-Z לכיוון התא המעניין.
  11. כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה וקירב את הפוקוס, אך לא קרוב מדי, לפרוסה. להפחית את המהירות של micromanipulator ולאט לאט להוריד את micropipette למישור המיקוד. ודאו שקצה המיקרופיפטה אינו חודר בפתאומיות את הפרוסה, אלא יורד באיטיות עד שהוא נוגע בפני השטח של התא/אזור המטרה.
  12. יש להפעיל לחץ חיובי קל (≈100 μL) עם מזרק מלא אוויר 1-3 מ"ל המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי לפנות פסולת מנתיב הגישה.
  13. התמקדו בתא המטרה והזיזו לאט את המיקרומניפולטור על ציר X-Y-Z כדי לקרב את המיקרופיפטה לתא היעד. כאשר נוגעים במיקרופיפטה בתא, ניתן להבחין בגומה הנגרמת על-ידי הלחץ המופעל דרך קצה המיקרופיפטה (איור 2C).
  14. לאחר יצירת הגומה, בשל קרבתו של המיקרופיפטה לתא, יש להפעיל יניקה חלשה וקצרה דרך הפה (1-2 שניות) דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האיטום בין המיקרופיפטה לתא (חותם ג'יגה או ג'יגאזל >1 GΩ; איור 2D). כדי ליצור את החותם, השתמש במצב מהדק מתח בתוכנה. לפרטים על היווצרות החותם, עיין בסעיף33.
  15. אם האטם נשאר יציב (אטם הג'יגה-אוהם צריך להיות יציב מכנית וללא הפרעות רעש, הנקבעות על ידי תצפית במשך כדקה), כוונו את מתח האחיזה לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין. עבור נוירונים היפותלמיים kisspeptin, -50 mV מומלץ.
  16. הפעילו יניקה קצרה דרך הפה (לחץ שלילי) כשהמיקרופיפטה אטומה לתא כדי לשבור את קרום הפלזמה (איור 2E). תצורה נאותה של כל התא מושגת כאשר היניקה מבוצעת בכוח מספיק, כך שהקרום הקרוע אינו סותם את המיקרופיפטה ואינו מושך חלק ניכר מהקרום או אפילו את התא.
  17. בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. השתמש בתוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק ולחשב דיגיטלית את התנגדות הסידרה (SR) ואת הקיבול של התא כולו (wcc).
  18. במצב מהדק מתח, לאחר שבירת קרום התא, הפעל את אפשרות התא כולו ולחץ על הפקודה אוטומטי המפנה לכרטיסיית התא כולה. SR ו- wcc של התא יחושבו באופן אוטומטי ויוצגו באופן מיידי על ידי התוכנה. ניתן לבדוק פרמטרים אלה גם על ידי ביצוע בדיקת הממברנה עם המגבר המוזכר בטבלת החומרים33.
  19. הקפד לבדוק פרמטרים של כדאיות התא. עבור נוירוני קיספפטין, בדוק כי המדידות האלקטרופיזיולוגיות הן: SR < 25 mΩ, התנגדות קלט > 0.3 GΩ, ומחזיק ערך מוחלט נוכחי < 30 pA (תצפיות אישיות והפניה21). הערך הממוצע של wcc של נוירונים AVPV/PeNKisspeptin או ARHkisspeptin הוא ≈ 10-12 pF בעכברים שלמים גונאד20.
  20. עקוב אחר ה- SR וקיבול המצב היציב של התא במהלך הניסויים. ודא שה-SR אינו משתנה יותר מ-20% במהלך הקלטה ושקיבוליות הממברנה יציבה.
  21. בדוק את הגדרות התוכנה. צור פרוטוקולים ספציפיים להקלטות בהתאם לסוג הניסוי. כדי לרשום את פוטנציאל הממברנה במצב מהדק זרם, עם ציוד המוזכר בטבלת החומרים, מסננים במעבר נמוך את האותות האלקטרופיזיולוגיים ב- 2-4 קילוהרץ ומנתחים תוצאות במצב לא מקוון בתוכנה (עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע על תוכנה).
  22. ברגע שתצורת התא כולו מושגת כראוי, מדדו זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח (איור 2G). תיעדו שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה (RMP) ושינויים מושרים ב-RMP במצב מהדק זרם (איור 2H). שינויים ב-RMP, כגון דפולריזציה של קרום התא, יכולים להיגרם על-ידי מתן תרופה/מוליך עצבי ידוע לאמבטיה (המתואר בשלב 3.2), כפי שמודגם באיור 1.
    הערה: במצב מהדק זרם, ניתן להזריק זרם חיובי או שלילי כדי להחזיק את מתח הממברנה במתח הרצוי. עבור נוירוני קיספפטין, אנו בדרך כלל קובעים הזרקת זרם אפס (I = 0) כדי לרשום את השונות הספונטנית של פוטנציאל הממברנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לחקור את ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי (hGH) על הפעילות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים, ביצענו רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים בפרוסות מוח והערכנו אם הורמון זה גורם לשינויים חריפים בפעילות של תאי עצב מסוג AVPV/PeNקיספפטין ו-ARHקיספפטין. במחקר זה נעשה שימוש בנקבת Kiss1-Cre/GFP בוגרת (שלב הדיזטרוס) ובעכברים זכרים36. בעלי חיים שלמים בגונדה נבחרו לניסויים, שכן המאפיינים של נוירוני קיספפטין ההיפותלמיים שלהם עשויים להשתנות בהתאם לרמות סטרואידים מין

