השתלת מערך אלקטרוקורטיקוגרפיה רכה תת-דוראלית (ECoG) ורישום קליפת המוח לטווח ארוך במיני-חזירים

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להערכת ביצועים ובטיחות ארוכת טווח של מערכי אלקטרודות תת-דוראליות רכות במודל מיני-חזיר, המתארת שיטות וכלי ניתוח, דימות תהודה מגנטית לאחר הניתוח, אלקטרופיזיולוגיה של קליפת המוח השמיעתית, תכונות אלקטרוכימיות של השתל ואימונוכימיה לאחר המוות.

Abstract

ליקויים נוירולוגיים ומחלות ניתן לאבחן או לטפל באמצעות מערכי אלקטרוקורטיקוגרפיה (ECoG). באפילפסיה עמידה לתרופות, אלה עוזרים לתחום את האזור האפילפטי לכריתה. ביישומים ארוכי טווח כגון ממשקי מוח-מחשב, אלקטרודות אפיקורטיקליות אלה משמשות לרישום כוונת התנועה של המוח, כדי לשלוט בגפיים הרובוטיות של חולים משותקים. עם זאת, רשתות האלקטרודות הנוקשות הנוכחיות אינן עונות על הצורך בהקלטות מוח ברזולוציה גבוהה ובביואינטגרציה ארוכת טווח. לאחרונה הוצעו מערכי אלקטרודות תואמים להשגת יציבות שתלים ארוכת טווח עם ביצועים גבוהים. עם זאת, יש צורך במחקרים פרה-קליניים עבור טכנולוגיות שתלים חדשות אלה כדי לאמת את הפונקציונליות ארוכת הטווח ואת פרופיל הבטיחות שלהם עבור תרגומם למטופלים אנושיים. בהקשר זה, מודלים חזיריים משמשים באופן שגרתי בפיתוח מכשירים רפואיים בשל גודל האיברים הגדולים שלהם וטיפול קל בבעלי חיים. עם זאת, רק יישומים מוחיים מעטים מתוארים בספרות, בעיקר בשל מגבלות ניתוח ושילוב של מערכת השתלים על חיה חיה.

כאן, אנו מדווחים על השיטה להשתלה לטווח ארוך (6 חודשים) והערכה של מערכי ECoG רכים במודל minipig. המחקר מציג לראשונה את מערכת השתלים, המורכבת ממערך אלקטרודות מיקרו-פבריקציה רכות המשולב עם יציאה פולימרית טרנסדרמלית תואמת דימות תהודה מגנטית (MRI) המאחסנת מחברי מכשור לרישומי אלקטרופיזיולוגיה. לאחר מכן, המחקר מתאר את ההליך הכירורגי, מהשתלה תת-דוראלית ועד התאוששות בעלי חיים. אנו מתמקדים בקליפת המוח השמיעתית כאזור מטרה לדוגמה שבו פוטנציאלים מעוררים מושרים על-ידי גירוי אקוסטי. לבסוף אנו מתארים רצף איסוף נתונים הכולל MRI של המוח כולו, אפיון אלקטרוכימי של שתלים, אלקטרופיזיולוגיה תוך ניתוחית ונעה בחופשיות, וצביעה אימונוהיסטוכימית של המוח שחולץ.

מודל זה יכול לשמש לחקר הבטיחות והתפקוד של עיצוב חדשני של תותבות קליפת המוח; מחקר פרה-קליני חובה כדי לדמיין תרגום לחולים אנושיים.

Introduction

ליקויים נוירולוגיים ומחלות ניתן לאבחן או לטפל באמצעות מערכי אלקטרוקורטיקוגרפיה (ECoG). רשתות אלקטרודות אלה מושתלות על פני השטח של המוח ומאפשרות הקלטה או גירוי של קליפת המוח האנושית¹. במקרה של אפילפסיה עמידה לתרופות, למשל, הם עוזרים לתחום את האזור האפילפטי לכריתה². ביישומים ארוכי טווח כגון ממשקי מוח-מחשב, אלקטרודות אפיקורטיקליות אלה משמשות לרישום כוונת התנועה של המוח, כדי לשלוט בגפיים הרובוטיות של חולים משותקים³. עם זאת, רשתות האלקטרודות הנוכחיות עשויות מגושי מתכת קשיחים המשובצים במצעים פולימריים קשיחים ואינן עונות על הצורך בהקלטות מוח ברזולוציה גבוהה ובביואינטגרציה תת-דוראלית ארוכת טווח (>30 יום). במקום זאת, הם יוצרים תגובות רקמה מקומיות המובילות לאנקפסולציה פיברוטית של המכשיר המושתל, מה שמוביל לביצועים גרועים יותר לאורך זמן. לאחרונה, מערכי אלקטרודות גמישים או נמתחים המשתמשים במצעים פולימריים דקים המיוצרים בטכניקות מיקרו-פבריקציה הוצעו כדי להשיג ביצועים גבוהים בהשתלות ארוכות טווח על ידי הגבלת תגובת הרקמה ^4,5. עם זאת, יש צורך במחקרים פרה-קליניים עבור טכנולוגיות השתלים החדשות הללו כדי לאמת את הפונקציונליות ארוכת הטווח ואת פרופיל הבטיחות שלהן, כך שניתן יהיה לדמיין תרגום למטופלים אנושיים. בהקשר זה, מודלים של מיני-חזירים וחזירים משמשים באופן שגרתי בפיתוח מכשירים בהקשרים רפואיים אחרים (למשל, מערכת הלב וכלי הדם, השלד או הקיבה) בשל גודל האיברים הגדולים שלהם והטיפול הקל בבעלי חיים ^6,7,8. עם זאת, רק יישומים מעטים המכוונים למוח לנוירופיזיולוגיה מתוארים בספרות, בעיקר בשל מגבלות הגישה הכירורגית ושילוב מערכת השתלים על חיה חיה 9,10,11,12. אלה לעתים קרובות אינם תואמים להשתלה כרונית בבעלי חיים חיים, כפי שהם דורשים, למשל, פיתוח של חומרה מורכבת כגון אלקטרוניקה משובצת מושתלת. בנוסף, הם אינם חוקרים את השפעת מערכת השתל על רקמת המטרה, שהיא קריטית להיבט הבטיחות הביולוגית במחקרים תרגומיים. המודל החזירי קרוב לאנטומיה האנושית מבחינת מבנה קליפת המוח, עצם הגולגולת ועובי העור¹³. יתר על כן, יכולתם ללמוד משימות התנהגותיות הופכת אותם למודל רב עוצמה לחקירת אסטרטגיות שיקום תפקודי או תפיסות חושיות¹⁴.

תרגום טכנולוגיות וטיפולים חדשים לבני אדם מחייב הערכת בטיחות ויעילות, כנדרש על ידי רשויות רפואיות מוסמכות. אלה מתוארים בדרך כלל במסמכים טכניים ונורמות¹⁵, אולם הם דורשים רק לעבור בדיקות אלה ואינם חוקרים את ההשפעה בפועל של השתלת המכשיר או איסוף נתונים שימושיים אחרים במקביל למחקר הבטיחות. למחקר בטיחות ביולוגית וביצועים מלא על המוח, אנו מציגים כאן אוסף אורכי ושיטתי של נתוני דימות מוח, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, הערכת תכונות אלקטרוכימיות של האלקטרודות המושתלות, והיסטולוגיה לאחר המוות במודל חזירי. כדי להשיג זאת, יש לקחת בחשבון מספר היבטים, על מנת ליצור מודל ניסיוני שלם: (i) גישה כירורגית זעיר פולשנית להשתלת מכשיר יחד עם יציאה טרנסדרמלית יציבה מכנית לחיבור לאלקטרודות, (ii) פרדיגמת הקלטה אלקטרופיזיולוגית חזקה המשמשת כפלט ביצועים עבור האלקטרודות המושתלות, הן בהרדמה והן בתנאים הנעים בחופשיות, (iii) דימות in vivo (טומוגרפיה ממוחשבת [CT] ו/או דימות תהודה מגנטית [MRI]) בנקודות זמן שונות כדי לעקוב אחר התפתחות המוח והשתל, כמו גם התאמת המערכת המושתלת לציוד ההדמיה, ו-(iv) צינור הכנת רקמות לחילוץ המוח לצורך ניתוח היסטולוגי.

