מאמר שיטה

הרכבת ליפוזום בסיוע אוקטאנול על שבב לביו-הנדסה

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 במרץ 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הרכבת ליפוזומים בסיוע אוקטאנול (OLA), טכניקה מיקרופלואידית ליצירת ליפוזומים תואמים ביולוגית. OLA מייצרת ליפוזומים חד-מפוזרים בגודל מיקרון עם אנקפסולציה יעילה, המאפשרת ניסויים מיידיים על שבב. פרוטוקול זה צפוי להתאים במיוחד לביולוגיה סינתטית ולמחקר תאים סינתטיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרופלואידיקה היא כלי נפוץ ליצירת טיפות ובועיות מסוגים שונים באופן מבוקר ובעל תפוקה גבוהה. ליפוזומים הם חיקויים תאיים פשטניים המורכבים מפנים מימי המוקף בדו-שכבה ליפידית; הם בעלי ערך בתכנון תאים סינתטיים ובהבנת היסודות של תאים ביולוגיים בצורה חוץ גופית והם חשובים למדעים יישומיים, כגון הובלת מטענים ליישומים טיפוליים. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבודה מפורט עבור טכניקה מיקרופלואידית על שבב, הרכבת ליפוזומים בסיוע אוקטאנול (OLA), לייצור ליפוזומים חד-מפוזרים, בגודל מיקרון ותואמים ביולוגית. OLA מתפקד באופן דומה לניפוח בועות, שבו פאזה מימית פנימית (IA) ופאזה 1-אוקטאנול נושאת שומנים מסביב נצבטות על ידי זרמי נוזל חיצוניים המכילים פעילי שטח. זה מייצר בקלות טיפות תחליב כפול עם כיסי אוקטנול בולטים. כאשר דו-שכבת השומנים מתכנסת בממשק הטיפות, הכיס מתנתק באופן ספונטני ויוצר ליפוזום חד-למלרי שמוכן למניפולציות וניסויים נוספים. OLA מספק מספר יתרונות, כגון יצירת ליפוזום יציב (>10 הרץ), אנקפסולציה יעילה של ביו-חומרים ואוכלוסיות ליפוזומים חד-מפוזרים, ודורש נפחי דגימה קטנים מאוד (~ 50 μL), אשר יכולים להיות קריטיים כאשר עובדים עם ביולוגים יקרים. המחקר כולל פרטים על מיקרו-פבריקציה, ליתוגרפיה רכה ופסיבציה של פני השטח, הדרושים לביסוס טכנולוגיית OLA במעבדה. יישום ביולוגי סינתטי מוכח גם על ידי גרימת היווצרות של עיבויים ביומולקולריים בתוך הליפוזומים באמצעות שטף פרוטון טרנסממברנלי. צפוי כי פרוטוקול וידאו נלווה זה יקל על הקוראים להקים ולפתור בעיות OLA במעבדות שלהם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל התאים יש קרום פלזמה כגבול הפיזי שלהם, וממברנה זו היא למעשה פיגום בצורת דו-שכבה ליפידית הנוצרת על ידי הרכבה עצמית של מולקולות שומנים אמפיפיליות. ליפוזומים הם המקבילים הסינתטיים המינימליים של תאים ביולוגיים; יש להם לומן מימי מוקף פוספוליפידים, היוצרים דו-שכבה ליפידית כאשר קבוצות הראש ההידרופיליות פונות לשלב המימי והזנבות ההידרופוביים קבורים פנימה. יציבות הליפוזומים נשלטת על ידי האפקט ההידרופובי, כמו גם ההידרופיליות בין קבוצות הקוטב, כוחות ואן דר ואלס בין זנבות הפחמן ההידרופוביים, וקשרי המימן בין מולקולות המים והראשים ההידרופיליים 1,2. בהתאם למספר דו-שכבות השומנים, ניתן לסווג את הליפוזומים לשתי קטגוריות עיקריות, כלומר, שלפוחיות חד-שכבתיות המורכבות מדו-שכבה אחת ושלפוחיות רב-שכבתיות הבנויות מדו-שכבות מרובות. שלפוחיות Unilamellar מסווגים עוד יותר על פי גודלם. הם בדרך כלל כדוריים בצורתם, וניתן לייצר אותם במגוון גדלים, כולל שלפוחיות חד-למלריות קטנות (SUV, קוטר 30-100 ננומטר), שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUV, קוטר 100-1,000 ננומטר), ולבסוף, בועיות חד-למלריות ענקיות (GUV, קוטר >1,000 ננומטר)3,4. טכניקות שונות פותחו לייצור ליפוזומים, וניתן לסווג אותן באופן רחב לטכניקות בתפזורת5 וטכניקות מיקרופלואידיות6. טכניקות נפוצות בתפזורת כוללות התייבשות סרט שומנים, אלקטרופורמציה, העברת תחליב הפוך ושחול 7,8,9,10. טכניקות אלה פשוטות ויעילות יחסית, ואלה הן הסיבות העיקריות לשימוש הנרחב בהן בקהילת הביולוגיה הסינתטית. עם זאת, יחד עם זאת, הם סובלים מחסרונות גדולים בכל הנוגע לפיזור בגודל, חוסר שליטה על lamellarity, ויעילות אנקפסולציה נמוכה 7,11. טכניקות כמו אנקפסולציה רציפה של ממשק טיפתי (cDICE)12 וצילום טיפות וסינון גודל (DSSF)13 מתגברות על מגבלות אלה במידה מסוימת.

