$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
בעלי חיים הם מערכות מורכבות ביותר המורכבות ממאות סוגי תאים שונים המאורגנים בעשרות רקמות ואיברים נפרדים. חקר האופן שבו קבוצות תאים מתקשרות זו עם זו ועם סביבתם במהלך ההתפתחות העוברית לא רק נותן לנו הבנה טובה יותר של האופן שבו גופים בוגרים בנויים, אלא יכול גם לחשוף את היסודות המולקולריים והתאים של מחלות ומומים מולדים. מערכות מודלים מסוימות מתאימות יותר לטיפול בשאלות ביולוגיות ספציפיות מאחרות, ומדענים משתמשים במגוון רחב של מינים וטכניקות ניסוי כדי לחקור את המגוון המלא של הביולוגיה האורגניזמית. לדוגמה, ניסוי נתון בביולוגיה התפתחותית עשוי לכלול הנדסה גנטית, נתיחות של בעלי חיים, ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. שיטות כאלה יכולות להיות מאתגרות לשחזור על סמך תיאורים ודמויות כתובות בלבד, ולכן חשוב לתעד אותן בצורת וידאו כדי לטפח את הפצת הטכניקה ושיטות הניתוח המתאימות.
הקשר בין מנגנוני התפתחות והתחדשות, במיוחד במערכת העצבים, הוא תחום עניין רב, ודג הזברה, Danio rerio, הפך למודל מפתח בתחום זה בשל יכולות הצמיחה וההתחדשות שלו לאורך כל חייו. יש לציין כי קיים יחסי גומלין מורכבים בין תאים ברשתית לבין הטקטום האופטי, ואינטראקציה זו נחוצה ליצירת קשרים תקינים כאשר נוירונים חדשים מתווספים לעיניים ולמוח1. האגן ועמיתיו מתארים טכניקה לאפיון האופן שבו צמיחה והתפתחות עצבית מושפעות מניתוק עצבים לאחר הסרת עיניים בעוברי דג זברה חיים2. הם מתארים בפירוט כיצד 1) לבצע ניתוח להסרת עיניים, 2) לתרבית זחלים לאחר הניתוח, 3) לתקן, לנתח ולאחסן את דגימות המוח, 4) לבצע אימונופלואורסצנטיות, ו-5) להרכיב ולדמות כראוי את הדגימות. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור מגוון רחב של תהליכים נוירו-התפתחותיים ברקמות קבועות, וניתן להתאים אותה גם לניסויים בעוברים חיים.
תאי פסגה עצבית (NCCs) מייצגים שושלת התפתחותית חשובה המולידה תאי פיגמנט, סחוס, עצם, שריר חלק, נוירונים וגליה, ותאים אלה מעורבים בסוגים רבים של מומים מולדים3. בנוסף לפלוריפוטנטיות המרשימה שלהם, NCCs עוברים גם מעבר אפיתל למזנכימלי ואחריו נדידה נרחבת במהלך ההתפתחות, מה שהופך אותם לפרדיגמה מרתקת להבנת יחסי הגומלין בין גורל התא למורפולוגיה4. עוברי אפרוח הם מערכת רבת עוצמה לחקר הביולוגיה של NCC, מכיוון שניתן לדמיין NCCs in vivo ולתרבת ex vivo, ובכך לאפשר סוגים רבים של טיפולים מולקולריים הקשים עם מערכות אחרות. ז'אק-פריק ועמיתיו מתארים שיטה גמישה לתרבית קפלים עצביים גולגולתיים ליצירת תרביות NCC ראשוניות על כיסויים מצופים פיברונקטין, ולאחר מכן ניתן לבצע ניסויי הדמיה קבועה או הדמיה חיה5. הם מתארים כיצד 1) לדגור ולבודד את העוברים, 2) לנתח ולצלחת את הקפלים העצביים, 3) לתקן ולהכתים את ה-NCC, ו-4) לכמת ולנתח את המורפולוגיה של NCC.