כאן אנו מדווחים על השיטה להשתלה ארוכת טווח (6 חודשים) והערכה של מערכי ECoG רכים במודל המיני-חזיר (מוצג באופן סכמטי באיור 1). מערכי האלקטרודות הרכות הוצגו בדוחות הקודמים שלנו והם עשויים מממברנות סיליקון דקות המשובצות יריעות דקות זהב אלסטיות המשמשות כמסילות חשמל^16,17. המגע עם הרקמה נעשה באמצעות תערובת של ננו-חלקיקי פלטינה המשובצים במטריצת סיליקון לממשק אלקטרוכימי רך ויעיל לרקמת המוח¹⁸. השתלים מחוברים באמצעות כבל גמיש המנהור באופן תת-דוראלי דרך הגולגולת והעור ליציאה טרנסדרמלית המאחסנת את המחברים שעל ראש החיה. ניתן להתאים אישית את גודל וצורת השתל בהתאם למטרה ולצרכי המחקר. רצועות האלקטרודות הנוכחיות במחקר זה משקפות את גודלן האמיתי של הרצועות הקליניות. רצועות ורשתות תת-דוראליות זמינות קלינית שימשו כמשווים באותה גישה. היציאה הטרנסדרמלית הפולימרית תואמת MRI ממוקמת על הגולגולת באמצעות מערכת לוחית רגל המעגנת אותה היטב לגולגולת. כאן, אנו מתארים בפירוט את ההליך הכירורגי, החל השתלה subdural של שתי ההמיספרות להחלמה של החיה. אנו מתמקדים בקליפת המוח השמיעתית כאזור מטרה לדוגמה, שבו פוטנציאלים מעוררים מושרים על-ידי גירוי אקוסטי הן בתנאים מורדמים והן בתנאים הנעים בחופשיות. בנקודות זמן שונות, מוחו של בעל החיים עובר הדמיה ב-MRI (או CT עבור האלקטרודות הקליניות) תחת הרדמה והתכונות האלקטרוכימיות של האלקטרודות נמדדות. שיטות אפיון אלקטרודות משמשות כדי לעקוב אחר התפתחות השתל וממשק אלקטרודה-רקמה (ראה Schiavone et ^al.19 לפרטים נוספים). אלה כוללים כרונואמפרומטריה כדי לחקור את יכולות הגירוי של מגע האלקטרודה, ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית (EIS) שיכולה להצביע על התפתחות המרכיבים ההתנגדותיים והקיבוליים של האלקטרודה, ומדידות התנגדות בין-ערוצית כדי לבחון כשלים בקפסולציה הרמטית. לבסוף, פיתחנו צינור מיצוי רקמות כדי לחורר את המוח לאחר המתת חסד, לשתול אותו עם האלקטרודות במקום, לחתוך אותו, ולבצע ניתוח היסטולוגי באמצעות סמני דלקת שונים. בסך הכל, שיטה זו תאפשר מחקרים פרה-קליניים עם איסוף נתונים רב-מודאלי חזק לתרגום קליני עתידי של טכנולוגיות וטיפולים חדשים במוח.

Protocol

הליכים כירורגיים והתנהגותיים אושרו על ידי הוועדה האתית המקומית בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הרשויות הווטרינריות המקומיות (קנטון ז'נבה) והפדרליות (שוויצריות) עם מספר אישור GE11120A. נקבות גטינגן מיני-חזירות (n = 7) בגיל 2-6 חודשים (5-8 ק"ג) שימשו במחקר זה.

1. תכנון טרום ניתוחי

1. אפיון חוץ גופי של מערכת השתלים הרכים
   1. כרונואמפרומטריה: רשום את ירידת המתח עם הזרקת התפתחות פולס זרם דו-פאזי (כלומר, מעבר המתח [VT]) באמצעות אוסצילוסקופ המחובר במקביל למחולל פולסים. חבר את מחולל הדופק ברצף לכל אלקטרודה ומונה פלטינה בתמיסת מלח (מלח חוצץ פוספט [PBS] 1x). עיין בשלב 3.1 לקבלת ההגדרות.
   2. ספקטוגרמה של עכבה אלקטרוכימית: למדוד את העכבה האלקטרוכימית בתדרים שונים באמצעות פוטנציומטר. חבר את הפוטנציומטר ברצף לכל אלקטרודה באמצעות מונה הפלטינה ואלקטרודת ייחוס Ag/AgCl בתמיסת מלח (PBS 1x). עיין בשלב 3.2 לקבלת ההגדרות.
   3. התנגדות בין-ערוצית: במצב יבש, מדוד את התנגדות הזרם הישר (DC) בין ערוצים סמוכים באמצעות מולטימטר ידני.
   4. בחירת שתל: לאחר שלוש המדידות שצוינו לעיל, בחר את השתל יחד עם הקריטריונים הבאים: עכבה ב- 1 kHz מתחת ל- 100 kΩ וללא התנגדות בין-ערוצית מתחת ל- 1 MΩ.
2. עיקור
   1. עיקור שתלים: הכניסו את השתלים שנבחרו בנפרד לשקיות עיקור יחד עם סמן עיקור ואטמו אותם. השתמש באריזה כפולה כדי להבטיח סטריליות במהלך הניתוח.
      הערה: במקרה זה, עיקור גז מי חמצן (H 2 O₂) משמש בשל מחזור הזמן הקצר והטמפרטורה הנמוכה (55 ° C). החלופות הן גז אתילן אוקסיד (ETO) או עיקור אוטוקלאב, אך יש להבטיח תאימות למערכת השתלים.
   2. עיקור מכשירים: הניחו את המכשירים המנוקים בשקיות עיקור כפולות או בקופסאות מכשירים סטריליות יחד עם סמני עיקור. עיקור אוטוקלאבי הוא הנפוץ ביותר עבור מכשירים, אבל H 2 O₂או ETO הם חלופות אפשריות.

