מאמר שיטה

מערכות ביטוי ללא תאים: שיטות ייצור ושימוש

393 צפיות

⸱

28 ביולי 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

במאמר זה

תקציר

מאמרים שנדונו:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot מערכת נטולת תאים טהורה. כתב העת לניסויים חזותיים. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. מתאים לסינתזה של חלבון ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים. כתב העת לניסויים חזותיים. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליזאט ללא תאים חיידקיים. כתב העת לניסויים חזותיים. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. שיטות אנזימטיות מהירות להגברה של תבניות מינימליות וליניאריות ליצירת אב טיפוס של חלבונים באמצעות מערכות נטולות תאים. כתב העת לניסויים חזותיים. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. אפיון מהיר של חלקים גנטיים עם מערכות נטולות תאים. כתב העת לניסויים חזותיים. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. ערכת כלים לתרגום שעתוק סטרפטומיצס בעלת תפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים. כתב העת לניסויים חזותיים. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לפרופיל מטבוליט במערכות נטולות תאים מבוססות ליזאט. כתב העת לניסויים חזותיים. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. הכנת מיקרו-קפסולות רב תכליתיות מבוססות משי עמוסות בפלסמידים של DNA המקודדים אפטמרים RNA ומתגי ריבו. כתב העת לניסויים חזותיים. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. תכנון ליישום מחקר לפיתוח ואימות מטופלים של אבחון מתג אחיזת אצבע מבוסס נייר. כתב העת לניסויים חזותיים. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

מאמר מערכת

מערכות ביטוי ללא תאים (CFE) הן חבילת כלים המרכיבים מחדש את תהליכי התא העיקריים של שעתוק, תרגום וחילוף חומרים מחוץ לגבולות התא1. שיטות כאלה גדלו במהירות בפופולריות על ידי הצעת ניסויים פשוטים באמצעות הסרת ממברנות התאים ומורכבות מופחתת באמצעות הסרת DNA גנומי והמורכבות המקבילה של אינטראקציות בין מבנה גנטי למארח. מערכות CFE משמשות כיום למחקר בסיסי, חישה, ייצור ביולוגי וחינוך. אוסף שיטות זה מציג תשע דוגמאות לדרכים חדשות לייצר ולהשתמש במערכות נטולות תאים.

שלוש מהשיטות מתמקדות בהפיכת הייצור של מערכות נטולות תאים לנגיש יותר. Grasemann ואחרים מתארים דרך קלה יותר ליצור את מערכת PURE, מערכת CFE המשחזרת את כל הרכיבים הנדרשים לשעתוק ותרגום, במקום להשתמש בליזטים תאיים2. במקום לבטא ולטהר כל אחד מ-36 מרכיבי החלבון, המחברים מאגדים את זני הביטוי, ומציעים ייצור של מערכת PURE פונקציונלית תוך שבוע. סמית ועמיתיו מציעים תהליך פשוט לייצור מערכות CFE מבוססות ליזאט באמצעות גישת תרבות יעילה המקצרת את זרימת העבודה הכוללת ל-24 שעות, הניתנת להשגה בשעות העבודה הרגילות3. קופר ועמיתיו מתארים שיטה המשתמשת בזן E. coli שונה המאפשר ליזה של תאים על ידי הקפאה-הפשרה, ומבטל את הצורך בציוד מיוחד הנדרש בשיטות אחרות4. כל השיטות הללו תורמות למגמה של מאמצים להפוך את הייצור של מערכות נטולות תאים להשגה על ידי מעבדות עם פחות תשתית ומומחיות בפרוטוקולים המסורתיים המורכבים. עם הזמינות של ערכות מסחריות מתחרות, יותר ויותר מעבדות יכולות לחקור את היתרונות של מערכות CFE עם סיכון מועט. עם שיטות כמו אלה המוצגות כאן, מעבדות אלה יכולות לבחור לייצר מערכות CFE משלהן המותאמות לצרכיהן ללא השקעה עצומה בציוד או בזמן.

