$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) היא מחלה ניוונית הרסנית הפוגעת בערך ב-1 מכל 400 אנשים במהלך חייהם. המחלה מתבטאת בתחילה כפגיעה בנוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים ובסופו של דבר מתקדמת לשיתוק ומוות כתוצאה מאי ספיקת נשימה תוך 2-5 שנים מהופעת התסמינים1. ALS יכולה להיות תורשתית, עם למעלה מ-30 מוטציות גנטיות שונות, אך רק 4 וריאנטים גנטיים (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) מהווים כ-55% מה-ALS המשפחתי. רוב מקרי ה-ALS, כ-90%, מייצגים ALS ספורדי, שהגורמים המובילים לו עדיין לא מובנים במלואם2. יש צורך דחוף לפענח את המנגנונים של ALS על ידי שימוש בכלים המתאימים ובאורגניזמים מודלים. באוסף שיטות זה, אנו מספקים סקירה כללית של התקדמות המחקר האחרונה במונחים של חיקוי מחלה זו, ובתקווה, בסופו של דבר מציאת אפשרויות טיפול. לדוגמה, היישום של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שניתן להתמיין לנוירונים מוטוריים או אסטרוציטים מציע מערכת מודל אנושית 3,4,5. בנוסף, באוסף שיטות זה מוצגים מודלים של בעלי חיים, כגון Drosophila לחקר ספיגת הגלוקוז והצומת העצבי-שרירי (NMJ) in vivo 6,7, עכברים לחקר נוירונים בקליפת המוח8, ו-C. elegans או דג זברה לחקירת ליקויים מוטוריים 9,10 ורקמת מטופל לאחר המוות11.
זחלי דג הזברה שקופים, והנוירונים המוטוריים שלהם נראים ישירות, מה שהופך אותם לכלי מושלם למחקרים לא פולשניים in vivo . Asakawa ואחרים מראים את מעבר הפאזה של TDP-43 המתבטא אופטוגנטית בנוירונים מוטוריים בודדים בעמוד השדרה9. לאחר ההקרנה, ניתן לצפות ולנתח את המעבר הציטופלזמי של TDP-43. הצטברות של TDP-43 ציטופלזמי היא סימן היכר של נוירונים מוטוריים מנוונים ב-ALS. שיטה זו מאפשרת מחקר פונקציונלי וניתוח של חלבונים הקשורים ל-ALS באופן תת-תאי וזמני.
תוך שימוש במיקרוסקופ תאורה מובנית ברזולוציה גבוהה (SIM), קוין ורוטשטיין מפרטים פרוטוקול המבודד את הגרעינים ומתארים כיצד לחקור קומפלקסים של נוקלאופורין11. קומפלקסים של נוקלאופורין מורכבים ממספר עותקים של כ-30 חלבוני נוקלאופורין שונים (Nups). פגיעה בהובלה נוקלאוציטופלזמית (NCT) ושינויים ב-Nup הוכחו כסימני היכר מוקדמים של מחלות ניווניות רבות, כולל ALS. על ידי חילוץ הגרעינים, ניתן לחקור את חלבוני ה-Nup הבודדים בתוך ה-NPC והנוקלאופלזמה בתלת מימד. מעניין שניתן ליישם זאת לא רק על תאים שמקורם ב-iPSC אלא גם על רקמות שלאחר המוות.
קארי וליאצ'קו מתארים שתי בדיקות להבחנה בין ליקוי מוטורי קל, בינוני וחמור במודלים של C. elegans של ALS10. בבדיקת התנועה הרדיאלית נמדדת זחילה על משטח, מה שהופך אותה לבדיקה קלה וחסכונית. בשיטה השנייה שלהם, מבחן השחייה, ניתן למדוד תנועות חבטה באמצעות שיטת מעקב מבוססת מחשב. המחברים משתמשים בזה כדי לחקור TDP-43 וטאו.
הייז ועמיתיו מתארים גם שיטה לחקר NCT8. הם מיישמים שיטת חדירה על תרביות עצביות. באמצעות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של העכבר, הם מתארים שיטה השומרת על שלמות הממברנה הגרעינית על ידי שימוש בליזה היפוטונית בשילוב עם כרית אלבומין בסרום בקר. על ידי כך, יבוא גרעיני עדיין מתפקד באופן תלוי אנרגיה, ובכך מספק פלטפורמת מיקרוסקופיה וניתוח בעלת תוכן גבוה. לפלטפורמה זו תהיה ישימות רחבה בעתיד לחקר הובלה גרעינית פסיבית ואקטיבית בתאי עצב ראשוניים.
ההערכה המהירה של האופן שבו מניפולציה, חלבונים הקשורים למחלה או RNA משפיעים על תהליכים סינפטיים והאם תרופות טיפוליות יכולות לשחזר תפקודים אלה חיונית לחקר ALS. באמצעות נוירונים מוטוריים שמקורם ב-iPSC כמו גם נוירונים ראשוניים מעכברים, קרישנמורטי ועמיתיו מציגים פרוטוקול המאפשר ניטור בזמן אמת של דינמיקת זרימת סידן פרה-סינפטית ואיחוי קרום שלפוחית סינפטית3. המחברים מדגימים כי טרנספקציה C9orf72-(GA)50 פוגעת בהעברה סינפטית, ומדגישים את התאמתן של שיטות אלה לאיתור הבדלים מבוססי מוטציות בתפקוד הסינפטי.
