$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
עוד לפני הענקת פרס נובל לשנת 2017 על מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryoEM) של מולקולות ביולוגיות, התחום עורר התרגשות. מהפכת הרזולוציה הייתה בעיצומה, והביולוגיה המבנית חיפשה את cryoEM כשיטת אפיון המתקרבת לתקן הזהב של קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן1. בשלב מוקדם, תחום ה-cryoEM כלל בעיקר נתונים שנוצרו על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים להעברת קריו (cryoTEMs). כעת, ככל שהתקדמו המיקרוסקופים, מכשירי הכנת הדגימות ושיטות הכנת הדגימות, סוגי הנתונים שנוצרו הפכו מגוונים יותר. CryoEM כבר לא שמור לאפיון חלבונים על ידי cryoTEM. התחום גדל וכולל כעת נתונים שנוצרו ממיקרוסקופי אלקטרונים סורקים בהקפאה וקרן יונים ממוקדת (cryoSEM/FIB). ההשפעה מורגשת באופן נרחב יותר במספר דיסציפלינות, כולל מחקר הדמיה על מולקולות, תאים, רקמות וחומרים סינתטיים כגון הידרוג'לים.
התקדמות ביכולות ההדמיה הייתה כוח מניע בפיתוח cryoEM. שיפורים במצלמות, גלאים ועיבוד תמונה סללו את הדרך להדמיה עם פחות קלט אנרגיה, מה שמאפשר לדגימות ביולוגיות עדינות לשרוד את תהליך ההדמיה. ב-TEMs, החשיפה לאלומה במינון נמוך תורגמה ליישום של טומוגרפיה שבה דגימה בודדת מצולמת שוב ושוב במספר זוויות כדי ליצור שחזור תלת מימד 2,3. ההתקדמות ב-SEM/FIB הביאה גם לרזולוציה משופרת תוך שימוש בפחות אנרגיה. חשוב לציין, זה הוביל להדמיה משופרת של דגימות לא מוליכות, מה שמתורגם להדמיה בנפח טוב יותר ב-SEM/FIBs 4,5. שיפורים אלה קידמו את כל הדמיית המיקרוסקופ האלקטרונים הביולוגית, אך הם שיפרו במיוחד את הדמיית הקריו, שבה הדגימות עדינות ואין בהן מתכות כבדות נוספות כדי לשפר את הניגודיות.
ככל שיכולות ההדמיה התקדמו, כך גם מכשירי הכנת הדגימות. בהכנת דגימת cryoEM, השלב הראשון הוא זיגוג מוצלח של הדגימות. דגימות מיובשות מוקפאות ליצירת קרח אמורפי, ובכך נמנעות הנזק שנגרם על ידי היווצרות גבישי קרח. האסטרטגיות המובילות הן הקפאת צלילה באתאן נוזלי למולקולות ותאים קטנים או הקפאה בלחץ גבוה (HPF) לדגימות גדולות יותר בעובי של עד כמה מאות מיקרונים. ההתקדמות בטכנולוגיית הקפאת צלילה מאפשרת לכידה טובה יותר של מולקולות בכל הכיוונים על ידי הפחתת ההרכבה העצמית לאורך ממשק האוויר/מים6. בנוסף, ההתקדמות בטכנולוגיית HPF מאפשרת גירוי אור וחשמלי של דגימות רגעים לפני הקפאה7. לאחרונה פותחה טכנולוגיית HPF חדשה שיכולה להתממשק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ומאפשרת עיכוב זמן קצר (<2 שניות) בין הדמיית הקרינה של תאים חיים לבין הקפאת HPF8.
ההתקדמות הנ"ל המריצתה את תחום ה-cryoEM והעניקה השראה לפיתוח שיטות חדשות. הייתה גם התחדשות של טכניקות מבוססות. כאן, אנו מציגים אוסף של שיטות המתמקדות בקידום cryoEM במטרה להפיץ אסטרטגיות אלו לתחום המחקר המתרחב במהירות.