גישות מיקרופלואידיות עלו לגדולה בעשור האחרון. טכנולוגיה מיקרופלואידית מספקת סביבה ניתנת לשליטה למניפולציה של זרימות נוזלים בתוך מיקרו-ערוצים המוגדרים על-ידי המשתמש הודות לזרימה הלמינרית האופיינית והעברת המסה הנשלטת על ידי דיפוזיה. התקני מעבדה על שבב המתקבלים מציעים אפשרויות ייחודיות לבקרה מרחבית-זמנית של מולקולות, עם נפחי דגימה מופחתים משמעותית ויכולות ריבוב14. פותחו שיטות מיקרופלואידיות רבות לייצור ליפוזומים, כולל סילון פועם 15, טמפלציה של תחליב כפול 16, פליטת קרום חולף 17, העברת תחליב טיפות 18 ומיקוד הידרודינמי 19. טכניקות אלה מייצרות ליפוזומים חד-מפוזרים, חד-למלריים, בגודל תא, עם יעילות אנקפסולציה גבוהה ותפוקה גבוהה.

מאמר זה מפרט את ההליך להרכבת ליפוזום בסיוע אוקטאנול (OLA), שיטה מיקרופלואידית על שבב המבוססת על צביטה הידרודינמית ומנגנון הרטבת ממסעוקב 20 (איור 1). אפשר לקשר את העבודה של OLA לתהליך ניפוח בועות. צומת בן שישה כיוונים ממקד את הפאזה המימית הפנימית (IA), שני זרמים אורגניים נושאי שומנים (LO) ושני זרמים מימיים חיצוניים המכילים פעילי שטח (OA) בנקודה אחת. התוצאה היא טיפות תחליב כפול של מים בתוך (שומנים + אוקטאנול) במים. כאשר טיפות אלה זורמות במורד הזרם, מזעור האנרגיה הבין-פנים, זרימת הגזירה החיצונית והאינטראקציה עם דפנות התעלה מובילים להיווצרות דו-שכבה ליפידית בממשק כאשר כיס הממס מתנתק, וכך נוצרים ליפוזומים חד-למלריים. בהתאם לגודל כיס האוקטאנול, תהליך ההרטבה יכול להימשך עשרות שניות עד כמה דקות. בקצה תעלת היציאה, טיפות האוקטנול הפחות צפופות צפות אל פני השטח, ואילו הליפוזומים הכבדים יותר (עקב תמיסה צפופה יותר) שוקעים לתחתית תא ההדמיה מוכנים לניסויים. כניסוי מייצג, מודגם תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) בתוך ליפוזומים. לשם כך, הרכיבים הדרושים עטופים בתוך ליפוזומים ב- pH חומצי המונע LLPS. על ידי הפעלה חיצונית של שינוי pH, ולכן, שטף פרוטון transmembrane, טיפות עיבוי מופרד פאזה נוצרות בתוך הליפוזומים. זה מדגיש את יכולות האנקפסולציה והמניפולציה היעילות של מערכת OLA.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור רקיק המאסטר

  1. קח פרוסת סיליקון נקייה בקוטר 4 אינץ' (10 ס"מ) (ראה טבלת חומרים). נקו אותו עוד יותר באמצעות אוויר בלחץ כדי להסיר חלקיקי אבק.
  2. הרכיבו את הפרוסת על ציפוי מסתובב, ושחררו בעדינות ~ 5 מ"ל של התנגדות אור שלילית (ראו טבלת חומרים) במרכז הפרוסה. נסו להימנע מבועות אוויר, מכיוון שהן עלולות להפריע לתהליך ההדפסה במורד הזרם של רקיק.
  3. כדי לקבל שכבת פוטו-התנגדות בעובי 10 מיקרומטר, יש לצפות את הפרוסות ב-500 סל"ד למשך 30 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה לצורך התפשטות ראשונית, ולאחר מכן סיבוב של 60 שניות ב-3,000 סל"ד עם תאוצה של 500 סל"ד לשנייה. במקרה הרצוי עובי שונה, שנה את פרמטרי הטווייה בהתאם להוראות היצרן.
  4. אופים את הוופל על צלחת חימום במשך 2 דקות ב 65 ° C ולאחר מכן במשך 5 דקות ב 95 ° C.
  5. לאחר שהפרוסה מתקררת, הרכיבו את הפרוסות בתא ההדפסה של מכונת הליתוגרפיה האופטית לכתיבה ישירה (ראו טבלת חומרים), והזינו את עיצוב ה-OLA (איור 2A, קובץ קידוד משלים 1) לתוך התוכנה.
    הערה: עיצוב OLA מורכב למעשה משני ערוצי OA, שני ערוצי LO וערוץ IA אחד, המתמזגים ליצירת צומת שישה כיוונים הממשיך כערוץ פוסט-פרודקשן ומסתיים בבאר הניסוי (EW).
  6. הדפס את עיצוב(י) OLA על רקיק מצופה באמצעות לייזר UV (ראה טבלה של חומרים) עם מינון של 300 mJ / cm2.
  7. לאחר הדפסת העיצוב, אפו את הוופל בטמפרטורה של 65°C למשך דקה אחת, ולאחר מכן בטמפרטורה של 95°C למשך 3 דקות.
  8. בשלב זה, ודא כי קווי המתאר של המכשיר המודפס מופיע על רקיק והוא גלוי לעין בלתי. כדי לשטוף את photoresist שלא נרפא, טבלו את רקיק הזכוכית המכיל את הפתרון למפתחים (ראו טבלת חומרים) עד להסרה מלאה של photoresist שלא נרפא.
    הערה: טיפול עודף במפתחים עלול להשפיע על רזולוציית העיצוב.
  9. שטפו את הפרוסות עם אצטון, איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה (DI) ברצף, ולבסוף, עם אוויר בלחץ/N2 באמצעות אקדח נשיפה.
  10. אפו קשה את הוופל בטמפרטורה של 150°C במשך 30 דקות כדי להבטיח שהעיצוב המודפס מחובר היטב למשטח הוופל ואינו יורד בתהליך הייצור במורד הזרם. לאחר מכן פרוסת המאסטר מוכנה לשימוש נוסף (איור 2B).

