אנו מציגים פרוטוקול לבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף בתפוקה גבוהה (ATAC-seq) במיוחד על אדיפוציטים באמצעות מיון גרעין עם רקמות שומן שבודדו מעכברי כתב טרנסגניים עם תיוג פלואורסצנטי גרעיני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ATAC-Seq ספציפי לאדיפוציט עם רקמות שומן באמצעות מיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
בדיקה עבור כרומטין נגיש טרנספוזאז עם ריצוף תפוקה גבוהה (ATAC-seq) היא טכניקה חזקה המאפשרת פרופיל נגישות כרומטין ברחבי הגנום. טכניקה זו שימושית להבנת מנגנוני הבקרה של ביטוי גנים במגוון תהליכים ביולוגיים. למרות ATAC-seq כבר שונה עבור סוגים שונים של דגימות, לא היו שינויים יעילים של שיטות ATAC-seq עבור רקמות שומן. אתגרים עם רקמות שומן כוללים הטרוגניות תאית מורכבת, תכולת שומנים גדולה וזיהום מיטוכונדריאלי גבוה. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר ATAC-seq ספציפי לאדיפוציט על ידי שימוש במיון גרעין המופעל על ידי פלואורסצנטיות עם רקמות שומן מעכבר הכתב המהונדס Nuclear Taggging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). פרוטוקול זה מפיק נתונים באיכות גבוהה עם קריאות רצף מבוזבזות מינימליות תוך הפחתת כמות הקלט והריאגנטים של הגרעין. מאמר זה מספק הוראות מפורטות שלב אחר שלב עבור שיטת ATAC-seq שאומתה לשימוש בגרעיני אדיפוציט שבודדו מרקמות שומן עכבר. פרוטוקול זה יסייע בחקירת דינמיקת הכרומטין באדיפוציטים על גירויים ביולוגיים מגוונים, אשר יאפשרו תובנות ביולוגיות חדשות.
מבוא
רקמת שומן, המתמחה באחסון אנרגיה עודפת בצורה של מולקולות שומנים, היא איבר מפתח לוויסות מטבולי. הבקרה הקפדנית על היווצרות ותחזוקה של אדיפוציטים חיונית לתפקוד רקמת השומן ולהומאוסטזיס אנרגיה של כל הגוף1. רגולטורי שעתוק רבים ממלאים תפקיד קריטי בבקרת התמיינות האדיפוציטים, הפלסטיות והתפקוד; חלק מהרגולטורים הללו מעורבים בהפרעות מטבוליות בבני אדם 2,3. ההתקדמות האחרונה בטכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה לביטוי גנים וניתוח אפיגנומי הקלה עוד יותר על גילוי הרגולטורים המולקולריים של ביולוגיה אדיפוציטית4. מחקרי פרופיל מולקולרי המשתמשים ברקמות שומן מאתגרים לביצוע בשל ההטרוגניות של רקמו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הטיפול והניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי נהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה.
1. הכנות לפני תחילת הניסוי
- הכנת רקמות
- עבור תיוג גרעין אדיפוציט, הצליבו עכברי NuTRAP עם קווי adiponectin-Cre ספציפיים לאדיפוציט (Adipoq-Cre) כדי ליצור עכברי Adipoq-NuTRAP, שהם המיזיגוטיים הן עבור Adipoq-Cre והן עבור NuTRAP.
- נתחו את רקמות השומן המעניינות מעכברי Adipoq-NuTRAP כפי שתואר קודם לכן14.
- יש להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
הערה: ניתן לאחסן כל כרית שומן כמכלול, ואת הרקמות הקפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לנתח רקמת שומן באמצעות פרוטוקול ATAC-seq זה, יצרנו עכברי Adipoq-NuTRAP שניזונו מתזונת צ'או; לאחר מכן בודדנו גרעיני אדיפוציט מרקמת השומן הלבן האפידידימלית (eWAT), מרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT) ומרקמת השומן החום (BAT) באמצעות ציטומטריית זרימה. הגרעינים המבודדים שימשו לתיוג, ולאחר מכן לטיהור DNA, הגברת PCR, שלבי בדיקת איכות, ריצוף וניתוח נתונים, כמתואר לעיל. מטרת הניסוי המייצג הזה הייתה לאפיין את נגישות הכרומטין של אוכלוסיות אדיפוציטים טהורים שבודדו ממחסני שומן שונים.
ראינו שניתן להבחין בביר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה, הצגנו פרוטוקול ATAC-seq ממוטב להערכת נגישות כרומטין ספציפי לאדיפוציט in vivo. פרוטוקול ATAC-seq זה המשתמש בעכבר Adipoq-NuTRAP יצר בהצלחה פרופילי נגישות של כרומטין ספציפיים לאדיפוציט. הגורם הקריטי ביותר לניסויי ATAC-seq מוצלחים וניתנים לשחזור הוא איכות הגרעין. חשוב להקפיא מיד את רקמות השומן המנותחות בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בבטחה בטמפרטורה של -80°C מבלי להפשיר עד לשימוש. כמו כן, חשוב למנוע נזק לגרעין האדיפוציט במהלך בידוד ומיון הגרעין. יש לטפל בדגימות בעדינות באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה ומינ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים רלוונטיים או מהותיים הנוגעים למחקר המתואר במאמר זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי IUSM Showalter Research Trust Fund (ל- H.C.R.), מרכז IUSM לסוכרת ומחלות מטבוליות פיילוט ומענק היתכנות (ל- H.C.R.), המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK129289 ל- H.C.R.), ופרס הפקולטה הצעירה של האגודה האמריקאית לסוכרת (7-21-JDF-056 ל- H.C.R).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>בעלי חיים | |||
| עכבר אדיפונקטין-קר | מעבדת ג'קסון | 28020 | |
| עכבר NuTRAP | מעבדת ג'קסון | 29899 | |
| <חזק>ריאגנטים וריאגנטים חומרים | |||
| 1.5 מ"ל צינורות DNA-LoBind | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 ומיקרו; מסננת תאים m | Falcon | 352-360 | |
| צינורות 15 מ"ל | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD מאגר Illumina | 15027866 | ||
| צלחת PCR 384 בארות | ביוסיסטם יישומי | ||
| 40 ומיקרו; מסננת תאים m | Falcon | 352-340 | |
| צינורות 50 מ"ל | VWR | 525-1077 | |
| מגיב AMPure XP (חרוזי SPRI) | בקמן קולטר | A63881 | |
| ביואנלייזר ערכת DNA רגישות גבוהה | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| סרט דבק שקוף | ביוסיסטם יישומי | 4306311 | |
| מים מזוקקים ללא DNase/RNase | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 מגנט עם חצאית צד | Thermo Fishers | 12027 | |
| צינורות FACS | Falcon | ||
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 מ') | Boston BioProducts | MT-252 | |
| מתלה הפרדה מגנטי לרצועות PCR 8 צינורות | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| ערכת טיהור PCR MinElute | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR רצועת 8 צינורות | ארה"ב מדעי | 1402-4708 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| ערכת בדיקה של Qubit dsDNA HS | Invitrogen | Q32851 | |
| סוכרוז | סיגמא | S0389-1KG | |
| SYBR ירוק I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I אנזים | Illumina | 15027865 | |
| <חזק>מכשירים | |||
| זרימה ציטומטר | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| פלואורומטר קיוביט | Invitrogen | Q33226 | |
| מערכת PCR בזמן אמת | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
מקורות
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R. Transcriptional cont....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