בעוד שהשיפורים ביכולות ההדמיה ובמכשירי הכנת הדגימה היוו כוח מניע מרכזי מאחורי ההתקדמות בתחום ה-cryoEM, מכשול מרכזי במחקר זה ממשיך להיות הכנה מעשית של דגימות. Truong et al.9 מציגים שיטה המנצלת את היווצרות השומנים החד-שכבתיים בממשק האוויר/מים. שכבת שומנים נוצרת על רשת TEM ומשמשת כפיגום לחלבוני הממברנה המעניינים. עבור דגימות ממברנה מרובות או מוערמות, Johnson et al.10 מציגים אסטרטגיה "לקלף" את השכבות העודפות, ולהשאיר שכבה אחת על הרשת המתאימה להדמיית TEM. במאמר אחר, Chang et al.11 מכירים בכך שחלק מהחלבונים תלויים בטמפרטורה וכי המבנה הרלוונטי נצפה בטמפרטורות גבוהות. הם מתארים שיטת הקפאת צלילה שונה המאפשרת ליישם דגימות על הרשת בטמפרטורות גבוהות תוך השגת קרח זגוגי לאחר הקפאת צלילה. כדי לשלוט עוד יותר בתהליך הכנת רשת קריו, Kang et al.12 מציגים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לייצור שבבים מיקרו-דפוסיים עבור רשתות TEM שבהן לנקבוביות יש עומק הניתן לשליטה. שיטה זו עשויה לספק משתנה נוסף לשליטה בעובי הקרח האמורפי במהלך הכנת הרשת.
המתאם בין שיטות הדמיה מרובות הוא בעל השפעה. Bieber et al.13 מתארים זרימת עבודה של קריו שבה רשת קפואה מצולמת במיקרוסקופ פלואורסצנטי קריו כדי לאתר אזור פלואורסצנטי מעניין. לאחר מכן הרשת מועברת ל-cryoSEM/FIB, שם משתמשים ב-fiducials כדי ליישר את תמונת הקרינה עם תמונת ה-SEM, ובכך לאפשר לאזור הפלואורסצנטי להיות ממוקד לכרסום FIB. אזור המטרה מדולל לכמה מאות ננומטרים, ולאחר מכן הרשת מועברת ל-cryoTEM לטומוגרפיה על מיקום המטרה המדולל. DiCecco et al.14 מדגימים מתאם בין TEM נוזלי ל-cryoTEM, ובכך מתקרבים למטרה של צימוד נתוני cryoTEM ברזולוציה גבוהה עם נתוני TEM של מולקולות בתנועה דינמית.
רכישה אוטומטית של מערכי נתונים גדולים היא גם תחום עניין. יש למקסם את זמן המכשירים היקר, ואוטומציה היא צעד מפתח. Kumar et al.15 מתארים את הגדרת הקליק אחר קליק של תוכנת איסוף נתונים אוטומטית להדמיית cryoTHEM.
ככל שתחום ה-cryoEM ממשיך להתפתח, נראה התקדמות נוספת בהכנת הדגימות, וההשפעה של cryoEM תורגש באופן נרחב על פני דיסציפלינות נוספות. חלק מההתקדמות לא תכלול טכניקות חדשות אלא חיזוק של טכניקות קיימות. הטכניקות יהיו מהירות יותר, קלות יותר וחזקות יותר, עם תפוקה גבוהה יותר. ככל שהאוטומציה מגדילה את תפוקת הנתונים, תחומי הפיתוח העיקריים יהיו בניתוח תמונות ועיבוד נתונים. יתר על כן, בינה מלאכותית תשחק תפקיד חשוב. עלינו לצפות לראות הפחתה בעלויות המכשור ובטביעת הרגל, מה שיאפשר לטכנולוגיה זו להיות נגישה יותר, אם כי פיתוחים אלה עשויים להיות איטיים יותר להתממש.