בדיקת הקרוסלינקינג הכימי BS3 חושפת ביטוי קולטן GABAמופחת בפני השטח של התא במוחות עכברים בתנאי לחץ פסיכו-סוציאלי כרוניים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
BS3 Chemical Crosslinking Assay: הערכת ההשפעה של לחץ כרוני על פני התא GABAמצגת קולטן במוח מכרסם
במאמר זה
סיכום
תקציר
חרדה היא מצב רגשי המשפיע באופן משתנה על התנהגויות בעלי חיים, כולל תפקודים קוגניטיביים. סימנים התנהגותיים של חרדה נצפים ברחבי ממלכת החי וניתן לזהות אותם כתגובות אדפטיביות או לא מסתגלות למגוון רחב של שיטות לחץ. מכרסמים מספקים מודל ניסיוני מוכח למחקרים תרגומיים העוסקים במנגנונים אינטגרטיביים של חרדה ברמה המולקולרית, התאית והמעגלית. בפרט, פרדיגמת הלחץ הפסיכו-סוציאלי הכרוני מעוררת תגובות לא מסתגלות המחקות פנוטיפים התנהגותיים דמויי חרדה/דיכאון המקבילים בין בני אדם למכרסמים. בעוד שמחקרים קודמים הראו השפעות משמעותיות של סטרס כרוני על תכולת המוליכים העצביים במוח, ההשפעה של סטרס על רמות קולטני המוליכים העצביים אינה נחקרת. במאמר זה אנו מציגים שיטה ניסיונית לכימות רמות פני השטח העצביים של קולטני מוליכים עצביים בעכברים תחת לחץ כרוני, במיוחד תוך התמקדות בקולטני חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA), אשר מעורבים בוויסות של רגש וקוגניציה. באמצעות שימוש בקרוסלינקר כימי בלתי הפיך בלתי חדיר ממברנה, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), אנו מראים כי לחץ כרוני מפחית באופן משמעותי את זמינות פני השטח של קולטני GABAA בקליפת המוח הקדם-מצחית. רמות פני השטח העצביים של קולטני GABAA הן התהליך המגביל את קצב ההולכה העצבית של GABA ולכן יכולות לשמש כסמן מולקולרי או כייצוג של מידת הפנוטיפים דמויי חרדה/דיכאון במודלים ניסיוניים של בעלי חיים. גישת הצלבה זו ישימה למגוון מערכות קולטנים עבור מוליכים עצביים או נוירומודולטורים המתבטאים בכל אזור במוח וצפויה לתרום להבנה עמוקה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס הרגש והקוגניציה.
מבוא
קולטני מוליכים עצביים ממוקמים על פני השטח של קרום הפלזמה העצבי או באופן תוך-תאי על האנדוממברנות (למשל, האנדוזום, הרשתית האנדופלסמית [ER], או המנגנון הטרנס-גולגי) ונעים באופן דינמי בין שני תאים אלה בהתאם למצבים פיזיולוגיים פנימיים בנוירונים או בתגובה לפעילות חיצונית של הרשת העצבית 1,2. מאחר שמוליכים עצביים חדשים מפרישים את תפקודיהם הפיזיולוגיים בעיקר דרך מאגר הקולטנים המקומי, רמות קולטני פני השטח של מוליך עצבי נתון הן אחד הגורמים הקריטיים ליכולת האיתות שלו בתוך המעגל העצבי3.
קיימות מספר שיטות לניטור רמות קולטני פני השטח בתאי עצב בתרבית, כולל בדיקת ביוטינילציה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל עבודת בעלי החיים בפרוטוקול זה הושלמה בהתאם לחוק אונטריו לבעלי חיים למחקר (RSO 1990, פרק A.22) והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC) ואושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
1. הכנת בעלי חיים
- לקבוע את מספרי בעלי החיים שישמשו בניסויים, ולחלק אותם לקבוצות מתאימות או לקבוצות ניסוי. ראה פרק הדיון לדיון על גודל הקבוצה, מין וכוח סטטיסטי.