2. השתלה כירורגית של מערכי ECoG רכים

1. הרדמה
   1. טרום תרופות: בודדו את בעל החיים וצמו אותו למשך הלילה. הזריקו תערובת של midazolam ב 0.75 מ"ג / ק"ג, אטרופין ב 0.25 מיקרוגרם / ק"ג, ו haldol ב 0.1 מ"ג / ק"ג intradermally, ולחכות עד החיה הוא טשטוש. לשקול את החיה לפני שתמשיך.
   2. התקנת עופרת תוך ורידית (IV):
      1. הניחו את בעל החיים על שולחן הניתוחים על כרית חימום. יש להשרות הרדמה על ידי הנחת מסכת פנים על החיה, באמצעות סבופלורן בשיעור של 3%-3.5%.
      2. מניחים מוליכי אלקטרוקרדיוגרמה על הבטן, חיישן ריווי דם על הזנב וחיישן טמפרטורה בנחיר.
      3. הניחו עופרת עירוי על וריד האוזן ואשרו גישה לדם באמצעות מזרק מלא במי מלח. ודא את העיניים נשמרות hydrated באמצעות משחה.
   3. אינטובציה: יש להזריק בולוס של אטרקוריום ב-0.5 מ"ג/ק"ג, קטמין ב-1 מ"ג/ק"ג ופנטניל ב-1-2 מק"ג/ק"ג. הניחו את בעל החיים על גבו לצורך אינטובציה. הכנס צינור 4.5 מ"מ.
   4. תרופות: לאחר אינטובציה, להפסיק את הרדמת sevoflurane ולהתקין עירוי propofol ב 10 מ"ג / ק"ג / שעה, פנטניל ב 2 מיקרוגרם / ק"ג / שעה, atracurium ב 0.2-0.5 מ"ג / ק"ג / שעה, מלוחים ב 4-7 מ"ג / ק"ג / שעה. התחל עירוי של מניטול ב 1 גרם / ק"ג / שעה כדי להפחית נפיחות במוח במהלך הניתוח.
      הערה: ניתן להשתמש במשטר משככי כאבים רב-מודאלי אם הומלץ על ידי ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים.
2. צילום רנטגן לפני הניתוח
   1. הניחו את החיה על בטנה בתנוחת ספינקס. הסר באופן זמני כל חפץ מתכתי בקרבת המוח והגולגולת של בעל החיים (למשל, עופרת טמפרטורה בנחיר).
   2. לרכוש רנטגן מישור ציר ו sagittal עם ניגודיות של העצם. מקמו חפץ מתכתי בעל ממדים ידועים בשדה רכישת הקשת כדי שישמש כסולם למדידת עובי הגולגולת בחלק הקדמי והאחורי של המוח.
   3. זהה את מיקום הסינוסים הקדמיים (הנראה על ידי חללים מתחת לגולגולת) וסמן את המיקום האחורי ביותר על ראש החיה באמצעות סמן קבוע. זה יציין את הנקודה הרחוקה ביותר שבה כל craniotomy או מיקום בורג יכול להיעשות בגישה כירורגית המתוארת להלן.
3. שדה אספטי והכנת העור: יש לגלח את כל פני השטח של הראש מעבר לשדה הניתוחי. בעזרת פד סטרילי, לשפשף היטב את הראש עם betadine. לאחר מכן, הניחו וילונות סטריליים על שולחן המכשור ועל החיה כדי לחשוף רק את חלון הניתוח. לבסוף, לשפשף את הראש שוב עם פד סטרילי באמצעות betadine.
4. קרניוטומיה ודורוטומיה
   1. חיתוך עור: חותכים את העור עם סכין אזמל לאורך קו האמצע. יש להפריד את השריר והפריאוסטאום (25 מ"מ לרוחב מברגמה משני הצדדים ו-40 מ"מ קדמי ואחורי לברגמה) מהעצם באמצעות מפזר פטל ומניחים כדי לקבל גישה אופטימלית לקידוח מאוחר יותר.
   2. מידות וסימון: זהו ברגמה ולמבדה וסמנו אותן בעט כירורגי סטרילי (איור 2A, B). באמצעות סרגל סטרילי, הגדירו את קווי המתאר של דש העצם במרכזו יעד ההשתלה בשני חצאי הכדור. במקרה ספציפי זה, קליפת המוח השמיעתית נבחרה, עם קואורדינטות -5 מ"מ עד -15 מ"מ מברגמה ו -4 מ"מ עד -20 מ"מ לרוחב. לאחר מכן, התאימו את הקרניוטומיה לגודל השתל ולציוני דרך אנטומיים, תוך הגבלת גודל הפתיחה.
   3. קרניוטומיה:
      1. באמצעות מקדח עצם עם ביט חיתוך עגול, לקדוח את קווי המתאר של craniotomy, תוך התחשבות בעובי הגולגולת נמדד בשלב 2.2. השקו את מיקום הקידוח בתמיסת מלח כדי למנוע התחממות יתר של העצם.
      2. קודחים בזהירות את קווי המתאר בצורה הומוגנית עד שמגיעים לדורה מאטר. בפריצת הדרך הראשונה, סיימו לקדוח את המתווה עד שהוא דליל מספיק כדי כמעט לפרוץ. לאחר מכן, השתמש במרית שטוחה (בצד קו האמצע או בצד הצידי) כדי לשבור את דש העצם בחתיכה אחת, תוך שימוש בקצה הקרניוטומיה כמנוף. אם נתקלים בהתנגדות רבה מדי, המשיכו לדלל את העצם.
      3. מניחים את חתיכת העצם במי מלח סטריליים.
      4. לאחר הסרת דש העצם, סדקו בזהירות את קצה הקרניוטומיה, באמצעות קריסון כדי למנוע מקצה העצם החד לחתוך לתוך הדורה מאטר.
      5. אם דימום מוגזם נתקל על dura mater או העצם, להשתמש Gelfoam או שעווה עצם, בהתאמה. הניחו קומפרס רטוב (פד סטנדרטי בתמיסת מלח סטרילית) בקרניוטומיה וחזרו על שלב זה בחצי הכדור השני (איור 2B).
   4. דורוטומיה:
      1. בעזרת המחט ממערכת תפרים 6-0, מנקבים בזהירות ומרימים את הדורה מאטר בקצה הקדמי או האחורי של הקרניוטומיה באמצע הדרך בין הצד המדיאלי לצדדי ויוצרים התחלה של חתך עם סכין הדקירה.
      2. לאחר מכן, באמצעות מרית שטוחה קטנה המוחדרת לחלל התת-דוראלי ומשמשת כבסיס חיתוך להגנה על קליפת המוח, יוצרים חריץ אנטרופוסטריורי בדורה מאטר על ידי התקדמות בו זמנית עם שני הכלים. ודא שהחריץ גדול מעט מרוחב השתל (איור 2C). אם מתרחש דימום או נזק בשלב זה, כסו אותו בקצף ג'ל והמתינו עד שיפסיק.
         הערה: יש להתאים את מסלול החריץ אם קיימים כלי דם גדולים בדורה מאטר כדי למנוע דימום.
5. השתלה
   1. הכנסת התקן:
      1. השקו את השתל (איור משלים 1A) במי מלח משני הצדדים, כך שהוא יחליק לתוך החלל התת-דוראלי ביתר קלות. הניחו את השתל מעל לחריץ הדורה מאטר, ובעזרת מלקחיים קטנים הכניסו את המכשיר באופן תת-דוראלי על ידי החלקתו ברצף על כל קצה.
      2. החזיקו בזהירות את קצה הכן של המכשיר והתקדמו עם השתל על מנת לא ליצור מתח המעכב את החדרתו. כאשר קצה המחבר ממוקם על גבי החריץ, הפסק את ההכנסה.
   2. אבטחו את השתל: כדי לאבטח את השתל במקומו, הניחו גשר טיטניום מעל הכבל אחרי קצה הקרניוטומיה או בכנפי העיגון והדקו אותו באמצעות בורג טיטניום אחד או שניים באמצעות המברג המתאים (איור 2D).
   3. מיקום הקרקע: הסירו בזהירות 1 ס"מ מהבידוד של חוטי הארקה והכניסו אותו אפידורלית בקצה האחורי של הקרניוטומיה (או בכל מיקום אפידורלי רחוק מקליפת המוח המעניינת או מכלי דם גדולים) (חוט באיור 2E)
   4. חזור על שלבים 2.4.4. ו-2.5.1.-2.5.3 בחצי הכדור הנגדי.
   5. צילום רנטגן תוך ניתוחי לאישור המיקום:
      1. הניחו פד רטוב (פד סטנדרטי בתמיסת מלח סטרילית) על מקום הניתוח כדי לשמור על לחות הרקמה. לאחר מכן, הניחו וילון ניתוח סטרילי כדי לכסות את ראש החיה.
      2. צלם תמונות רנטגן מישוריות (ציריות וסגיטליות) כדי להבטיח שהשתלים ממוקמים היטב ואינם מקופלים, תוך שימוש בסמני הרנטגן כאינדיקטורים. אם לא, הסר את הווילונות והסר את ההתקן כדי להכניס אותו שוב (בצע שוב את שלבים 2.4.4. ו- 2.5.1.-2.5.3).
   6. סגירת Dura mater: תפרו את הדורה מאטר בזהירות סביב כבל השתל באמצעות תפר 3-0 resorbable ומחזיק מחט קטן. חברו את שני קצוות הדורה מאטר זה לזה ככל האפשר מבלי לקרוע את הקרום הדק באמצעות חוט התפר (איור 2D, E).
   7. מיקום דש עצם: קבע גשר טיטניום בחלק הקדמי והאחורי של כל דש עצם באמצעות בורג טיטניום. יש להקפיד לתכנן את מיקום גשרי ה-Ti ביחס למיקום רגלי לוחית הרגל בשלבים הבאים. הבריגו את קצה גשרי הטיטניום אל הגולגולת (איור 2F, G).
6. מיקום הדום ופלטת הרגליים
   1. מיקום: בתצורה זו, ללוחית כף הרגל יש שש רגליים עם שני חורי בורג כל אחת (איור משלים 1B). תכננו את מיקום לוחית כף הרגל על הגולגולת כדי לייעל את מיקום הברגים (הימנעו מהצבתם בקצה הקרניוטומיה או בשריר הרקתי). דלג על החורים ברגליים אם לא ניתן להבריג אותם.
   2. אבטחת לוחית הרגל: הבריגו את ברגי הטיטניום של לוחית כף הרגל עד שהיא יציבה במקומה (ראו איור 2H).
   3. מיקום הדוכן: הסירו את גשרי הטיטניום מעל כבלי החיבור והפכו את הכן כדי לנחות על לוחית הרגל. הבריגו את הכן אל לוחית הרגל. בדקו שהכן יציב במקומו (איור 2I).
7. תפר וסגירה
   1. ניקוי הפצע: נקו את החלל התת עורי מכל עצם או פסולת אחרת על ידי שטיפה במי מלח. חתכו מעט עור סביב קצוות הכן כדי ליצור קצה עגול בעקבות הצילינדר.
   2. תפרים תת עוריים: הסירו את הפיזורים וקפלו את דשי העור זה לזה. צור תפרים תת עוריים עם חוט תפר 4-0 שאינו ניתן לספיגה חוזרת, במרחק של 3 מ"מ זה מזה באמצעות תפרים קטועים פשוטים או תפרים רציפים פשוטים. התחילו הרחק מהכן והתקדמו לקראתו משני צידי החתך.
   3. תפרים עוריים: תפרו את העור באמצעות חוט תפר 6-0 שאינו ניתן לספיגה חוזרת, עם תפרים במרחק של 5 מ"מ זה מזה. התחילו הרחק מהכן והתקדמו לקראתו משני צידי החתך. דאגו להשיג מיקום רקמות טוב בין שני דשי העור וקרוב לקצה הכן כדי למנוע חלל ריק (איור 2J).
   4. חבישת פצע: נקו שוב את אזור הפצע בעזרת פד סטרילי ובטדין. יש למרוח תחבושת סטרילית בהדבקה עצמית על הפצע.
8. מדידות In vivo: למדידות in vivo, בצע את מקטעים 3, 4 ו-5.
9. התעוררות: לאחר ביצוע כל המדידות, יש להוריד את בעל החיים מכל חומרי ההרדמה אך להישאר תחת הנשמה. עבור שיכוך כאבים, להחיל תיקון buprenorphine (25 מ"ג / שעה) במשך 24 שעות. הניחו את בעל החיים על כרית חימום מכוסה וילונות כדי לזרז את זמן ההתעוררות. כאשר נשימה ספונטנית מתאוששת, להוציא את החיה ולשים תחת מסכת פנים חמצן עד ההכרה הוא התאושש (אשר יכול לקחת 1 עד 4 שעות).
10. טיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח: במשך 5 ימים, יש לשמור על בעל החיים תחת מעקב צמוד. תן מנה של cephalexin ב 75 מ"ג פעמיים ביום עם מזון, מופרדים מבעלי חיים אחרים. לבצע חיטוי של הפצע מדי יום על ידי החלת כמויות גדולות של betadine עם רפידות סטריליות ספוג (נעשה בצורה הטובה ביותר במהלך האכלה).
    הערה: טיפול סיעודי ודיור: בעל החיים המנותח מוחזק בבידוד למשך 24 שעות. הוא מוחזר לקבוצה החברתית המקורית שלו אם בעל החיים טוב מספיק כדי לקיים אינטראקציה חברתית עם בני גילו. יש לבצע תצפית יומית על הכן ועל פתח העור כדי לעקוב אחר שילוב המכשיר על הראש. במידת הצורך, נקו את המיקום סביב הכן עם כמויות גדולות של בטאדין.