ספיגת גלוקוז משתנה היא אחד המאפיינים הפתוביולוגיים של ALS. במודל דרוזופילה זה, לוגנתן ועמיתיו מתארים שיטה מבוססת FRET למדידת שינויים תוך-תאיים בספיגת הגלוקוז בתאים ספציפיים6. באמצעות חיישן FRET של גלוקוז מקודד גנטית, הם מאמתים את השיטה שלהם עם נוירונים לביטוי TDP-43, המציגים ספיגת גלוקוז גבוהה יותר. בקו המוטציות TDP-43G298S , ספיגת גלוקוז מוגברת ניתנת לזיהוי רק עם גירוי גלוקוז. שיטה זו מספקת כלי חשוב לחקר גליקוליזה לא רק ב-ALS אלא גם באופן כללי ביחס להתחדשות נוירונים מוטוריים.
טכניקות דיסקציה המשמרות את ארכיטקטורת NMJ הן בעלות חשיבות עליונה לחקר שינויים בתאי העצב המוטוריים לאורך רגל הדרוזופילה לאורך זמן. סטילוול ואגודלו משתמשים בטכניקה המאפשרת אפיון של NMJ לזיהוי סוכות נוירונים מוטוריים באמצעות אימונוציטוכימיה7. מעניין שהנוירונים הבוגרים נוכחים לאורך כל חייו של זבוב, שהם כ-90 יום. בהשוואת מוטציה SOD1H71Y לסוג הבר, המחברים מדגימים סמנים שונים לנפיחות בוטונית תלוית גיל, אגרגטים של חלבונים ומיטוכונדריה מוגדלת.
החידוש של חיקוי NMJ באמצעות מערכת קו-תרבית עונה על הצורך הדחוף לחקור את הדיסוציאציה בין נוירונים מוטוריים לשרירי שריר. במונחים של שיטה זו, Stoklund Dittlau et al. מתארים כיצד לטפח נוירונים מוטוריים אנושיים שמקורם ב-iPSC ו-myotubes ראשוניים אנושיים שמקורם במזואנגיובלסטים כדי ליצור NMJs פעילים מבחינה תפקודית4. המחברים מראים את הפונקציונליות שלהם על ידי הפעלת נוירונים מוטוריים עם זרם אשלגן כלורי וסידן ב-myotubes המסומנים ב-Fluo-4 לאחר מכן, אשר בוטל על ידי מתן חוסמי NMJ.
לאחרונה, מערכות תרבות משותפת זכו לתשומת לב הולכת וגוברת. לחקר לא רק סוג תאים אחד אלא מספר סוגי תאים בצלחת יש יתרון בחיקוי תנאים פיזיולוגיים טוב יותר משיטות המשתמשות בתאים חד-תרבותיים. ניתן לחקור פתוביולוגיה הקשורה ל-ALS, כגון רעילות מתווכת אסטרוציטים וריגוש יתר עצבי, באמצעות גישה זו. בסרטון של Taga et al., הדור של נוירונים ואסטרוציטים בקליפת המוח בתרבית משותפת בשילוב עם מערך מרובה אלקטרודות (MEA) מוצג לניטור אלקטרופיזיולוגיה5. ניתן לעקוב אחר הפעילות התפקודית לאורך זמן, מה שמאפשר גמישות בהרכב התאים כמו גם בתנאי תרבית שונים. זה מספק בנוסף פלטפורמה לבדיקת הפוטנציאל הטיפולי של תרופות והשפעתן על הפעילות התפקודית.
נכון לעכשיו, ישנם רק שלושה טיפולים שאושרו על ידי ה-FDA ל-ALS, כולם עם פוטנציאל יישום מוגבל. כדי למצוא טיפולים מבטיחים יותר, מחקר עתידי חייב להבין טוב יותר את הפתוביולוגיה על ידי שימוש במערכות מודלים וגישות מרובות. ללא ספק, מודלים אנושיים שמקורם ב-iPSC יספקו פלטפורמה מעניינת לחקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים. זה, בשילוב עם מערכות מודלים כמו דג זברה, C. elegans, דרוזופילה או מכרסמים, יוביל להתקדמות בתחום. יתר על כן, יש לקוות שמחקר אפידמיולוגי עתידי יספק תובנות נוספות לגבי האופן שבו גורמים סביבתיים ממלאים תפקיד בהתפתחות ALS12. עם התרחבות מערכי הנתונים והביואינפורמטיקה המתפתחים במהירות גבוהה, יהיה קל יותר לפענח את המכנים המשותפים של מחלות נוירודגנרטיביות בעתיד. זה יוביל לאפיקים חדשים לטיפול או אפילו למניעה.