2. הכנת המכשיר המיקרופלואידי

  1. הניחו את רקיק המאסטר על פיסת אלומיניום מרובעת, ועטפו את רדיד האלומיניום סביב הפרוסה, ויצרו מבנה דמוי באר (איור 2C).
  2. יש למדוד 40 גרם פולידימתילסילוקסאן (PDMS) ו-4 גרם חומר ריפוי (10:1, יחס משקל, ראו טבלת חומרים) בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ולערבב במרץ באמצעות מרית או קצה פיפטה במשך 2-3 דקות.
  3. הערבוב הנמרץ של PDMS וחומר הריפוי לוכד בועות אוויר בתוך התערובת. סובב את הצינור ב 100 x גרם במשך 2-3 דקות כדי להסיר את רוב בועות האוויר הגדולות.
  4. יוצקים כ-15-20 גרם מהתערובת שהוכנה בשלב 2.3 על רקיק המאסטר, ומנטרלים את הגז באמצעות מייבש. שמרו את עודפי התערובת ליצירת שקופיות זכוכית מצופות PDMS (שלב 3).
  5. לדגור את המכלול בתנור ב 70 ° C לפחות 2 שעות.
  6. הוציאו את רקיק המאסטר מהתנור ותנו לו להתקרר. כדי להסיר את בלוק ה-PDMS המוצק, הסר את רדיד האלומיניום וקילף בזהירות את בלוק ה-PDMS מקצה הפרוסה.
    הערה: רקיק הוא שביר ועלול להישבר, ולכן חשוב לעשות את התהליך הזה בזהירות.
  7. לאחר הסרת בלוק ה-PDMS, שמרו על המבנה המעוצב פונה כלפי מעלה, ובעזרת להב חד או אזמל, חתכו בלוקי PDMS נפרדים, שכל אחד מהם מכיל התקן מיקרופלואידי יחיד.
  8. הניחו את בלוק PDMS על משטח כהה, והתאימו את כיוון האור (מנורת שולחן שימושית לכך) כך שהתעלות החרוטות יהיו מבריקות וכתוצאה מכך גלויות. עשו חורים בפתחים ובתעלת היציאה באמצעות ניקובי ביופסיה בקוטר 0.5 מ"מ ו-3 מ"מ (ראו טבלת חומרים), בהתאמה.
    הערה: השתמש בניקוב ביופסיה חד כדי למנוע סדקים ב- PDMS, שעלולים לגרום לדליפה מאוחר יותר. דחפו בעדינות את ניקוב הביופסיה דרך בלוק PDMS, וודאו שהוא עובר דרכו לחלוטין. כדי להסיר את ניקוב הביופסיה, משכו אותו בעדינות תוך כדי סיבובו בכיוונים חלופיים. בלוק PDMS עם עיצוב OLA החרוט מוכן כעת להיקשר לשקופית זכוכית מצופה PDMS.

3. הפיכת הזכוכית המצופה PDMS למחליקה

  1. קח כיסוי זכוכית שקוף, שפך כ 0.5 מ"ל של PDMS (מוכן עודף בשלב 2.4) על מרכז מגלשת הזכוכית, ופרש אותו על פני הכיסוי על ידי הטיה עדינה של מגלשת הזכוכית, הבטחת כיסוי מלא של מגלשת הזכוכית עם PDMS.
  2. הרכיבו את מגלשת הזכוכית על מעיל הסיבוב, ודאו שהיא ממוקמת במרכז (כך שאמצע המגלשה יחפוף למרכז מוט הלחץ), וסובבו את מגלשת הזכוכית ב-500 סל"ד למשך 15 שניות (בהפרש של 100 סל"ד לשנייה) ולאחר מכן ב-1,000 סל"ד למשך 30 שניות (בהפרש של 500 סל"ד לשנייה).
  3. הניחו את מגלשת הזכוכית המצופה PDMS (הצד המצופה פונה כלפי מעלה) על משטח מוגבה כמו גוש PDMS (1 ס"מ x 1 ס"מ) בתבנית פטרי מכוסה, ואופים אותה בטמפרטורה של 70°C למשך שעתיים.

4. מליטה של המכשיר microfluidic

  1. נקה את בלוק PDMS (שהוכן בשלב 2) על-ידי הדבקה והסרה של סרט סקוטש הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) פעמיים. הקפידו להשאיר את הצד הנקי פונה כלפי מעלה עד לשימוש.
  2. נקו את מגלשת הזכוכית המצופה PDMS עם אוויר בלחץ/N2 באמצעות אקדח נשיפה, ושמרו על הצד הנקי פונה כלפי מעלה.
  3. הניחו את בלוק PDMS (תעלות חרוטות הפונות כלפי מעלה) ואת שקופית הזכוכית המצופה PDMS (הצד המצופה פונה כלפי מעלה) בתא הוואקום של שואב הפלזמה (ראו טבלת חומרים).
  4. הפעל את הוואקום, וחשף את התוכן לפלסמת אוויר בתדר רדיו של 12 MHz (מצב RF גבוה) למשך 15 שניות כדי להפעיל את המשטחים. פלזמה חמצן ניתן לראות בצורה של גוון ורדרד.
  5. מיד לאחר טיפול הפלזמה, הניחו את מגלשת הזכוכית המצופה PDMS על משטח נקי כאשר צד ה-PDMS פונה כלפי מעלה. הניחו בעדינות את בלוק ה-PDMS כשהתבנית המיקרופלואידית פונה כעת לכיוון שקופית הזכוכית המצופה ב-PDMS, מה שמאפשר להם להיקשר (איור 2D).
    הערה: הסרת האוויר הכלוא במכשיר חיונית כדי להבטיח הדבקה יסודית.
  6. אופים את המכשירים מלוכדים ב 70 ° C במשך 2 שעות.