3. אפיון In vivo של השתל הרך

1. כרונואמפרומטריה: רשום את ירידת המתח עם הזרקת התפתחות פולס זרם דו-פאזי (כלומר, VT) באמצעות אוסצילוסקופ המחובר במקביל למחולל פולסים. חבר את מחולל הדופק ברצף לכל אלקטרודה ולחוט ההארקה. בצע את פעימת הגירוי ב 100 μA עם רוחב פולס של 300 μs ב 100 הרץ.
2. ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית: למדוד את העכבה האלקטרוכימית בתדרים שונים באמצעות פוטנציומטר. חבר את מחולל הדופק ברצף לכל אלקטרודה, תוך שימוש בחוט הארקה הן כאלקטרודה הנגדית והן כקרקע. הגדר את מתח העירור ל 200 mV ואת טווח התדרים מ 1 הרץ עד 1 MHz, עם שלוש נקודות בעשור.
3. מדידות קצרות בין ערוצים: מדוד את התנגדות DC בין ערוצים סמוכים באמצעות מולטימטר ידני. In vivo, התנגדות DC הבין-ערוצית נמדדת רק כדי לוודא שלא מופיעים חוסרים מתחת ל-1 kΩ, מה שמצביע על כשל אנקפסולציה מוחלט.

4. הקלטה אלקטרופיזיולוגית

1. פעילות ספונטנית: חבר את מערכת ההקלטה האלחוטית דרך הכן והקלט את הפעילות הבסיסית למשך 2-3 דקות. הקלטות אלה ישמשו כבקרה לניתוח הפוטנציאלים השמיעתיים המתעוררים.
2. פוטנציאלים מעוררי שמיעה: בנוסף למערכת האלחוטית, הכנס רמקולים בשדה סגור באוזני החי. צליל ההשמעה פרץ גירוי אקוסטי בתדרים שונים (הנעים בין 200-20,000 הרץ) בסביבות 70 dB, רמת לחץ קול (SPL) במשך 120 חזרות. לאחר מכן, ממוצע ההקלטות ויישר אותן לאורך תקופת הגירוי לניתוח.
3. פוטנציאלים מעוררי חושים: מקמו את המחטים בחוטם בשלושה מיקומים שונים. עורר פוטנציאלים חושיים על ידי גירוי החוטם במשך ~30 שניות עם מחולל הדופק באמפליטודות שונות כדי להשיג את עקומות הגיוס.

5. הדמיה in vivo

1. הובלת בעלי חיים: יש לשמור את בעל החיים תחת הרדמה פרופופול, כמתואר בשלב 2.1. השתמש בעגלת הובלה הכוללת מכונת הנשמה, משאבת מזרק ומוניטור סימנים חיוניים כדי להעביר את בעל החיים מחדר הניתוח למתקני ההדמיה ובחזרה.
2. סריקת רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת: הניחו את בעל החיים על שולחן הסורק והסירו כל חפץ מתכתי סביב הראש (למשל, חיישן הטמפרטורה). בצע סריקת CT ברזולוציה הקטנה ביותר (עובי פרוסה של 0.4 מ"מ) באמצעות רכישה איזומטרית עם בחירת זרם ומתח אוטומטית לניגודיות עצם.
3. הדמיית תהודה מגנטית: הסר את כל הציוד המכיל מתכת מהחיה (השתמש במוליכי IV תואמי MRI ובצינור אינטובציה). יש לשמור על בעל החיים מונשם ומורדם תחת סבופלורן בשיעור של 3%-3.5%, באמצעות מכונת הנשמה הממוקמת מחוץ לתא ה-MRI ומחוברת דרך צינור ארוך לחיה. לפני הרצף הראשון, להזריק בולוס של פנטניל ב 1-2 מיקרוגרם / ק"ג. השתמש בשלושה רצפים איזומטריים ברזולוציה הקטנה ביותר: רצפים משוקללים של הד ספין T1, T2 וטורבו (TSE) (פרמטרים מוצגים בקובץ משלים 1).

6. הקלטה הנעה בחופשיות

1. בצע את אותו הליך המתואר בסעיף 4 להקלטת אותות ערים מהמוח. חבר את במת הראש האלחוטית על ידי החזקת בעל החיים בזרועות הנסיין או האכלת בעל החיים בחטיפים כדי להסיח את דעתו. ספק את הגירוי האקוסטי באמצעות רמקולים חיצוניים הממוקמים קרוב לחיה.