קרום הבסיס - מטריצה חוץ-תאית הנוצרת לאורך פני השטח הבסיסיים של תאי אפיתל - הוא קריטי לביסוס מורפולוגיה של רקמות ותפקוד איברים בקרב בעלי חיים6. האפיתל הזקיקי של דרוזופילה , המקיף את הביצה היוצרת, הוא מודל מצוין לחקר אופן היווצרות ממברנות הבסיס, מכיוון שהוא מפריש את כל המרכיבים השמורים העיקריים של קרום הבסיס7, והמטריצה מכוונת לכיוון "החלק החיצוני" של תא הביצים, ובכך מקלה על ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה8. שאה ודוורגן מתארים את השימוש באחד הסוגים הפופולריים ביותר של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה - Airyscan - כדי לבחון כיצד סחר בשלפוחית משפיע על היווצרות קרום הבסיס9. הם מראים כיצד 1) לאסוף ולתקן שחלות דרוזופילה , 2) לבצע אימונופלואורסצנטיות, 3) להרכיב כראוי את הדגימות ו-4) ללכוד מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה לניתוח תלת מימדי. נציין כי מאמר זה כולל הדרכה שימושית ותמציתית ביותר על רכישה נכונה של מערכי נתונים קונפוקליים תלת מימדיים לא רוויים, שאמורים להיות בעלי עניין כללי לכל מי שרוצה לכמת תמונות פלואורסצנטיות.
בעוד שטכנולוגיות סופר-רזולוציה מבוססות מיקרוסקופ (למשל, STED, SIM ו-Airyscan)10 הופכות נפוצות יותר ויותר, הן יקרות יותר ממיקרוסקופים קונפוקליים סטנדרטיים ואינן זמינות לכל החוקרים. טכניקה חלופית להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה היא מיקרוסקופ הרחבה (ExM), הכוללת הגדלה פיזית של דגימה ביולוגית בתלת מימד על ידי הטמעה וקשירה להידרוג'ל11 מתנפח. לאחר מכן ניתן לדמיין את הדגימות המורחבות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי כדי ליצור תמונות ברזולוציה רוחבית בסדר גודל של עשרות ננומטרים, המתחרה בסוגים אחרים של מיקרוסקופיה ברזולוציהגבוהה 12. הקבוצה שלנו מתארת כיצד ליישם ExM בעוברי דרוזופילה שלמים כדי לחשוף מאפיינים תת-תאיים של שלד התא של האקטומיוזין ורשתות המיטוכונדריה שאינם ניתנים לזיהוי במיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית13. אנו מתארים כיצד 1) לבחור עוברים בשלבים מתאימים, 2) לבצע אימונופלואורסצנטיות, 3) להכין ולהרכיב את העוברים להרחבה, 3) לעכל ולהרחיב את העוברים, ו-4) לאסוף מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה. טכניקה זו צריכה להיות ניתנת לשינוי עבור מגוון רחב של דגימות ביולוגיות בסדר גודל של 1 מ"מ, מה שהופך אותה לנגישה למגוון רחב של מעבדות ביולוגיה.
ביולוגיה התפתחותית היא, בהכרח, תחום המצאתי וחוצה תחומים המסתמך על טכניקות מתחומים מדעיים מגוונים כדי לכמת את הביולוגיה של התא כפי שהיא מתרחשת בבעלי חיים. כאן, אנו מדגישים ארבע שיטות ביולוגיה התפתחותית בדג הזברה, האפרוח וזבוב הפירות הכוללות טכניקות קלאסיות ומתקדמות לחקירת מורפולוגיה של תאים ולוקליזציה של חלבון תת-תאי במהלך התפתחות בעלי חיים. נכון לעכשיו, התחום מתמקד במיזוג ניתוחים כמותיים של מורפולוגיה והתנהגות תאים עם ניסויים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים כדי לחשוף את המגוון המלא של מולקולות וכוחות ביומכניים השולטים בהתפתחות בעלי חיים.