5. פונקציונליות פני השטח של המכשיר microfluidic

הערה: לפני תפקוד פני השטח, חשוב לכייל את משאבת הלחץ בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) ולהרכיב את הצינור כדי לחבר אותו למכשיר המיקרופלואידי.

  1. חיבור המכשיר המיקרופלואידי למשאבות הלחץ
    1. חבר את בקר הזרימה מונחה הלחץ למקור לחץ חיצוני (עד 6 פסים). נדרשים לפחות ארבעה ערוצי לחץ אוויר עצמאיים: שלושה מודולים נפרדים של 0-2 בר, ומודול אחד של -0.9-4 בר.
    2. כיול משאבת הלחץ בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).
    3. חותכים את הצינור (1/16 אינץ' OD x 0.02 במזהה) לארבעה חלקים שווים בגודלם באורך של כ-20 ס"מ.
    4. הכנס 23 G מחברים מכופפים מפלדת אל-חלד 90° (ראה טבלת חומרים) בקצה אחד של כל חלק. קצה זה מוכנס מאוחר יותר לשלושת הפתחים (OA, LO ו- IA) של המכשיר המיקרופלואידי והרביעי משמש להסרת תמיסה עודפת (שלב 5.2.5).
    5. הכניסו את הקצה השני של הצינור למעמד המאגר המיקרופלואידי, ואטמו אותו באמצעות אביזרים מיקרופלואידים, כדי לוודא שהצינור ארוך מספיק כדי לגעת בתחתית המאגר (צינורות 1.5 מ"ל, ראו טבלת חומרים). זה מונע מבועות אוויר לא רצויות להיכנס למכשיר המיקרופלואידי במהלך טיפול PVA / ייצור ליפוזומים.
  2. טיפול PVA בתעלת היציאה
    הערה: לפני יצירת הליפוזומים, חיוני להפוך את המכשיר להידרופילי חלקית במורד הזרם של צומת הייצור. זה נעשה על ידי טיפול בתעלות אלה עם תמיסת אלכוהול פוליוויניל (PVA) 5% (w/v). תמיסת PVA מוכנה על ידי המסת אבקת PVA (ראו טבלת חומרים) במים בטמפרטורה של 80°C למשך 3 שעות תוך ערבוב מתמיד באמצעות מערבל מגנטי. סנן את התמיסה לפני השימוש בה לטיפול פני השטח. מיד לאחר מליטת המכשיר, התעלות המיקרופלואידיות הן הידרופיליות עקב הפעלת פני השטח המושרה על ידי פלזמה, והן יהפכו בהדרגה שוב להידרופוביות. מומלץ להמתין שעתיים לאחר האפייה (שלב 4.6) לפני תחילת טיפול ה-PVA.
    1. יש לפזר 200 μL של תמיסת PVA 5% w/v לתוך צינור של 1.5 מ"ל, ולחבר אותו למעמד המאגר המיקרופלואידי. הכנס את הצינור (זה שהוזכר בשלב 5.1.3) כך שקצה אחד שקוע בתמיסת PVA והקצה השני מחובר לכניסה של תעלת OA של המכשיר המיקרופלואידי.
      הערה: ריכוז PVA נמוך יותר עלול להוביל לתפקוד פני שטח תת-סטנדרטי.
    2. חזור על השלב לעיל ללא PVA (צינור ריק של 1.5 מ"ל), וחבר אותו לערוצי LO ו- IA.
    3. הגדל את הלחץ של שלב OA ל- 100 mbar כדי להזרים את תמיסת ה- PVA בתעלות OA. הגדילו את הלחצים של פאזות IA ו-LO ל-120 mbar כדי למנוע זרימה חוזרת של תמיסת PVA בתוך התעלות האלה (איור 2E).
      הערה: במידת הצורך, התאם את הלחצים של התעלות הבודדות על מנת לשמור על המניסקוס יציב בצומת הייצור.
    4. הזרימו את פתרון ה-PVA באופן זה במשך כ-5 דקות, תוך הבטחת תפקוד מלא של תעלת היציאה.
    5. כדי להסיר את תמיסת ה- PVA, נתק את הצינור מכניסת OA והגדל מיד את הלחץ בתעלות LO ו- IA ל- 2 בר. במקביל, השתמשו בצינור המחובר לתעלת לחץ שלילי (-900 mbar) הסירו עודפי PVA תחילה מתעלת היציאה ולאחר מכן מפתח OA (איור 2F).
    6. אפו את המכשיר בטמפרטורה של 120°C במשך 15 דקות, ותנו לו להתקרר לפני השימוש. ניתן לאחסן את המכשיר בתנאי סביבה למשך חודש אחד לפחות.
      הערה: מומלץ להמתין יום אחד (בטמפרטורת החדר) לפני שממשיכים עם OLA כדי להבטיח שה- PDMS שלא טופל חוזר להידרפוביות שלו לאחר טיפול הפלזמה.