7. זילוח והכנת רקמות

1. אופציונלי: אם בעל החיים עדיין לא תחת הרדמה, בצע את שלב 2.1 עבור פרוטוקול ההרדמה.
2. החדרת קטטר לעורק התרדמה לצורך זילוח (איור משלים 2)
   1. דיסקציה של עורק התרדמה והווריד הצווארי: חותכים את הגרון בקו האמצע באמצעות צוואר/חותך. חתכו תחילה את העור ולאחר מכן את השריר שעוקב אחר הקו הלבן האמצעי (ללא כלי דם מתחת) (איור משלים 2A).
   2. פתח עוד יותר, באמצעות האצבעות כדי לפנות מקום סביב קנה הנשימה ומתחת לשריר. חפש את עורק התרדמה (פועם ורדרד); העצב הווגאלי נמצא לעיתים גם סביב (לבן), והווריד הצווארי יכול להיות מתחת או בצד (אדום). מקמו את הפיזורים (ראו איור משלים 2B).
   3. התחל את הדיסקציה של עורק התרדמה באמצעות מלקחיים עדינים ומספריים עגולים. השתמש מספריים כדי לפתוח רקמת הלחמית. אם אין כלי דם, לחתוך; אם יש כלי דם, יש לצרוב ולהתקדם (איור משלים 2C, D). כאשר אתם מנתחים אותו מספיק, השתמשו במהדק כדי לעבור מתחת לעורק התרדמה כך שהוא יהיה מבודד לחלוטין (איור משלים 2E).
   4. חזרו על אותו ניתוח עם הווריד הצווארי (איור משלים 2F).
   5. כאשר שני כלי הדם מנותחים ומבודדים לחלוטין, הניחו סביבם חוט תפר. אל תסגור אותם עדיין. שני תפרים סביב התרדמה, אחד ממש בבסיס (תפר 1-צד לב לזילוח המוח) ואחד בצד השני (תפר 2), מוצגים באיור משלים 2G.
   6. מניחים תפר אחד סביב הווריד הצווארי (תפר 3), לא סגור; סמן את החוטים עם סרט עבור חתך של הווריד מאוחר יותר.
   7. סגור את תפר 1 בחוזקה רבה, אחרת הוא ידמם (איור משלים 2H). לקשור שלושה קשרים. מניחים מהדק על החוט כדי לשים משקל וליצור מתח בעורק התרדמה.
   8. מהדקים את עורק התרדמה באמצעות מהדק כלי דם בצד הנגדי של דיסקציה של עורק התרדמה (צד המוח לזילוח מוח; איור משלים 2I). תפר 2 נמצא באמצע, עדיין לא סגור.
   9. השתמש במלקחיים שחורים כדי לתפוס ולמשוך את עורק התרדמה. בעזרת מספריים עדינים, חתך מחצית מעורק התרדמה בסמוך לבסיס הדיסקציה (ליד תפר 1, צד הלב; ראו איור משלים 2J). לוודא כי החלק הוא מסודר ככל האפשר ומגיע לכלי עצמו, לא רק את "נדן"; אחרת, הצנתר לא יעבור. הכנס את הצנתר כפי שמוצג באיור משלים 2K.
   10. שטפו ומלאו את הצנתר, תחילה ב-PBS, כך שלא יישאר אוויר בצנתר (כניסה משלימה של איור 2K ).
   11. סגור את תפר 2 מספיק חזק כדי שלא ייעלם, אבל לא יותר מדי כדי שהקטטר עדיין יוכל לזוז קצת (איור משלים 2L). לאחר מכן, להסיר את מהדק כלי הדם, לסיים את החדרת הקטטר ככל האפשר, ולסיים את הסגירה של תפר 2 (לסגור בחוזקה).
   12. אם תרצה, השתמש בחוטי תפר בתפר 1 כדי לחבר את בסיס הצנתר לעור ביציאה מהפצע כצעד ביטחון נוסף. לאחר מכן, העבירו את בעל החיים לאזור הזילוח וחברו אותו ל-PBS/הפרין. כאשר הזלוף מתחיל, למשוך תפר 3 לחתוך את הווריד jugular
3. המתת חסד: לספק pentobarbital (90 מ"ג / ק"ג) תוך ורידי ולשטוף את הקו עם מלוחים כדי להבטיח את המינון המלא מנוהל בהצלחה.
4. זילוח: באמצעות משאבת זילוח (200 מ"ל/דקה) חברו את צנתר התרדמה ל-PBS/הפרין (1 ליטר לחזיר במשקל 15 ק"ג) ולאחר מכן ל-PBS המכיל 4% פרפורמלדהיד (PFA) (5 ליטר לחזיר במשקל 15 ק"ג). כאשר הזלוף מתחיל, למשוך תפר 3 לחתוך את הווריד jugular.
5. איסוף רקמות
   1. עריפת ראשים: בסיום הזילוח, נתקו את ראש החיה מהגוף באמצעות אזמל, על ידי חיתוך העור והשריר והחדרת הלהב בין החוליה הראשונה והשנייה.
   2. קיבוע: יש לצלול את הראש ב-4% PFA ב-PBS למשך 48 שעות נוספות ב-4°C ואז להעביר ל-PBS לפני מיצוי המוח.
   3. מיצוי מוח ושתלים:
      1. הסר את העור באמצעות אזמל והתחל לחתוך את העצם בזהירות באמצעות רונגר החל מהחוליות הראשונות, בעקבות חוט השדרה אל המוח הקטן. לאחר חשיפת המוח הקטן, הסר בזהירות את העצמות הטמפורליות וחשף את האונות הקודקודיות והקדמיות.
      2. בשלב זה, הבריגו את הכן מצלחת כף הרגל וחתכו את רגלי לוחית כף הרגל עם צבת. הסר את העצם ליד כניסת הכבל לגולגולת כדי לשחרר את מערכת השתלים מהעצם, מבלי למשוך את השתלים מיציאת הדורה מאטר.
      3. אם כבלי השתל מוטמעים בעצם, חתכו את הכבל קרוב ככל האפשר ליציאה. ברגע שמספיק משטח מוח נחשף, חותכים בזהירות את הדורה בעקבות קו האמצע באמצעות מספריים קטנים.
      4. שחררו את כבלי השתל מיציאת הדורה מאטר. צלמו תמונות ממיקום השתל במוח. לאחר מכן, השתמשו בכפית קטנה כדי לנתק את המוח מעצבי הגולגולת שמתחת. בזהירות לחלץ את המוח. הסר את השתלים מהמוח.
   4. קיבוע המוח: בהתאם לאיכות הזילוח, לאחר מכן המוח שחולץ שוב במשך 24 שעות ב 4% PFA ב PBS ב 4 ° C. יש לשמור בטמפרטורה של 0.1 M PBS בטמפרטורה של 4°C עד לחיתוך המוח.
   5. חיתוך מוח: הפרידו בין שתי ההמיספרות באמצעות סכין גילוח. לאחר מכן, חתכו את המוח באופן אורתוגונלי לארבעה חלקים שונים. חתכו את האזור המושתל לשניים כדי לקבל שני בלוקים המכילים את האזור המושתל ואזור בקרה. אחסן את שני הבלוקים האחרים אם יש צורך בשקופיות בקרה נוספות.
   6. הגנה מפני הקפאה והקפאה של המוח: העבירו את בלוקי המוח לתמיסה של 15% סוכרוז תחילה ולאחר מכן 30% סוכרוז בטמפרטורה של 4°C עד שהמוח צולל ומגיע לשיווי משקל. לאחר מכן, להקפיא את הרקמה isopentane ב -55 ° C במערכת הקפאת רקמות.