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כמו גם זיהוי מטרות פוטנציאליות לחומרים טיפוליים 11,39,40,41 . בתחום הרפואה, א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין להצהיר על ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של סאו פאולו [מספרי מענק FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ועל ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>תרכובות עבור aCSF, תמיסות פנימיות וחיתוך
ATPסיגמא אולדריץ'/שונותA9187
CaCl2Sigma Aldrich/שונותC7902
D-(+)-גלוקוזסיגמא אולדריץ'/שונותG7021
EGTASigma Aldrich/שונותO3777
HEPESSigma Aldrich/שוניםH3375
KCLSigma Aldrich/שוניםP5405
K-gluconateSigma Aldrich/שוניםG4500
KOHSigma Aldrich/שוניםP5958
MgCl2Sigma Aldrich/שוניםM9272
MgSO4 סיגמא אולדריץ'/230391
NaClסיגמא אולדריץ'/שונותS5886
NaH2PO4 סיגמא אולדריץ' / שוניםS5011
NaHCO<תת>3< / תת>סיגמא אולדריץ' / שוניםS5761
חומצה חנקתיתסיגמא אולדריץ' / שונים225711זהירות
סוכרוזסיגמא אולדריץ' / שוניםS1888
<חזק>ציוד< / חזק>
שולחן אווירTMC63-534
מגברהתקנים מולקולרייםMulticlamp 700B
מחשבמגוון-DIGIDATA
1440 מערכת רכישת נתונים ברעש נמוךהתקנים מולקולרייםDD1440
משאבה פריסטלטית דיגיטליתIsmatecISM833C 
כלוב פאראדייTMC81-333-03
מצלמת הדמיהLeicaDFC 365 FX
מיקרומניפולטורסאטר מכשיריםRoe-200
חולץ מיקרופיפטהNarishigePC-10
מיקרוסקופLeicaDM6000 FS
אוסטאוטוםBonther equipamentos & Tecnologia/שונים128
תא התאוששותוורנר אינסטרומנטס / מכשירי הרווארד- ניתן לייצר בתוך
הבית תא הקלטהוורנר אינסטרומנטס640277
מריתפישר סיינטיפיק / שוניםFISH-14-375-10; דג-21-401-20
ויברטום אמבט מים LeicaVT1000 S
 פישר סיינטיפיק / מגווןאיזוטמפ
<חזק>תוכנה ומערכות
AxoScope 10 תוכנההתקנים מולקולריים-קומנדר
תוכנה LAS X מערכת שדה רחבLeica-Imageקליטה וניתוח
MultiClamp 700Bהתקנים מולקולרייםMULTICLAMP 700BCommander תוכנה
PCLAMP 10 תוכנה עבור WINDOWSהתקנים מולקולרייםPclamp 10 אלקטרודה סטנדרטית
<חזקה>כלים
Ag/AgCl, גלולה, 1.0 מ"מוורנר אינסטרומנטס64-1309
מלקחיים המוסטטיים מעוקליםשונים-LOCTITE
/שונים-
מספריים לעריפת ראשיםשונים-נייר
סינוןשונים-נימי
זכוכית (מיקרופיפטה)World Precision Instruments, IncTW150F-4
מספריים איריסBonther equipamentos & Tecnologia/שונים65-66
פיפטה מזכוכית פסטר סיגמא אולדריץ'/מגווןCLS7095B9-1000EA
צלחת פטרישונות-צינורות
פוליאתילן וורנר אינסטרומנטס64-0756
סכין גילוח לדיסקציה של המוחTED PELLATEDP-121-1
סכין גילוח לוויברטוםTED PELLATEDP-121-9
מספרייםBonther equipamentos & Tecnologia/different71-72, 48,49;  
פטמת סיליקוןמגוונת-עוגן
פרוסה וורנר אינסטרומנטס64-0246
מסנני מזרקMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 μ מ
פינצטהBonther equipamentos & Tecnologia/different131, 1518
שונים דבק ציאנואקרילט

מקורות

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357(2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532(2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006(2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698(2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380(1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449(1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246(2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928(2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045(2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957(2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425(2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Voltage ClampCurrent ClampRTPCR
נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.