6. הרכבת ליפוזומים בסיוע אוקטאנול (OLA)

  1. הכנת מלאי השומנים
    הערה: כאן, תערובת של 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ו 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE) שומנים (ראה טבלה של חומרים) משמשים כדוגמה; משתמשים צריכים להכין את הרכב השומנים שהם צריכים באופן דומה.
    1. יש להוציא 76 μL של DOPC (25 מ"ג/מ"ל) ו-16.6 μL של Liss Rhod PE (1 מ"ג/מ"ל) לתוך בקבוק בעל תחתית עגולה באמצעות מזרקי זכוכית נפרדים.
    2. שמור על הבקבוק בעל התחתית העגולה זקופה, והשתמש באקדח נשיפה דחוס N2 כדי לתת זרם עדין של חנקן כדי לאדות את הכלורופורם וליצור סרט שומנים מיובש בתחתית הצלוחית.
    3. הניחו את הבקבוק במייבש למשך שעתיים לפחות תחת ואקום רציף כדי להסיר את שאריות הכלורופורם.
    4. הוסיפו 100 מיקרוליטר אתנול לצלוחית התחתונה העגולה, ולאחר מכן בצעו פיפטינג או ניעור עדינים כדי להבטיח שהשומנים מומסים ויוצרים מלאי שומנים של 10% (w/v).
      הערה: במקרה שהרכב שומנים מסוים אינו מסיס לחלוטין באתנול, השתמש בתערובת אתנול/כלורופורם, תוך שמירה על נפח כלורופורם קטן ככל האפשר.
    5. פיפטה את הפתרון לתוך בקבוקון זכוכית כהה. שטפו בעדינות את הבקבוקון בחנקן באמצעות אקדח נשיפה כדי להחליף את האוויר באטמוספירה אינרטית. אטמו את המכסה בסרט פרפין ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.
      הערה: ניתן להשתמש בפתרון המלאי עד מספר חודשים. בכל פעם שהבקבוקון נפתח, החליפו בעדינות את האוויר בחנקן, ואטמו מחדש עם מכסה עם סרט פרפין.
  2. הכנת פתרונות OLA
    1. הפוך פתרונות מלאי של רכיבים חיוניים: 20 mM dextran (Mw 6,000); 60% (v/v) גליצרול; חיץ של בחירה. במקרה זה, הוכן מי מלח חוצצי פוספט 5x (0.68 M NaCl, 13.5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4, 9mM KH2PO 4; pH7.4) (ראה טבלת חומרים).
      הערה: מכיוון שגליצרול טהור צמיג מאוד, מומלץ לחתוך חתיכה קטנה בקצה קצה הפיפטה בצורה מלוכסנת לפיפטינג יעיל.
    2. הכן 100 μL של IA, OA ותמיסת יציאה (ES, הפתרון הרצוי למילוי EW) דגימות. כדי להקל על ההדמיה, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) נוסף לתמיסת IA במקרה הספציפי הזה. בדוק את האיזון האוסמוטי בין IA ו- OA על ידי חישוב האוסמולריות של הרכיבים הכמוסים והוספת כמות מתאימה של סוכר או מלח ל- OA במידת הצורך. זה נעשה על מנת למנוע התפוצצות או התכווצות של הליפוזומים במהלך הייצור.
      הערה: ההרכבים הסופיים של שלושת השלבים הם כדלקמן:
      IA: 15% גליצרול, 5 mM דקסטרן (Mw 6,000), 5.4 מיקרומטר YFP, 1x PBS
      OA: 15% גליצרול, 5% F68 פעילי שטח, 1x PBS
      ES: 15% גליצרול, 1x PBS
      ריכוז נמוך יותר של F68 פעילי שטח משפיע לרעה על יצירת תחליבים כפולים.
    3. הכן 80 μL של שלב LO על ידי pipeting 4 μL של שומנים מלאי לתוך 76 μL של 1-octanol (ראה טבלה של חומרים). הריכוז הסופי של DOPC הוא 5 מ"ג/מ"ל.
    4. צנטריפוגה הדגימות ב 700 x גרם במשך 60 שניות כדי להסיר כל אגרגטים גדולים לפני שתמשיך עם ניסויים microfluidic. זה מונע מכל גורמי סתימה ברורים להיכנס לשבב microfluidic.
  3. ייצור ליפוזום
    1. יש לחלק את התמיסות (IA, LO, OA) לשלוש שפופרות של 1.5 מ"ל, להרכיב אותן (כאמור בשלב 5.1) ולחבר אותן לשבב מיקרופלואידי מטופל PVA (שלב 5.2.6).
    2. הפעל לחץ חיובי על שלושת הערוצים: ~ 100 mbar בערוצי IA ו- LO ו- ~ 200 mbar בערוץ OA.
      הערה: מכיוון שלחץ OA גבוה יותר מהאחרים, פתרון OA יהיה הראשון שיגיע ל- EW; זה מומלץ מאוד.
    3. ברגע שתמיסת OA מגיעה ל- EW, הפחת את לחץ ה- OA ל- 100 mbar והגדל את ה- LO ל- 200 mbar.  פתרון ה-LO שיגיע לצומת הייצור יגרום ככל הנראה לבועות אוויר בגלל הזזה של אוויר מתעלות ה-LO. לאחר שחרור בועות האוויר ל-EW, התאימו את לחץ ה-LO ל-100 mbar. לבסוף, הגדל את לחץ IA ל 200 mbar, והמתן עד שכל האוויר בערוץ IA מוסר. רצף ההגעה האידיאלי לצומת שלושת השלבים הוא, אם כן, OA, LO ו- IA.
    4. לאחר הוצאת האוויר משלושת הערוצים, התאימו את כל לחצי הערוץ ל- 50 mbar ופיפטה 10 μL של ES לתא היציאה. לאחר פיפטציה ES, לשים מגלשת כיסוי על חור היציאה כדי למנוע אידוי. במקרה שה- LO נדחף לאחור, הגדל בהדרגה את לחץ ה- LO במרווחים של 1 mbar עד שהוא מתחיל לזרום לצומת.
    5. ברגע שכל שלושת השלבים מתחילים לזרום יחד בצומת, ודאו שמתחיל ייצור תחליב כפול, והתאמו בהתאם לאיכותו (איור 3A-C). שנה את הלחצים בהדרגה (צעדים של 0.1-1 mbar) ולא בפתאומיות, אלא אם כן הלחץ משתנה כדי למנוע סתימה לא רצויה בתעלה.
      הערה: הערוצים שיש לכוונן תלויים במה שקורה בצומת. לדוגמה, IA צריך להיות מופחת אם תחליבים גדולים מדי; יש להגדיל את ה-OA אם נוצרים תחליבים כפולים אך מתפוצצים במקום להיצבט; ואת LO צריך להיות מופחת אם כיס אוקטאנול הוא גדול מדי.
    6. בדקו שטיפות התחליב הכפול זורמות במורד הזרם ל-EW. ככל שהם זורמים, כיסי אוקטאנול נעשים בולטים יותר ויותר ולבסוף נצבטים ויוצרים ליפוזומים (איור 3D-F). ודא כי ערוץ הפוסט-פרודקשן ארוך מספיק וכי נדידת האמולסיות הכפולות איטית מספיק כדי להרטיב אותה.
      הערה: תוך דקות לאחר ייצור הגון, טיפות ליפוזומים ואוקטאנול ייצאו מערוץ הפוסט-פרודקשן וייכנסו ל-EW. כתוצאה מכך, בהיותן פחות צפופות ממים, טיפות האוקטאנול צפות אל פני השטח של ES. בשל תוספת של דקסטרן ב IA, הליפוזומים כבדים יותר מסביבתם והולכים לתחתית החדר מוכנים לתצפית ומניפולציה נוספת.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מדגים היווצרות של מעובים חסרי קרום באמצעות תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) בתוך ליפוזומים כניסוי מייצג.