8. היסטולוגיה

1. חתך רקמות
   1. קריוסטט: הכניסו את המוח הקפוא להקפאה וחתכו עד להשגת חלקים מלאים. לאחר מכן, פורסים את המוח למקטעים של 40 מיקרומטר וטובלים בקבוצות של שלושה ב-PBS של 0.1 מטר בצלחות באר. שימו לב היטב לסדר הצלחות.
   2. בחירת מקטעים: בחר את המקטעים בהתאם לאזור שברצונך לנתח (אזור מושתל או אזור בקרה). הוציאו את החלקים ברצף מלוחות הבאר, והשתמשו במברשת עדינה כדי לבדוק אותם לאיתור נזקים. מניחים אותם בצלחות באר חדשות מלאות ב- PBS 0.1 M לצביעה נוספת.
2. אימונוהיסטוכימיה
   1. אופן ההכנה: יש לדגור על המקטעים ב-0.3% Triton X/PBS למשך 15 דקות, ולאחר מכן אלבומין בסרום בקר (BSA)/PBS 3% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
   2. נוגדנים ראשוניים: לדגור על הרקמות עם נוגדנים ראשוניים במשך 48 שעות ב- RT (אנטי GFAP, חולדה, מדולל ב 1/300; אנטי Iba1, ארנב, מדולל ב 1/400; אנטי NeuN, גינאפיג, מדולל ב 1/1,000; הכל ב 1% BSA/PBS). מכסים את צלחות הבאר ברדיד אלומיניום.
   3. שטיפה: שטפו את הבארות עם 0.1 M PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
   4. נוגדנים משניים: יש לדגור על הרקמות עם נוגדנים משניים למשך שעתיים ב-RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; כולם מדוללים ב-1/400 ב-1% BSA/PBS).
   5. DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole): לדגור על הרקמות עם DAPI במשך 15 דקות (1/1,000 ב-1% BSA/PBS).
   6. שטיפה: שטפו את הבארות עם 0.1 M PBS חמש פעמים במשך 15 דקות.
   7. הרכבה: הרכבה של המגלשות באמצעות מדיית הרכבה וכיסוי. שמור את המגלשות בחושך במקרר ב 4 ° C.
3. דימות
   1. הדמיית שקופיות שלמות: צלם את השקופיות בהגדלה של 10x (ערך מרחק עבודה אובייקטיבי = 3,100 מיקרומטר) באמצעות מיקרוסקופ סורק שקופיות בשלושה אורכי גל שונים (640 ננומטר, 560 ננומטר, 485 ננומטר). את כל המידע על כוח ורווח ניתן למצוא בקובץ משלים 2.
   2. הדמיה מיקרוסקופית: צלם את אזור העניין בהגדלה של 20x (apochromat 20x/0.8 M27) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בארבעה אורכי גל (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). את כל המידע על כוח ורווח ניתן למצוא בקובץ משלים 3.

Results

כדי לאשר את המיקום (איור 3A) ואת הפונקציונליות של המכשירים, רישומים אלקטרופיזיולוגיים מבוצעים תוך ניתוחית לאחר מיקום הדום. האות הבסיסי נרכש לראשונה במשך 2 דקות ללא גירויים כשליטה בפעילות הבסיסית. שנית, בעל החיים מגורה אקוסטית באמצעות פרץ צלילים בתדרים שונים (500-20,000 הרץ), והנתונים הגולמיים ממוצעים לאורך תקופת הגירוי כדי למפות פוטנציאלים מעוררים שמיעתיים על פני המערך (למשל, ב-800 הרץ בהשוואה לקו הבסיס; איור 3B). הנתונים המוצגים כאן אינם מעובדים, אך אם קיים רעש רב מדי, ניתן להחיל מסנני חריץ ופסים. מקורות רעש אופייניים באולם הניתוח כוללים כריות חימום, מקדחות תקועות ויניקה או צרבות (בין היתר) שיש להסיר לפני הרכישה. בהקלטות ערות, יש להימנע מתנועת שרירים גדולה סביב הראש, כגון לעיסה, לקבלת מערכי נתונים נקיים יותר.

פרוטוקול זה יושם בכל נקודת זמן הקלטה, וניתן היה להשוות אותות עבור ערוץ יחיד לאורך זמן. דוגמה אחת מודגמת באיור 3C, המראה את החוסן וההתפתחות של התגובה. ניתן להעריך את יכולת ההקלטה של כל מגע במהלך הניסוי על-ידי חישוב סטיית התקן של אות הבסיס בכל נקודת זמן (איור 3D). במחקר זה, יחס האות לרעש ירד והתיישב בין יום 0 לחודש 6, למרות שונות מסוימת עקב משך הזמן המוגבל של תקופת ההקלטה (כלומר, 2 דקות). זה יכול להיות מתואם עוד יותר לעכבות אלקטרודות.

ההדמיה in vivo מבוצעת לאחר הניתוח כדי להעריך את מצב המוח ואת מיקום השתל. באיטרציה הראשונה של הפרוטוקול לא בוצע צילום רנטגן תוך ניתוחי, וכתוצאה מכך נוצר מכשיר מקופל, כפי שניתן לראות באיור 4A על רצף MRI משוקלל T1 (ראו בנוסף איור 4B). לא נצפה שינוי התנהגותי בחיה, אולם עם הזמן זה גרם לכימוס פיברוטי סביב המכשיר עקב דחיסה מקרוסקופית של המוח סביב מיקום השתל (איור 4C). לאחר ההתנסות הזו, הוכנס צילום רנטגן תוך ניתוחי, כפי שמוצג באיור 4D, שבו הסמנים הרדיופאקים (פסים שחורים שנראים על השתל באיור 4D) מוצגים במיקום טוב. לאחר מכן פני השטח של המוח שלמים, כפי שניתן לראות ב-MRI שלאחר הניתוח באיור 4E. בסך הכל, עם השתל ומערכת הדום הזו, הדמיה של המוח כולו אפשרית. רצפים שונים במישורי העטרה מאפשרים לראות מבנים אנטומיים (איור 4F,G; רצפי MRI T1 ו-T2) או נוכחות של נוזלים ודם סביב השתל (איור 4H; רצף MRI משוקלל TSE). מערכת הכנים כמעט שאינה יוצרת חפצים, למעט כמה חללים קטנים בעלי ניגודיות שחורה סביב ברגי הטיטניום (ראו איור 4G). בנוסף, אלקטרודות קליניות משמשות כמשווים במחקר זה, אך לא ניתן לבצע הדמיה ב- MRI בשל חששות חימום ובטיחות. לכן, סריקות CT נרכשות על החיות האלה, כפי שמוצג באיור 4I. האלקטרודות נראות בבירור, ומערכת הדום אינה משפיעה על איכות התמונה.

לאחר תקופת ההשתלה, החיה מחוררת, והמוח חולץ. במחקר זה, ניתוח התגובה הדלקתית מבוצע על כל חצי כדור בנפרד. חיתוך המוח לשניים קל יותר להכנת רקמות לפני החיתוך, ויש לו את היתרון שניתן להרכיב מקטעים על שקופיות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. דוגמה אחת של דגימת מוח מוצגת לפני (איור 5A) ואחרי (איור 5B) חיתוך בלוקים. קווי המתאר של השתל נראים בבירור ויצרו שקע קטן במוח. על-ידי חיתוך במישורים מקבילים, הרקמה כבר מיושרת להקפאה, וניתן לחתוך חלקים בקלות ללא אובדן רקמה לצורך חיתוך (איור 5C). לאחר הצביעה, כל מקטע הרקמה מצולם (איור 5D), כאשר לדוגמה, שכבת הנוירון נראית בבירור בפירוט (ראו סמן NeuN). חלקים שלמים הם שבירים ולפעמים יכולים להוביל לאובדן מסוים של רקמה (ראו תחתית איור 5D), אבל אזור העניין שלם. במבט מקרוב, המתאפשר על-ידי הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי במהירות של פי 40, התאים מוגדרים בבירור ומאפשרים חקירה עדינה של סמנים דלקתיים, למשל (איור 5E). ניתן לבצע ניתוח כימות נוסף כדי להשוות דלקת בין ההמיספרות הביקורתיות לבין ההמיספרות המושתלות. איור 6 מראה את האפיון האלקטרוכימי של האלקטרודות המושתלות. ספקטרוסקופיית העכבה האלקטרוכימית במבחנה של מערך האלקטרודות הרכות עם מודולוס עכבה ופאזה מוצגת באיור 6A, ומודולוס העכבה ב-1 קילוהרץ במשך 6 חודשי השתלה מוצג באיור 6B.