שתי שיטות מתמקדות ביתרונות של ניסויים מהירים ותפוקה גבוהה האפשריים במערכות CFE. Dopp et al. מציגים שיטה להגברת תבניות DNA ליניאריות לסינון מהיר של מבנים גנטיים5. באמצעות הגישה שלהם, ניתן להזמין עיצובים גנטיים מחברות סינתזת DNA ולאחר מכן להגביר ולסנן תוך 24 שעות. מקמנוס ועמיתיו מתארים גישה דומה לפיה גן מדווח מוגבר עם פריימרים משתנים המקודדים לרכיבים רגולטוריים שונים6. העלות הנמוכה של אוליגוס בשילוב עם מערכות CFE מאפשרת סינון מהיר וחסכוני של רכיבים כגון מקדמים. שתי השיטות מדגישות את הפוטנציאל של מערכות CFE לניסויים מהירים, ומפחיתות את לוחות הזמנים לתכנון ובדיקה של מבנה משבועות באמצעות שיבוט מסורתי לימים או אפילו שעות.

שלוש השיטות הבאות מספקות כלים לשימושים מיוחדים במערכות CFE. Toh et al. מציעים שיטה ליצירת מערכות CFE מ - Streptomyces venezuelae7. רוב פרוטוקולי CFE מבוססים על E. coli, כולל כל השיטות האחרות באוסף זה. שיטה חדשה זו עבור S. venezuelae מביאה את היתרונות של מערכות CFE לאורגניזם בעל עניין נרחב לייצור מוצרים טבעיים. Dinglasan et al. מספקים דרך למדוד ריכוזי מטבוליטים בתגובות נטולות תאים8. מדידות כאלה הן קריטיות ליישומים בהנדסה מטבולית נטולת תאים, שבה חילוף החומרים השלם של מערכות CFE משמש לייצור מוצרים שאינם חלבונים מעניינים. שלישית, Drachuk ואחרים מציגים מיקרו-אנקפסולציה של DNA לתוספת לתגובות CFE9. גישה זו מייצגת מערך של טכניקות המאפשרות להכניס מחדש את יתרונות המידור באופן רציונלי למערכות CFE לאחר הסרת ממברנות טבעיות במהלך ייצור מערכות CFE. כל אחת מהשיטות הללו מגוונת את מגוון היישומים שניתן ליישם עליהם מערכות CFE.

לבסוף, ג'יינס ועמיתיו מתארים שיטות להפקת אבחון בעולם האמיתי לנגיף זיקה המבוסס על מערכות CFE10. הבדיקות והמכשור הם בעלות נמוכה בהשוואה לטכנולוגיות מתחרות כגון PCR, והמחברים בדקו בהצלחה את האבחון שלהם באמצעות דגימות מטופלים במספר מדינות. עבודה זו היא דוגמה חזקה ליישומי חישה בנקודת הצורך, וזה אולי התחום שבו מערכות CFE עומדות להשפיע בצורה המיידית ביותר בעולם האמיתי.

כאוסף, שיטות אלה לוכדות רצועה מייצגת של תחומי המחקר העיקריים במערכות CFE בשנים האחרונות. השיטות המשפרות את הייצור של מערכות CFE ומאפשרות ניסויים בתפוקה גבוהה מיוצגות היטב, וקיימות דוגמאות לשימושים ספציפיים רבים יותר במערכות CFE. תחומי עניין נוספים כוללים ייצור חלבונים מורכבים ליישומים רפואיים, שילוב חומצות אמינו לא קנוניות, אופטימיזציה לאחסון לטווח ארוך ופיתוח תאים מלאכותיים. אנו צופים כי האימוץ של מערכות CFE ימשיך להאיץ בהתחשב במחסום הכניסה המופחת, הפוטנציאל לניסויים מהירים ומגוון רחב יותר של יכולות, הכל מתאפשר על ידי שיטות כמו אלה המוצגות באוסף זה. האתגרים הנותרים תלויים במרחב היישום. עבור ייצור ביולוגי, הפחתת עלויות בקנה מידה על ידי מעבר למצעים זולים יותר ומיחזור משופר תהיה קריטית. עבור חישה, נדרשת עבודה משמעותית המבוססת על הדוגמה של Jaenes et al. כדי להדגים ביצועים חסונים ביישומים שונים של נקודת הצורך. באופן כללי, התחום צריך להמשיך ולחדד טכניקות ליבה תוך הרחבת הרפרטואר של מה שניתן לעשות עם מערכות CFE.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לתוכנית המחקר היישומי לקידום סדרי עדיפויות של מדע וטכנולוגיה של משרד מזכיר ההגנה על תמיכתה בשיתוף הפעולה שהוביל לאוסף זה.

מקורות

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

מאמרים קשורים