הכנת דוגמאות
IA, OA, ES ותמיסת הזנה (FS) מוכנים כדלקמן:

IA: 12% גליצרול, 5 מ"מ דקסטרן, 150 מ"מ KCl, 5 מ"ג/מ"ל פולי-ל-ליזין (PLL), 0.05 מ"ג/מ"ל פולי-ל-ליזין-FITC מסומן (PLL-FITC), 8 מ"מ אדנוזין טריפוספט (ATP), 15 מ"מ ציטראט-הידרוכלוריד (pH 4)

OA: 12% גליצרול מול גליצרול, 5% עם F68, 150 mM KCl, 15 mM ציטראט-הידרוכלוריד (pH 4)

ES: 12% גליצרול, 150 mM KCl, 15 mM ציטראט-הידרוכלוריד (pH 4)

FS: 12% גליצרול, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

היווצרות עיבוי בתוך ליפוזומים
בדיקה פשוטה של קואסרבציה מורכבת רגישה ל- pH של פולי-L-ליזין טעון חיובית (PLL) ואדנוזין טריפוספט רב-ערכי טעון שלילית (ATP) נבחרה כדי להדגים את התופעות של LLPS בליפוזומים. כדי למנוע הפרדת פאזה של פוליליזין ו- ATP במהלך אנקפסולציה, ה- pH של התמיסה נשמר על 4, שבו ATP הוא נייטרלי. הגדלת ה-pH של ה-ES על-ידי הוספת FS (חיץ של pH 9) הגדילה בסופו של דבר את ה-pH בתוך הליפוזומים עקב שטף פרוטון טרנסממברנלי, מה שהפך את ה-ATP לבעל מטען שלילי וגרם להפרדת הפאזה שלו עם PLL21 טעון חיובית (איור 4A). לאחר כשעתיים של יצירת ליפוזומים, לחצי IA ו-LO כובו. לחץ תעלת OA נשמר על 100 mbar כדי להזרים את הליפוזומים הנותרים לתוך תא התצפית באיטיות. לאחר שכל הליפוזומים בתעלה נמצאו ב-EW, הלחצים כובו כדי לעצור את הזרימה ולמנוע מהליפוזומים לנוע. הליפוזומים שנוצרו ב-pH נמוך יותר הראו פלואורסצנטיות הומוגנית (מהפלואורסצנטי PLL-FITC העטוף) בלומן שלהם (איור 4B,D). טיפות אוקטאנול שצפות על פני השטח הוסרו על ידי פליטה זהירה של 5 מיקרוליטר תמיסה מלמעלה כדי למנוע מהן להשפיע על צעדי פיפטינג נוספים. לאחר מכן, 10 μL של חיץ FS נוסף ל- EW, אשר גרם להפרדת פאזה של PLL ו- ATP העטוף. פלואורסצנטיות FITC הומוגנית מכל ליפוזום הפכה בהדרגה לטיפות מעובות פלואורסצנטיות נפרדות. בסופו של דבר, הטיפות הבודדות התמזגו לטיפה מעובה אחת גדולה יותר שהתפזרה בחופשיות בתוך הליפוזומים (איור 4C,E-G).