הערה: פרוטוקול זה מותאם אישית לעכברים (זן C57BL6/J; גיל 2-4 חודשים; בדרך כלל 20-30 גרם משקל גוף; מספר שווה ערך של זכרים ונקבות לשימוש). - הניחו את בעלי החיים תחת UCMS או שלטו בתנאים שאינם בסטרס למשך 5-8 שבועות, בהתאם לפרוטוקול כפי שתואר קודםלכן 14....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להדגים את ההיתכנות של בדיקת BS3 crosslinking להערכת רמות α5-GABA A R של פני השטחב-PFC של עכבר, הרצנו 10 מיקרוגרם כל אחת מדגימות החלבון BS3-crosslinked ו-non-crosslinked ב-SDS-PAGE וניתחנו את החלבונים לפי כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-α5-GABAAR (רב-שבטי ארנב) (איור 7). דגימות החלבון הלא מוצלבות נתנו את הכמות הכוללת של α5-GABA A R ב~55 kDa, בעוד שדגימות החלבון המוצלבות BS3 נתנו כמות מסוימת של α5-GABA A R הקשור לרירית הרחם (נודדת ב~55 kDa) יחד עם מיני חלבונים בעלי משקל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות שההשפעה של לחץ פסיכו-סוציאלי כרוני על התנהגויות (כלומר, רגשיות וליקויים קוגניטיביים) ושינויים מולקולריים (כלומר, ביטוי מופחת של גנים GABAergic וליקויים נלווים בהולכה עצבית GABAergic) מתועדים היטב10, המנגנונים העומדים בבסיס ליקויים כאלה זקוקים לחקירה נוספת. בפרט, בהתחשב במחקר האחרון המראה כי מתח כרוני משפיע באופן משמעותי על הפרוטאום העצבי באמצעות עומס יתר על תפקודי המיון, ולכן, מתח מוגבר בחדר המיון15, נותרה שאלה האם מתח כרוני משפיע על סחר GABA A R דרך קרום המיון וכיצד .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מודים לצוות מתקן בעלי החיים CAMH על הטיפול בבעלי החיים לאורך כל תקופת המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), קרן דיסקברי מה-CAMH (ל-T.P.), הברית הלאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (פרס NARSAD #25637 ל-E.S.), ומכון המחקר לבריאות הנפש ע"ש משפחת קמפבל (ל-E.S). א.ס. הוא המייסד של Damona Pharmaceuticals, ביופארמה המוקדשת להבאת תרכובות GABAergic חדשניות למרפאה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5 מ' EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 מ' HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 מ' (45%, w/v) גלוקוז | Sigma | G8769 | |
| 2-מרקפטואתנול | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS מאגר דגימה (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | פורמט ללא שקילה; 10 x 2 מ"ג |
| מטריצת מוח | Ted Pella | 15003 | לעכבר, 30 גרם מבוגר, קורונלי, 1 מ"מ |
| סידן כלורי (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| בדיקה מעוקלת | Fine Science Tools | 10088-15 | בדיקת אנטומיה גסה; זווית 45 |
| מים נטולי יונים | milli-Q | EQ 7000 | מים טהורים במיוחד [התנגדות 18.2 MΩ · ס"מ @ 25 & deg; C; סה"כ פחמן אורגני (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| (3 מ"מ) | Whatman | 3030-917 | |
| מלקחיים (גדולים) | Fine Science | Tools 11152-10 | מלקחיים דקים במיוחד |
| קטנים) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 מלקחיים |
| GABA-A R אלפא 5 נוגדן | Invitrogen | PA5-31163 | ארנב רב-שבטי IgG; לזהות אות שגוי בעת קישור צולב כימי |
| GABA-A R אלפא 5 נוגדן C-terminus | R& D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; מגיב עם עכבר וחולדה |
| גליצין | סיגמא | W328707 | |
| חזרת פרוקסידאז מצומד עזים נגד ארנב IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| מגנזיום כלוריד (MgCl2· 6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, תחליף (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Sigma | P9541 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | Sigma | P8340 | |
| PVDF ממברנה | Bio-Rad | 1620177 | |
| מספריים (גדולים) | כלים מדעיים עדינים | 14007-14 | מספריים כירורגיים - מספריים משוננים |
| (קטנים) | כלי מדע עדינים | 14060-09 | מספריים עדינים - |
| נתרן כלורי חד (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| סוניקטור (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| צנטריפוגה משופרת שולחנית | Eppendorf | 5425R | |
| ניקוב רקמות (ID 1 מ"מ) | טד פלה | 15110-10 | Miltex ביופסיה אגרוף עם בוכנה, ID 1.0 מ"מ, OD 1.27 מ"מ |
| טרנס-בלוט טורבו 5x חוצץ העברה | Bio-Rad | 10026938 | |
| מסובב צינור (LabRoller) | Labnet | H5000 |
מקורות
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