איור 1: סכמה של הניסוי. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השתלה זעיר פולשנית של ECoG רך במוח . (A) גישה כירורגית לגולגולת, עם אינדיקציה לברגמה. (B) קרניוטומיה דו-צדדית עם dura mater גלוי. (C) חריץ דורוטומיה בחצי הכדור הראשון. (D) השתלה תת-דוראלית של ECoG רך וסגירת דורה מאטר. (E) חריץ דורוטומיה בחצי הכדור השני. קיבוע דש עצם בחצי הכדור הראשון באמצעות גשרי טיטניום. (F) השתלת ECoG רך על ההמיספרה השנייה וסגירת דורה מאטר. (G) קיבוע דש העצם בחצי הכדור השני. (H) מיקום לוחית הרגל על הגולגולת. (I) קיבוע הדום על לוחית כף הרגל. (J) סגירת העור סביב בסיס הכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הקלטה של פוטנציאלים מעוררי שמיעה . (A) סכמה של מיקום אלקטרודות על פני השטח של האונה הרקתית. (B) מיפוי מייצג של פעילות בסיסית (עקבות אפורים) ופוטנציאלים מעוררים שמיעתיים בתגובה לגירוי פרץ של 800 הרץ (עקבות סגולות). כל ממוצע מתאים לערוץ אחד במערך ECoG הרך. הממוצע מופעל על אות הקלט האנלוגי מגירוי הקול. תקופות הגירוי האקוסטי "מופעל" ו"כבוי" מצוינות בערוץ אחד בפינה השמאלית התחתונה. (C) אבולוציה לאורך זמן (יום 0, חודש 2 וחודש 5) של תגובת ערוץ יחיד לאחר גירוי אקוסטי, בהשוואה לאות בסיסי כאשר לא מוצג גירוי (אפור). הממוצע מופעל על אות הקלט האנלוגי מגירוי הקול. תקופות הגירוי "מופעל" ו- "כבוי" מצוינות בתחתית. הפוטנציאל המעורר של גירוי "ON" מסומן בחצים. (D) סטיית תקן לכל ערוץ (נקודות צבעוניות) לכל נקודת זמן של הקלטת קו הבסיס. הערכים החציוניים מיוצגים בכחול מודגש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמיה In vivo של המוח ואלקטרודות מושתלות . (A) MRI משוקלל T1 לאחר הניתוח במישור העטרה. חץ מציין שתל מקופל. (B) חלק מוגדל של A, שבו קיפול השתל יוצר שקע במוח. (C) MRI משוקלל T1 לאחר השתלה של חודש אחד, המראה דחיסה של המוח עקב האנקפסולציה הפיברוטית של המוח באותו מיקום כמו C. (D) צילום רנטגן תוך ניתוחי המאמת את מיקום השתל וללא קיפול, כפי שנצפה על ידי מיקום הסמן הרדיופאקי. כניסה: צילום של שתל עם סמן רדיופאק גלוי. (E) MRI משוקלל T1 לאחר הניתוח במישור העטרה עם מיקום שתל אופטימלי. (F) MRI משוקלל T1 בהשתלה של חודש אחד. (G) MRI משוקלל T2 בהשתלה של חודש אחד. חץ מראה את חפץ ההדמיה מברגי הטיטניום המחזיקים את לוחית כף הרגל במקומה על הגולגולת. (H) MRI משוקלל TSE בהשתלה של חודש אחד. (I) סריקת CT של בעל החיים שהושתלו בו האלקטרודות הקליניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ניתוח היסטולוגיה של המוח לאחר השתלה ארוכת טווח. (A) תצלום של המיספרה שמאלית-מוחית נטועה ומחוררת. (B) מוח מחורר שנחתך בבלוקים לפני שלב ההקפאה. (ג) תמונה של מערך חתך בלוק שלם בהקפאה; ניתן לחלק את כל "הבלוקים החתוכים מראש". (D) דימות חיסוני של כל חצי הכדור (סורק שקופיות, 20x אובייקטיבי) ו-(E) זום על השכבות הראשונות של קליפת המוח (הדמיה קונפוקלית, 40x אובייקטיבי) המראה תאי גלייה, אסטרוציטים ונוירונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: אפיון אלקטרוכימי של האלקטרודות המושתלות. (A) ספקטרוסקופיית עכבה אלקטרוכימית במבחנה של מערך האלקטרודות הרכות (קווים אפורים קטנים לכל ערוץ, הממוצע באדום) עם מודולוס עכבה (למעלה) ופאזה (למטה). (B) אבולוציה של מודולוס העכבה ב-1 קילוהרץ במשך 6 חודשי ההשתלה (ממוצע בכחול; קווים אפורים הם הערוצים הבודדים; מדידת המבחנה ניתנת כהפניה באדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: כן תואם MRI. (A) מערכת חיבור טרנסדרמלי כרונית תואמת MRI (כן) כדי לגשת למערך האלקטרודות הרכות. (B) פדסטל עם אלקטרודות המותקנות על לוחית כף הרגל לצורך עיגון הגולגולת. כניסה: פרטי לוחית הרגל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: גישה כירורגית לזילוח אופטימלי של המוח. (A) חתך עור וגישה למיקום עורק התרדמה ווריד הצוואר. (B) דיסקציה של הרקמה סביב כלי הדם. (ג,ד) זיהוי ודיסקציה של הרקמה סביב עורק התרדמה ווריד הצוואר. (ה) בידוד עורק התרדמה מהרקמה שמתחתיו. (F) בידוד הווריד הצווארי מהרקמה שמתחתיו. (G) מיקום חוט התפר סביב עורק התרדמה (תפר 1 ותפר 2) והווריד הצווארי (תפר 3). (H) סגירת תפר 3 בבסיס עורק התרדמה (צד הלב) למניעת דימום במהלך פתיחת כלי הדם. (I) הידוק עורק התרדמה בצד הנגדי מ-H. (י) חתך של עורק התרדמה. (K) החדרת קטטר לפתח מ-J. כניסה: צנתר דרוך עם מי מלח סמוקים ממזרק לקצה הצנתר. (L) סגירת תפר 2 כדי לשמור על הצנתר במקומו ולאורך העורק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: פרמטרים עבור רצפי MRI משוקללים T1- (עמודים 1-2), T2- (עמודים (3-4) ו-TSE משוקללים (עמודים 5-6), בהתאמה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: מטה-נתונים עבור סורק שקופיות להדמיית שקופיות שלמות של פרוסות מוח מוכתמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: מטא-נתונים להדמיה קונפוקלית של חתך מוגדל של פרוסות מוח מוכתמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

אנו מדווחים כאן על שיטה להשתלה ארוכת טווח והערכה של מערכי ECoG רכים. במחקר זה, תכננו גישה כירורגית עקבית וזעיר פולשנית להשתלה דו-צדדית של רשתות אלקטרודות תפקודיות מעל האונות הרקתיות (כאן, התמקדות בקליפת המוח השמיעתית). תחילה הערכנו את הפונקציונליות של הרשת על-ידי רישום מוצלח של פוטנציאלים מעוררים במהלך המחקר (6 חודשים) ומעקב אחר התכונות האלקטרוכימיות של האלקטרודות (ראו איור 6). שנית, הערכנו את הבטיחות הביולוגית של הרשתות, in vivo באמצעות MRI והקמת מערכת תואמת MRI מלאה, ולאחר המוות על ידי תכנון פרוטוקול לאיסוף רקמות וצביעת חיסון.