figure-results-1
איור 1: סכמטי המראה את ההרכבה והעבודה של OLA. בקר הלחץ מחובר למאגרים המכילים תמיסות מימיות חיצוניות, ליפידים באוקטאנול ותמיסות מימיות פנימיות. הצינורות המוכנסים למאגרים מחוברים לפתחים המתאימים של מכשיר OLA. זרימות מתאימות בשלושת הערוצים מובילות להיווצרות תחליבים כפולים של מים בתוך (שומנים באוקטאנול). האמולסיות הכפולות שנוצרו נודדות לבאר היציאה, ובמהלכה כיסי האוקטנול מתנתקים ויוצרים ליפוזומים. הליפוזומים שנוצרו נאספים בתחתית הבאר לצורך הדמיה וניסויים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הכנת שבב OLA (פוטוליתוגרפיה, מיקרו-פבריקציה, טיפול פני שטח). (A) עיצוב דיגיטלי המציג את המאפיינים העיקריים של עיצוב OLA, כולל שלושה כניסות, שקע וצומת ייצור בשישה כיוונים. (B) שרטוט של רקיק המאסטר המציג עיצובי OLA מרובים המיוצרים באמצעות ליתוגרפיית UV. (C) אלסטומר PDMS יצוק על רקיק המאסטר, מונח בבאר העשויה מרדיד אלומיניום, ונרפא על ידי אפייה בטמפרטורה של 70°C למשך שעתיים. (D) מכשיר מיקרופלואידי המחובר באמצעות טיפול פלזמה חמצן, שבו בלוק PDMS המכיל את עיצוב OLA מחובר למגלשת זכוכית מצופה PDMS. (E) פונקציונליות פני השטח של השבב המיוצר כדי להפוך את המכשיר להידרופילי חלקית. זה נעשה על ידי זרימה 5% w / v PVA במשך 5 דקות מן התעלה המימית החיצונית לכיוון ערוץ היציאה. לחץ אוויר חיובי בתעלות האחרות מונע מתמיסת PVA להיכנס לתעלות אלה. (F) PVA מוסר על ידי הפעלת ואקום בתעלת היציאה. המכשיר נאפה בטמפרטורה של 120°C למשך 15 דקות ולאחר מכן מוכן לשימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הדגמה של OLA המייצר ביעילות תחליבים כפולים חד-מפוזרים ובסופו של דבר ליפוזומים עם אנקפסולציה מצוינת. (A) תמונת שדה בהיר המראה יצירה מהירה של טיפות תחליב כפול. (B) תעלת השומנים הפלואורסצנטית מראה היווצרות כיס אוקטאנול עקב הרטבה חלקית. שלב השומנים באוקטאנול הכיל תערובת של DOPC (5 מ"ג/מ"ל) ו-Lis Rhod PE ביחס של 1,000:1. (C) התעלה המימית הפנימית המראה אנקפסולציה של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). הכניסות ב- (A-C) מציגות תצוגות מוגדלות מייצגות של החלוניות המתאימות (פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר). (ד-ו) הרטבת כיס האוקטאנול בתעלת היציאה, היוצרת ליפוזום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית המופעלת על ידי pH של pLL/ATP בתוך ליפוזומים. (A) סכמטי של המעבר תלוי ה-pH של התמיסה ההומוגנית של pLL ו-ATP בתוך הליפוזום (משמאל) לקואקרוואטים pLL/ATP מופרדים בפאזה (מימין). הסביבה החומצית הראשונית בליפוזום הופכת את המטען המולקולרי של ATP לנייטרלי, ומעכבת את הקרישה ההדדית. כאשר ה- pH בתוך הליפוזומים מתאזן עם עליית ה- pH המיושמת חיצונית, ATP מקבל מטען שלילי, מה שגורם לקרישה הדדית. (ב-ג) תרשימים קוויים (המתאימים לקווים המנוקדים בחלוניות [D] ו- [G], בהתאמה) המציגים את ההתפלגות המרחבית של pLL (ערוץ ירוק) והממברנה (ערוץ אדום). (ד-ג) תמונות קיטועי זמן המציגות היווצרות של pLL/ATP coacervates בתוך הליפוזומים. התוספת החיצונית של חיץ בסיסי מעלה את רמת החומציות בתוך הליפוזומים במשך דקות ויוזמת קו-סרבציה. t = 0 min מתייחס לזמן שלפני התרחשות אירוע הקרישה הראשון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ CAD של עיצוב OLA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מורכבות התא מקשה מאוד על הבנת תאים חיים כאשר חוקרים אותם כמכלול. הפחתת היתירות והקישוריות ההדדית של תאים על ידי בנייה מחדש של רכיבי המפתח במבחנה נחוצה כדי לקדם את הבנתנו את המערכות הביולוגיות וליצור חיקויים תאיים מלאכותיים ליישומים ביוטכנולוגיים22,23,24. ליפוזומים משמשים כמערכת מינימלית מצוינת להבנת תופעות תאיות. רשימה לא ממצה של תופעות אלה כוללת דינמיקה של שלד ציטו-שלד ועיוותים בקרום25,26, ויסות מרחבי-זמני של עיבויים ביומולקולריים27,28 והאינטראקציה שלהם עם הממברנה 29, אנקפסולציה של מגוון רחב של ביומולקולות, כולל מערכות תרגום שעתוק ללא תאים 30, סינתזת שומנים ללא תאים 31, ואבולוציה של חלבונים 32,33,34. ליפוזומים היו בשימוש נרחב גם כנשאים לאספקת תרופות ואושרו על ידי מנהל המזון והתרופות (FDA) וסוכנות התרופות האירופית (EMA) לשימוש קליני11. ליפוזומים וננו-חלקיקים מבוססי שומנים משמשים כנשאים להעברת תרופות, כולל חיסוני mRNA כמו חיסון COVID-1935 האחרון.

מחקר זה מתאר פרוטוקול מפורט על פוטוליתוגרפיה, הרכבה מיקרופלואידית ותפקוד פני השטח כדי לבצע את טכניקת OLA כדי ליצור ליפוזומים על שבב (איור 1 ואיור 3). הליפוזומים המיוצרים באמצעות OLA הם חד-מפוזרים (מקדם השונות: 4%-11% מהממוצע) ובטווח גודל התא הביולוגי (בדרך כלל בין 5-50 מיקרומטר קוטר), וניתן לכוונן אותם באמצעות מהירויות זרימה מתאימות של התעלות המימיות הפנימיות והחיצוניות36. לדוגמה, לאוכלוסיית הליפוזומים שנראית באיור 1 יש התפלגות גודל של 23.3 מיקרומטר ± 1.8 מיקרומטר (n = 50). עם קצבי ייצור אופייניים של 10-30 הרץ, הליפוזומים שנוצרו הם חד-למלריים, כפי שאושר בעבר על ידי החדרת חלבון טרנסממברנה יחיד ספציפי לדו-שכבתי, אלפא-המוליזין36, לתוך הממברנה, כמו גם באמצעות בדיקת הלבנה של דיתיונט37. OLA תואם גם למגוון רחב של הרכבי שומנים, ומציע למשתמש גמישות בבחירת השומנים. חשוב לציין, הרכב השומנים בשימוש הראשוני משתקף בהרכב הליפוזום הסופי38.

בהיותה טכנולוגיה חדשה יחסית, יש מקום נוסף לשיפור OLA. לדוגמה, פונקציונליות פני השטח באמצעות PVA היא חיונית אך מייגעת לביצוע. דרך קלה ופשוטה יותר לתפקוד פני השטח של המכשיר תקצר משמעותית את זמן ייצור השבב, כמו גם את השונות בין שבב לשבב. חומר פעילי שטח פלורוני F68 הוא מרכיב חשוב בפאזה המימית החיצונית לייצוב התחליב הכפול; עם זאת, השימוש בו יכול להיות מגביל במקרים מסוימים. החלפת Pluronic F68 בסורפקטנט תואם ביולוגית יותר או הסרה מלאה של חומרים פעילי שטח עשויה לשפר את הרבגוניות של המערכת. במהלך הנדידה של תחליבים כפולים שנוצרו בערוץ היציאה, הם יכולים להתפוצץ עקב גזירה. שדרוג עיצוב ה-OLA לשיפור יציבות האמולסיה הכפולה והפרדת כיסי האוקטאנול יכול, לפיכך, להגדיל את התפוקה. עם זאת, ל-OLA מספר יתרונות, הכוללים בעיקר אנקפסולציה יעילה, ליפוזומים חד-מפוזרים וחד-למלריים, וניסויים מבוקרים על שבב.

OLA יושמה והותאמה במגוון רחב של מחקרים, כולל גדילה וחלוקה של ליפוזומים39, חקר תהליך הפרדת הפאזה נוזל-נוזל27 והאינטראקציה שלו עם הממברנה21, והבנת היווצרות תוצרי ביולוגיה של גידול חיידקים בליפוזומים40. מבחני תפוקה גבוהה מבוססי OLA משמשים גם להבנת העברת יונים על פני הממברנה 41 וחדירות תרופות על פני דו-שכבת השומנים37, כמערכת אספקת תרופות למטרות טיפוליות 42, כדי לחקור את ההשפעה של אנטי-מיקרוביאלים על ממברנה43, וככלי לעטוף גבישים נוזליים 44. בנוסף למגוון הרחב של יישומים של טכנולוגיית OLA, גרסאות מותאמות של OLA המתאימות למטרות מסוימות מפותחות 45,46,47,48,49,50. בסך הכל, בהתחשב ביתרונות ובחסרונות, אנו מאמינים מאוד כי OLA היא פלטפורמה רב-תכליתית לביולוגיה סינתטית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לדולף ויירס, ורה גורלובה ומארק רוז'ן על שסיפקו לנו באדיבות את YFP. S.D. מכיר בתמיכה כספית ממועצת המחקר ההולנדית (מספר מענק: OCENW. קליין.465).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-אוקטנולסיגמא-אולדריץ'מס' 297887
צינורות 1.5 מ"לפישר 10451043 מדעיEppendorf 3810X צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן
ATPסיגמא-אולדריץ'מס' A2383
אגרוף ביופסיהדרווין מיקרופלואידיקהPT-T983-050.5 מ"מ ו-3 מ"מ קוטר
ציטראט-בסיססיגמא-אולדריץ'מס' 71405
DextranSigma-Aldrichמס' 31388Mr ~ 6,000
מכונת ליתוגרפיה אופטית לכתיבה ישירהDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3Baby התקנה ותוכנה
DOPC ליפידAvantiמק"ט: 850375C
F68Sigma-Aldrichמס' 24040032
כיסוי זכוכית תלוש Corning#1, 24 x 40 מ"מ
גליצרולסיגמא-אולדריץמס' G2025
חומצה הידרוכלוריתThermo Scientific Acrosמס' 124630010
Liss Rhod PE ליפידAvantiמק"ט:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
מפתח Photoresistמיקרו התנגדות טכנולוגיה GmbHmr-Dev 600
מנקה פלזמההאריק פלזמהPDC-32G
פולידימתילסילוקסןדאוסילגארד 184PDMS וחומר ריפוי
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'מס' P7890
פולי-L-ליזין– FITC מסומןSigma-Aldrichמס' P3543
אלכוהול פוליווינילסיגמא-אולדריץ'מס' P8136משקל מולקולרי 30,000– 70,000, 87%– בקר לחץ הידרוליזה 90%
Elveflow OBK1 Mk3 +בקר זרימה
סקוטשסקוטש קלטת קסם קלטת מאט בלתי נראית רקיק
סיליקוןחומרי סיליקון0620R16002
ציפוי ספין Laurell Technologies Corporationדגם WS-650MZ-23NPP
נירוסטה 90° מצמדי PDMS כפופיםדרווין מיקרופלואידיקהPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-Aldrichמס' 252859
צינורות טיגוןדרווין מיקרופלואידיקה1/16 אינץ' OD x 0.02 אינץ' מזהה
לייזר UV אורך גל 365 ננומטר
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459(2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543(2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851(2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876(2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188(2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459(2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800(2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317(2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969(2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359(2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48(2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100(2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005(2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169(2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281(2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים