העין מכילה חומר שקוף חסר כלי דם, כולל הקרנית, עדשת העין והזגוגית. האור חייב לעבור דרך המדיה הזו לפני שהוא מגיע לקולטני האור בחלק האחורי של הרשתית. באופן ספציפי, הקרנית, עדשת העין והזגוגית חסרים כלי דם על מנת למנוע ספיגת האור ועיוות התמונות1. כלי הדם ברשתית מאורגנים בשלוש שכבות: השכבה השטחית, המשתרעת מהדיסק האופטי לפריפריה בתוך שכבת סיבי העצב; השכבה האמצעית, שנמצאת בתוך שכבת הפרספקס הפנימית; והשכבה העמוקה, המופצת דרך שכבת הפרספקס החיצונית. רשת כלי דם זו מספקת דם לרשתית הפנימית, בעוד קולטני האור מסופקים על ידי דיפוזיה מכלי הדם הכורואידליים. ההזנה של הרשתית הפנימית והחיצונית נשלטת בקפדנות על ידי מחסומי הדם-רשתית הפנימיים והחיצוניים (BRBs). תאי אנדותל רשתית, פריציטים ותאי גליה מהווים את ה-BRB הפנימי. מצד שני, תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), תאי אנדותל כורואידליים וקרום ברוך יוצרים את ה-BRB החיצוני. שינויים פתולוגיים בכלי הדם ברשתית הם סימני ההיכר של מספר מחלות רשתית, כגון רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל ורטינופתיה של פגות. שינויים פתולוגיים אלה כוללים אך אינם מוגבלים לדלקת בכלי הדם, פירוק ה-BRB, ניוון נימי, שינויים בזרימת הדם ברשתית וניאו-וסקולריזציה פתולוגית של הרשתית (RNV)2,3,4. לכן, חשוב לפתח שיטות יעילות לחקר השינויים הללו הן in vivo באמצעות חיות ניסוי והן במבחנה על ידי תרבית תאי רשתית שונים בתנאים דומים לסביבה הביולוגית והביוכימית במחלות אנושיות. חוקרים יכולים להשתמש במספר גישות ניסיוניות כדי לנתח את המנגנונים המולקולריים והתאיים הבסיסיים של מחלות כלי דם ברשתית. מטרת אוסף השיטות היא לחלוק עם חוקרים אחרים את המומחיות של מדעני ראייה ורופאי עיניים במונחים של שיטות לחקר התפתחות תקינה של כלי הדם והפרעות בכלי הדם במחלות רשתית שונות.
המאמר של Damsgaard et al. מציג שיטת אולטרסאונד משופרת זרימה המאפשרת לחוקרים לדמות את כלי הדם בעין בתלת מימד ללא שימוש בחומרי ניגוד5. שיטה זו מתגברת על מגבלות של שיטות אחרות בשל יציבותה בהדמיית העין מאחורי הרשתית הפיגמנטית. למרות שהשיטה הודגמה בדגי זהב, ניתן ליישם אותה על כל מיני הניסוי האחרים עם כדוריות דם אדומות גרעיניות. שיטה זו חשובה להדמיית כלי הדם בעיניים בתנאים נורמליים ופתולוגיים ויכולה להועיל בחקר זרימת הדם בעין. עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי היעדר תאי דם אדומים גרעיניים ביונקים. לפיכך, בהשוואה למינים עם כדוריות דם אדומות גרעיניות, האולטרסאונד המשופר מייצר ניגודיות בזרימת הדם רק ביונקים. יתר על כן, שיטה זו רגישה לרעשי תנועה, כגון מתנועות נשימה, שעלולות ליצור תמונות וחפצים מטושטשים. ניתן לכוונן רעש תנועה זה על ידי שער פרוספקטיבי או רטרוספקטיבי. עבור רכישות דו-ממדיות ותלת-ממדיות כאחד, חיוני להגביל את חפצי התנועה הנגרמים על ידי תנועת החיה עקב הרדמה לא מספקת או על ידי מערך מתמר לא יציב. פיתוח טכניקה זו סולל את הדרך לבדיקה לא פולשנית in vivo של רשתות כלי הדם העמוקות בעין ברוב המכריע של בעלי החוליות המחזיקים באריתרוציטים גרעיניים.
השיטה שהוצגה על ידי Macouzet-Romero et al. מעריכה את התרומה היחסית של כלי הרשתית לצפיפות הזלוף המקולרי באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)-אנגיוגרפיה6. שיטה זו מאפיינת את הפרופורציה של אזור עם זרימה מכלים מורחבים. יש לציין כי הרחבת כלי דם יכולה להיות תגובה למצבים פתולוגיים. גישה זו יכולה להתוות בעקיפין הרחבת כלי דם ולזהות בעקיפין חמצון נמוך במחלות כלי דם ברשתית, כגון רטינופתיה סוכרתית (DR), חסימת ורידים מרכזיים או ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). באמצעות שיטה זו, הממצאים העיקריים של Macouzet-Romero et al.6 היו שתרומתם של כלי דם גדולים מנימי הרשתית למחזור הרשתית הייתה 18.2% בנבדקים בריאים. לפיכך, אחוז זה יכול לשמש כהתייחסות לזיהוי שינויים מוקדמים בצפיפות הזלוף עקב מחלות כלי דם ברשתית. לדוגמה, אחוז התרומה היה 2.6% בחולים עם יתר לחץ דם עורקי ו-16.4% בחולים עם סוכרת, מה שמצביע על כך ששיטה זו יכולה לשמש להערכת התקדמות מחלות רשתית הקשורות להפרעות בכלי הדם.
השיטה המוצגת על ידי Subirada et al. מעריכה פרמטרים שונים של שינויים בכלי הדם (מידת ניוון הנימים [אזורי כלי הדם], ניאו-וסקולריזציה פתולוגית של הרשתית [אזורים ניאו-וסקולריים], התרחבות ופיתול של עורקי הרשתית) במודלים ניסיוניים של רטינופתיה איסכמית, כגון רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR)וסוכרת ניסיונית.. יש לציין כי OIR משחזר רטינופתיה של פגות והיבטים מסוימים של רטינופתיה סוכרתית פרוליפרטיבית. היכולת לכמת את היקף הניאו-וסקולריזציה של הרשתית (RNV) או ניוון נימי במודלים ניסיוניים היא קריטית לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים הבסיסיים, כמו גם לבדיקת ההשפעות הטיפוליות האפשריות של התערבויות תרופתיות או מולקולריות. לסיכום, מאמר זה מציג טכניקות קלאסיות, מבוססות וניתנות לשחזור לכימות כמה מהפרמטרים הוסקולריים הרלוונטיים ביותר הנחשבים בפרקטיקה הקלינית.
המאמר של Vaglienti et al. מציג שיטות למדידת רמות מיני חמצן תגובתיים (ROS) בתאי גליה של מולר8. התפקיד של מתח חמצוני בתפקוד לקוי של כלי הדם ברשתית ברטינופתיה איסכמית הוכח ועודד חוקרים לחקור את המידה שבה מיני חמצן תגובתיים (ROS) תורמים לפירוק ה-BRB וה-RNV הן in vivo והן in vitro 9,10,11,12. Vaglienti ואחרים משתמשים ב-2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFD) כדי להעריך את רמות הייצור התוך תאי של מיני חמצן תגובתיים (ROS). שיטה זו מבוססת על דיפוזיה של DCFD לתוך התא ולאחר מכן חמצון של DCFD על ידי ROS ל-2', 7' –דיכלורופלואורסצאין (DCF). DCF הוא פלואורסצנטי מאוד וניתן לזהות אותו על ידי ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לדמות ולמדוד את רמות יצירת ה-ROS הן בתאי הרשתית והן ברקמות.
המאמר של Tomaszewski et al. מדגים את הבידוד והצמיחה של תאי אפיתל פיגמנט רשתית של עכבר (RPE)13. תאי RPE תורמים ל-BRB החיצוני וממלאים תפקיד חיוני בהמוסטזיס ובשלמות קולטני האור. תפקוד לקוי של תאי RPE הוא סימן היכר של מחלות רשתית שונות, כולל אך לא רק AMD ו-DR. לפיכך, מחקרי מבחנה של תפקוד תאי RPE בבריאות ובמחלות הם קריטיים להבנת המנגנונים המולקולריים והתאיים של מספר מחלות רשתית כלי דם. למטרה זו, בידוד ראשוני של תאי RPE יכול להיות כלי חשוב לחקר המנגנונים והפתוגנזה הבסיסיים של מחלות עיניים שונות, כמו גם להצעת יישומים טיפוליים חדשים למחלות אלה. טכניקה זו מאפשרת לחקור שינויים במבנה ובתפקוד של תאי RPE והשפעתם על ה-BRB החיצוני ב-AMD ו-DR. יתר על כן, ניתן ליישם את הטכניקה כדי לחקור שינויים בתאי RPE שבודדו מעכברי C57BL6 מסוג בר ועכברים שונים מהונדסים גנטית ולבחון תרכובות פרמקולוגיות שונות כמטרות טיפוליות ל-AMD14.
המאמר של אלמסרי ועמיתיו מציג מודל ניסיוני ex vivo שניתן להשתמש בו לחקר מחלות רשתית נוירו-וסקולריות על ידי תרבית אקספלנטים ברשתית לתקופה ממושכת15. במערכת ex vivo זו, אקספלנטים ברשתית מציגים רשתות כלי דם וגליה שלמות ונוירונים ברשתית עד שבועיים בתרבית. צמחי רשתית אורגנוטיפיים התגלו ככלי אמין לחקר מחלות רשתית, כגון DR ומחלות רשתית ניווניות16,17. בהשוואה לטכניקות אחרות הקיימות, השימוש באקספלנטים ברשתית תומך הן בתרביות תאי רשתית במבחנה והן במודלים של בעלי חיים in vivo על ידי הוספת תכונה ייחודית המאפשרת לבחון את הדיבור בין תאי רשתית שונים (למשל, תאי כלי דם, גליה ותאי עצב) תחת אותם פרמטרים ביוכימיים וללא תלות במשתנים מערכתיים. תרביות האקספלנט שומרות על תאי רשתית שונים יחד באותה סביבה ושומרות על האינטראקציות הפיזיות והמולקולריות הבין-תאיות. יתר על כן, מחקרים הראו כי צמחי רשתית יכולים לשמר את המבנה המורפולוגי והפונקציונליות של תאי הרשתית המתורבתים. לסיכום, אקספלנטים ברשתית יכולים לספק פלטפורמה מתאימה לחקירת הדיבור בין תאי רשתית שונים בתגובה לשינויים ביוכימיים, כגון היפרגליקמיה והיפוקסיה, בדומה לאלו שנצפו ברטינופתיה סוכרתית (DR) או רטינופתיה של פגות (ROP). גישה זו מאפשרת גם בדיקה של התערבויות טיפוליות בסביבה ביוכימית מוגבלת. תרבית אקספלנט רשתית מייצגת טכניקה ניתנת לשליטה ומודל ניסיוני גמיש מאוד המאפשר מניפולציות פרמקולוגיות רבות ויכול לחשוף מספר מנגנונים מולקולריים של מחלות רשתית.