כדי למזער את הפולשנות ביצענו אופטימיזציה של גודל חלון הקרניוטומיה. כדי להגיע לקליפת המוח השמיעתית הממוקמת באונה הרקתית ולהימנע מכריתת השריר הרקתי, פיתחנו טכניקה להחלקת השתל מתחת לדורה. טכניקה זו מאפשרת להפחית באופן דרסטי את פני השטח של המוח החשוף ועדיין להגיע למטרות רחוקות. בעוד סוג זה של השתלה עשוי להיראות עיוור, יישום של סמנים radiopaque על המכשירים כי הם דמיינו ברנטגן מטוס תוך ניתוחי מאפשר אימות של מיקום, ומבטיח את המערך אינו מקופל תחת dura mater. ההחלקה התת-דוראלית הוכחה כבטוחה ברוב החזרות שביצענו. בנוסף, הדורוטומיה בגישת חריץ ממזערת את הבליטה במוח בזמן שהקרניוטומיה פתוחה ומקלה על הסגירה סביב השתל ללא צורך בחומר נוסף כגון דורה מאטר מלאכותי, שעלול להטות את התגובה הדלקתית. לבסוף, כוחה של גישה כירורגית זו הוא יכולתה לעבור לאזורים שונים בקליפת המוח. משחק עם קואורדינטות, מיקום הקרניוטומיה וגודל המכשיר, שכולם ניתנים לכוונון, מאפשרים לשיטה זו להתמקד ברוב אזור קליפת המוח.

השיטה הכירורגית המוצגת כאן, יחד עם הערכה תפקודית וחקירה של הביואינטגרציה לאורך זמן, אינה מוגבלת לטכנולוגיית האלקטרודות הרכות המשמשת בדו"ח זה. אלקטרודות תת-דוראליות אחרות שמפותחות לתרגום אנושי יכולות להיות מוערכות באותו פרוטוקול. כוחה של שיטה זו נשען על העובדה שרוב החלקים, כגון הכבל והכן, הם מודולריים, ניתנים להתאמה אישית וניתנים להתאמה למכשיר הספציפי הנבדק. בנוסף, ניתן להשתמש גם בבדיקות תוך קורטיקליות או חודרות עמוקות במקום או בשילוב עם האלקטרודות התת-דוראליות, מכיוון שזה דורש רק התאמת גיאומטריית הקרניוטומיה והדורוטומיה. לאחר מכן ניתן להשוות את התוצאות ארוכות הטווח למקביליהם הקליניים, כפי שעשינו כאן.

אחת המגבלות העיקריות של השיטה המוצגת היא נוכחות של סינוסים בגולגולת במיני-חזירים, המתפתחים במהלך השנה הראשונה¹². בהקשר זה, היבטים חשובים שיש לקחת בחשבון כוללים את גיל ההשתלה וגם את גודל החיה. ביצוע קרניוטומיות בגולגולת הבוגרת שובר את שלמות הסינוסים ומוביל לסיכון גבוה לזיהום משמעותי במסגרות כרוניות. סינוסים כאלה נראים בצילום רנטגן מטוס וסריקת CT לפני הניתוח. מצד שני, ביצוע השתלה כרונית מוקדם מדי, בחיה קטנה מדי, גם אינו אופטימלי כאשר הגולגולת עוברת צמיחה ושיפוץ מאסיביים. שיערנו כי "תנועות הגולגולת" הללו לאחר הניתוח עלולות לגרום לשתל לזוז ולהתקפל, מה שבסופו של דבר מזיק לניסוי. מצאנו כאן כי מיני חזירים גטינגן, כ 5-6 חודשים (ו 8 ק"ג) בזמן ההשתלה, צריך לתת את התוצאות הטובות ביותר.

להערכת הביצועים של ECoG המושתל עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, הגדרנו פרוטוקול מהיר להקלטת פוטנציאל מעורר שמיעתי (AEP) שניתן להשתמש בו בבעלי חיים הנעים בחופשיות ותחת טשטוש. הוא מורכב מהצגת סדרה של התפרצויות טון אקוסטי בתדרים ספציפיים במהלך מספר דקות. היתרון של פרוטוקול כזה הוא העובדה שניתן לכוונן אותו לאורך ההקלטה הזמין על ידי הפחתת מספר התדרים שנבדקו. אחד האתגרים בעת רישום אותות קליפת המוח תחת הרדמה הוא שיש לקחת בחשבון את רמת התודעה של בעל החיים בעת ניתוח והשוואת הנתונים.

פרוטוקול הזילוח הותאם לאורך זמן על ידי תצפית על איכות המוח שחולץ. ואכן, היה לנו קל יותר לצנתר את עורק התרדמה בלבד, ולא את הווריד הצווארי. בתחילה, הספרות מציגה שיטות שבהן וריד הצוואר הוא צנתור כדי לנקז פסולת²⁰. מעשית, זה מגביל את הזרימה החוצה מהמוח ומוביל למיצוי גרוע יותר של דם ואיכות כללית של זילוח. על ידי חיתוך הווריד הצווארי והשארת הנוזל לברוח במיכל גדול בו שוכב החיה, יעילות הזילוח עולה.

פיתחנו שיטת הכנת רקמות חזקה שעובדת עם נוגדנים המשמשים באופן שגרתי למעקב אחר דלקות. הפרדנו בין שתי ההמיספרות מסיבות מעשיות, שכן מחצית ממוחו של החזיר מתאים לשקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות ולכן תואם לרוב ציוד ההדמיה הזמין במעבדות היסטולוגיה. על ידי חיתוך המוח בבלוקים, גישה ישירה לאזור העניין מתאפשרת ללא צורך בחיתוך נוסף של המוח כולו או חיתוך חלקים נרחבים של הרקמה. ניתן לאגד את פרוסות המוח בגודל 40 מיקרומטר בצלחות באר סטנדרטיות ולהכתים אותן באופן צף חופשי ללא שינויים משמעותיים בפרוטוקול ממערכות החיסון של מינים אחרים. ניתן לדמיין צביעה חיסונית מלאה במוח גם על ידי שימוש, למשל, בשיטות CLARITY²¹.

בסך הכל, פרוטוקול זה, המכסה תכנון שתלים מותאם אישית להשתלה, מעקב פונקציונליות והערכת בטיחות ביולוגית, הוא חזק ועקבי. הדגמנו כאן את ההיתכנות שלה לחקור את מערכת השמיעה, אבל זה יכול להיות transposed כדי לבדוק תפקודים פיזיולוגיים אחרים. יתר על כן, כוחה של השיטה שלנו טמון בעובדה שהיא אינה מוגבלת למיני-חזירים, אלא ניתנת להעברה מלאה למינים אחרים כגון כבשים, עזים או פרימטים שאינם אנושיים. במידה מסוימת, זה יכול גם להיות מותאם בקלות חולדות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מקדחת עצם	BBraun	Elan 4 עם  GA861 חתיכת
יד מקדח עצם	BBraun	Neurocutter GP204R
שעוות עצם	Ethicon	W31G
קטטר	Venisystems	Abbocath 14G
מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	פייזר	ג'ל קצף
הכנס רמקולים	Etymotic	Etymotic ER2 הכנס אוזניות
מולטימטר	Fluke	Fluke 1700
אוסילוסקופ	Tektronix	MDO3014 משאבת זלוף אוסילוסקופ
	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	התייחסות 600
נוגדן ראשוני Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
נוגדן ראשוני Anti-IBA1	Fujifilm	Anti IBA1, ארנב, 019-19741
נוגדן ראשוני Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
מחולל דופק	AM Systems	דגם 2100 ממריץ
הקלטת במה מערכות	רב ערוציות	W2100-HS32
מערכת הקלטה	מערכות רב ערוציות	W2100
מברג	ידית מדטרוניק	: 001201, פיר: 8001205
נוגדן משני 488	Thermofischer	Goat Anti-Rat IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488, # A-11006
נוגדן משני 555	Thermofischer	עז נגד חזיר ניסיונות IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 555, # A-21435
נוגדן משני 647	Thermofischer	Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 647, # A-21245
סורק שקופיות	Olympus	VS120
Snapfrost		Excilone סכין דקירה Snapfrost
	Fine Science Tools	10316-14
חוט תפר עור	Ethicon	Vicryl 2-0
חוט תפר dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0
חוט תפר לצנתר	Ethicon	Vycril 3-0 ללא מחט
חוט תפר להרמת dura	Ethicon	Prolene 6-0 עם מחט
חוט תפר תת עורי	Ethicon	Vicryl 4-0
גשר טיטניום	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	גזר את הגודל הנדרש
ברגי טיטניום	מדטרוניק	9001635, 9001640
מערכת רנטגן	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm