מאמר שיטה

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65064

⸱

24 בפברואר 2023

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

תקציר

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans קיימים כהרמפרודיטים המפרים את עצמם, אשר מייצרים צאצאים גדולים - כאשר הזכרים נוכחים, הם יכולים לייצר צאצאים גדולים עוד יותר של צאצאים צולבים. טעויות במיוזה, הפריה ואמבריוגנזה ניתנות להערכה מהירה כפנוטיפים של עקרות, פוריות מופחתת או קטלניות עוברית. מאמר זה מתאר שיטה לקביעת הכדאיות העוברית וגודל הברוד ב- C. elegans. אנו מדגימים כיצד להגדיר בדיקה זו על ידי בחירת תולעת על לוחית בודדת של צעירים מעובדים, רק Bacto-peptone (MYOB), קובעים את מסגרת הזמן המתאימה לספירת צאצאים בני קיימא ועוברים שאינם בני קיימא, ומסבירים כיצד לספור במדויק דגימות תולעים חיות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע כדאיות בהפריה עצמית hermaphrodites כמו גם הפריה הדדית על ידי זוגות הזדווגות. ניסויים פשוטים יחסית אלה ניתנים לאימוץ בקלות עבור חוקרים חדשים, כגון סטודנטים לתואר ראשון וסטודנטים בשנה הראשונה לתואר שני.

מבוא

רבייה מינית באורגניזמים איקריוטים דורשת ייצור של גמטות פונקציונליות המתמזגות ליצירת עובר בתהליך ההפריה. הגמטות האימהיות והאבהיות, הביציות והזרע נוצרים באמצעות תהליכי חלוקת תאים מיוחדים ותהליכי התמיינות של מיוזה וגמטוגנזה1. מיוזה מתחילה בתא דיפלואידי יחיד ומסתיימת בהיווצרות תאי בת המכילים מחצית ממספר הכרומוזומים של תא ההורים המקורי. החל מהפחתת פלואידיות ועד לדשדוש של חומר גנטי באמצעות מבחר עצמאי ורקומבינציה מוצלבת, מיוזה ממלאת מספר פונקציות חשובות1. טעויות בתוך מיוזה יכולות לגרום לאנאופלואידיה, שבה יש יותר מדי או מעט מדי כרומוזומים בתוך גמטה. למקרים של אנופלואידיה יש השפעות עצומות על בריאות האדם, שכן חוסר איזון כרומוזומלי הוא הגורם העיקרי להפלות והפרעות התפתחותיות כגון תסמונת דאון ותסמונת אדוארדס2.

הפריה היא התהליך שבו הגמטות האימהיות והאבהיות מתמזגות ליצירת אורגניזם חדש3. זיהוי Gamete-gamete הוא הקל על ידי חלבונים על פני הגמטה3. שגיאות בתאימות הגמטה מובילות לאי פוריות מכיוון שאיחוי זרע וביצית אינו מסוגל להמשיך. איחוי זרע עם ביצית מעורר שורה של אירועים המובילים להיווצרות נכונה של עובר פעיל שיכול להתחיל את המסע ההתפתחותי מעובר חד תאי לאורגניזם רב-תאי המתפקד במלואו באמצעות חלוקות מיטוטיות4. במהלך האמבריוגנזה, אירועים מולקולריים המווסתים את ההתפתחות חייבים להיות מוסדרים היטב ומתוזמנים במדויק כדי לאפשר צמיחה תקינה של האורגניזם5. התמיינות תאית נכונה במהלך ההתפתחות המוקדמת היא חיונית כאשר האורגניזם עובר מעובר פלוריפוטנטי לאורגניזם מלא. בשל מורכבותם של אירועים אלה, שיבושים עלולים להוביל למומים התפתחותיים הגורמים לקטלניות עוברית.

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה, הפריה והתפתחות עוברית. C. elegans היא נמטודה שקופה בעלת שני מינים, זכרים והרמפרודיטים. C. elegans hermaphrodites, אשר מסוגלים להפריה עצמית, הם המין השולט 6,7. הגונד ההרמפרודיטי מייצר לראשונה זרע בשלב הזחל הרביעי (L4), המאוחסנים בזרעונים. במעבר L4 לבגרות, קו הנבט עובר לייצור ביציות, אשר מופרות לאחר מכן באמצעות הזרע המאוחסן. זכרים, אשר מתעוררים hermaphrodites בשיעור של פחות מ 0.2%, רק לייצר זרע יכול להזדווג עם hermaphrodites. בהפריה צולבת, הזרע הגברי עולה על הזרע ההרמפרודיטי בהפריית הביציות8. זה מאפשר תחזוקה קלה יחסית של מוטנטים הומוזיגוטיים באמצעות מניות הפריה עצמית ומניפולציות גנטיות באמצעות הצלבות גנטיות. שני המינים מאפשרים מחקרים הבוחנים הבדלים בין מיוזה בקווי נבט זכריים ונקביים. יתר על כן, בשל האופי השקוף של C. elegans וביציותיו, ניתן לחקור את תהליכי המיוזה, הגמטוגנזה, ההפריה והאמבריוגנזה בבעלי חיים חיים ושלמים באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית.

כאשר מנתחים מוטציות חדשות בגנים שעשויות לשחק תפקיד במיוזה, הפריה ו / או התפתחות עוברית ב- C. elegans, צעד ראשון מכריע הוא קביעת הכדאיות העוברית וגודל הצאצא, שכן טעויות בתהליכים אלה מובילות לעתים קרובות לכישלון או לירידה בייצור צאצאים בני קיימא. מאמר זה מתאר פרוטוקול להערכת פוריות, כדאיות העובר וגודל הרבייה מהרמפרודיטים המפרים את עצמם או מהכלאות בין הרמפרודיטים לזכרים. בעוד שבדיקה קלאסית זו שימשה במחקרים רבים של C. elegans , אנו מספקים פרוטוקול סטנדרטי להתקנה וכימות מדויק. בפרוטוקול זה, תולעים בודדות או זוגות זכרים/הרמפרודיטים מבודדים כדי לאפשר הזדווגות ויצירת צאצאים. ייצור צאצאים ויכולת קיום נצפים במשך סדרה של ימים כדי לקבוע את מספר הצאצאים ברי קיימא ועוברים שאינם בני קיימא. בסיום הניסוי מנתחים גזעים בודדים כדי לחשב את אחוז הכדאיות העוברית ואת גודל הברוד הכולל.

פרוטוקול

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת צלחות ניסוי

  1. הכינו צלחות פטרי בקוטר 35 מ"מ עם מדיית בקטו-פפטון (MYOB) של Young Youngren's שונה. כדי להכין צלחות MYOB, הוסף 20 גרם של אגר Bacto, 2 גרם של NaCl, 0.55 גרם של Trizma-HCl, 0.24 גרם של Trizma-OH, 3.1 גרם של פפטון Bacto, ו 1.6 מ"ל של כולסטרול ל 1 L של ddH2O ו autoclave במשך 40 דקות ב 121 ° C. מצננים ל-55 מעלות צלזיוס ובטכניקה סטרילית יוצקים 4 מ"ל מהמדיה המותכת לכל צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ.
    הערה: ליטר MYOB מייצר ~ 250 צלחות, אשר ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים. אנו ממליצים על מינימום של 10 פרטים לכל שכפול עם שלוש ערכות שכפול לכל זן.
  2. בטכניקה סטרילית, זרעו את הצלחות עם נקודה קטנה (כ -50 מיקרוליטר) של חיידקי OP50 במרכז הצלחת.
    הערה: מדשאות קטנות חשובות במיוחד להערכת הפריה צולבת מכיוון שהנקודה הקטנה יותר מובילה למפגשים מוגברים בין זכרים להרמפרודיטים, ובכך מגדילה את הסיכוי להזדווג.

2. בדיקות כדאיות עוברית (הפריה עצמית הרמפרודיטית)

  1. יום 1
    1. תייגו את גב כל צלחת. הקפידו לעקוב אחר כל צלחת והתולעים המתאימות לה לאורך כל הניסוי.
      הערה: טכניקת תיוג מועדפת-יום 1: תולעת 1, יום 1: תולעת 2, ... וכו.
    2. העבירו הרמפרודיט בודד בשלב L4 על כל צלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת. אפשרו לתולעים להתפתח למבוגרים ולהניח צאצאים עצמיים במשך 24 שעות בטמפרטורת הגידול הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס. הבקיעו את הצלחות האלה ביום השלישי.
      הערה: הטמפרטורה של ניסויים יכולה להשתנות במקרה של מוטציות רגישות לטמפרטורה. עבור מוטציות רגישות לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות כדאיות עוברית הן בטמפרטורה המתירנית (15-16 מעלות צלזיוס) והן בטמפרטורה הלא מתירנית (24-26 מעלות צלזיוס).
  2. יום 2
    1. תווית קבוצה של צלחות חדשות-יום 2: תולעת 1, יום 2: תולעת 2, ... וכו.
    2. העבירו תולעים בודדות ביום הראשון לצלחות החדשות.
      הערה: תולעים אלה היו צריכות להגיע לבגרות, ותולעים מסוג בר היו צריכות כבר להתחיל להטיל עוברים.
    3. אפשרו לתולעים להטיל עוברים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או בטמפרטורה מתאימה אחרת. ציון צלחות אלה ביום 4.
  3. יום 3
    1. תייגו קבוצה של לוחות חדשים. יום 3: תולעת 1, יום 3: תולעת 2, ... וכו.
    2. מעבירים תולעים בודדות ביום 2 לצלחות חדשות. אפשר להם להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 ° C או טמפרטורה מתאימה אחרת. ציון צלחות אלה ביום 5.
      הערה: במקרים של טמפרטורות נמוכות יותר, זמני הבקיעה יוארכו. התאימו בהתאם.
    3. ציירו דוגמת רשת על מכסה של 35 מ"מ באמצעות סמן עדין. הניחו את המכסה המרושת מתחת ללוחית הבדיקה לצורך ספירה כדי לעקוב אחר תולעים שנספרו בעבר (איור 1A-B).
      1. באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, להבקיע את היום 1 לוחות עבור נוכחות או היעדר צאצאים. ספרו את הזחלים החיים ואת העוברים שלא בקעו.
        הערה: בשלב זה, חלף מספיק זמן כך שכל עובר בר קיימא היה צריך לבקוע. כל עובר שלא בקע הוא בחזקת מת.
      2. בתוך ריבוע בודד, ספרו את העוברים שלא בקעו ואת הזחלים החיים שנמצאים לגמרי בתוך הריבוע (איור 1C-F).
      3. עבור תולעים שנמצאות על הגבולות המרובעים, יש לספור על סמך מיקום ראש התולעת. ספרו תולעים שראשיהן נוגעים בקצה העליון והשמאלי של הריבוע (אין לספור את אלה שנוגעות בקצה התחתון או הימני; איור 1D). אל תספרו ביציות לא מופרות עבור הבדיקה הזו (איור 1F).
    4. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.
  4. יום 4
    1. ציון היום 2 לוחות על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.
  5. יום 5
    1. ציון היום 3 לוחות על ידי ספירת הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה. נתח את הנתונים המתקבלים באמצעות השיטה המתוארת בניתוח הנתונים.
      הערה: לחלק מהמוטנטים הגנטיים עשוי להיות מחזור רבייה מושהה או מורחב. עקוב אחר זנים בודדים להמשך הטלת עוברים מעבר ליום 3 פלטות. אם ייצור העוברים לא הופסק עד היום הרביעי, המשיכו להעביר מבוגרים לצלחות חדשות.

3. מבחני כדאיות עוברית (הפריה צולבת זכרית/הרמפרודיט)

  1. יום 1
    1. תייגו את גב כל צלחת. הקפידו לעקוב אחר כל צלחת והתולעים המתאימות לה לאורך כל הניסוי.
    2. העבירו תולעת הרמפרודיט L4 בודדת לכל צלחת. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת.
      הערה: זנים נשיים, כגון מוטציות אובדן תפקוד של fog-2 , שאינם מייצרים זרע, יכולים לשמש במקום הרמפרודיטים.
    3. העבירו תולעת זכרית L4 בודדת לכל צלחת מסומנת המכילה הרמפרודיט L4. ודא שלא מועברים עוברים או תולעים אחרות לצלחת.
      הערה: ניתן להשתמש בזנים כגון זכרים מסוג plg-1 כדי לזהות אם התרחשה הזדווגות, מכיוון שזכרים אלה מפקידים פקק כפייתי על הפות ההרמפרודיטי לאחר ההזדווגות.
    4. אפשרו לתולעים להזדווג ולהניח צאצאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום השלישי.
  2. יום 2
    1. תייגו קבוצה של צלחות חדשות והעבירו את התולעים, כמו ביום השני לעיל. במקרה זה, הקפד להעביר הן את hermaphrodite ואת זכר על לוחות חדשים. ודא כי hermaphrodite הגיע לבגרות.
    2. אפשר hermaphrodites להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 ° C, או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור זחלים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום 4.
  3. יום 3
    1. תייגו קבוצה של צלחות חדשות והעבירו את התולעים, כמו ביום 3 לעיל. דאגו להעביר גם את ההרמפרודיט וגם את הזכר לצלחות חדשות.
    2. אפשר להניח צאצאים במשך 24 שעות ב 20 °C (75 °F), או טמפרטורה מתאימה אחרת. ניקוד לוחות אלה עבור עוברים חיים לעומת עוברים שלא בקעו ביום 5.
    3. באמצעות מונה תאים דיפרנציאלי, ספור את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום הראשון של הצלחות, כמתואר בשלב 2.3.3.1.
      הערה: אין להשליך את הצלחות, מכיוון שהן נדרשות ליום 4.
    4. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.
  4. יום 4
    1. ספור את הצאצאים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום 2 פלטות, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה.
    2. בדוק את היום 1 צלחות לזכרים. אם התרחשה הזדווגות, היחס הגנטי הצפוי של הרמפרודיטים לזכרים צריך להיות 50:50. אם צלחות יום 1 אינן מכילות זכרים, ההזדווגות בין הזכר להרמפרודיט לא התרחשה. השליכו את זוג ההזדווגות הזה ותיעדו את התצפית הזו במחברת המעבדה.
  5. יום 5
    1. ספור את הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו מהיום 3 לוחות, כמתואר בשלב 2.3.3.1. רשום את מספר הזחלים החיים והעוברים שלא בקעו במחברת מעבדה. נתח את הנתונים המתקבלים באמצעות השיטות המתוארות בניתוח הנתונים.

4. ניתוח נתונים

  1. חישוב אחוז הכדאיות העוברית של העתק ביולוגי נתון של זן באמצעות משוואה (1).
    הערה: מספר הצאצאים החיים והעוברים שלא בקעו מתקבל על ידי סיכום הספירה היומית לאורך תקופת הניסוי.
    figure-protocol-1(1)
  2. חישוב גודל התולעת לכל תולעת מזן נתון על ידי סיכום מספר הצאצאים (עוברים וזחלים שלא בקעו) המיוצרים על ידי הרמפרודיט ההורה. חשב את גודל הברוד הממוצע באמצעות משוואה (2).
    figure-protocol-2(2)
  3. דווח על אחוז הכדאיות העוברית וגודל הברוד הממוצע עם הממוצע וסטיית התקן בין ההעתקים הביולוגיים. בצע מבחן t של התלמיד המשווה את נתוני הבקרה והניסוי.

תוצאות

ביצענו בדיקות כדאיות עוברית וגודל ברוד על N2 (סוג פראי) ועל שני זנים בעלי מוטציות בגנים המעורבים במיוזה, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79). מכיוון שגם HIM-5 וגם SPO-11 ממלאים תפקיד בהיווצרות הצלבה מיוטית, מוטציות בשני גנים אלה גורמות להיווצרות גמטות אנאופלואידיות. בדיקת כדאיות עוברית זו עבור N2 הניבה אחוז כדאיות של 98.9%, בעוד שגם HIM-5 (e1490) וגם spo-11(ok79) הראו ירידה בכדאיות הצאצאים עם אחוזים של 74.9% ו-0.8%, בהתאמה (איור 2A; עמ' < 0.0005). תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם תוצאותשפורסמו בעבר 7,9. גודל הברוד הממוצע של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) נקבע כ-217, 105 ו-219, בהתאמה (איור 2B). בהתאם לפרסומים קודמים, ל-him-5 (e1490) יש גודל קטן משמעותית בהשוואה לסוג הבר, בעוד ש-spo-11(ok79) אינו 7,9.

figure-results-1
איור 1: הדגמה של מערך ספירה ומורפולוגיה של עוברים על לוחות . (A) תמונה של מכסה עם תבנית רשת צולבת שצוירה באמצעות שארפ עדין. (B) לוחית MYOB בקוטר 35 מ"מ עם מכסה עם דוגמה מתחתיה לצורך ספירה. (C) תמונה המדגימה שדה ראייה בהגדלה נמוכה (10x) המציג תיבות מרובות של הרשת. ראשי חץ לבנים מצביעים על כמה זחלים בתוך שדה ראייה זה. הספירה צריכה להיעשות בהגדלה גבוהה יותר (רק ריבוע אחד בשדה) כדי לצפות הן בזחלים והן בעוברים. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. (D) קריקטורה של המכסה עם תבנית הרשת הממוקמת מתחת ללוח 35 מ"מ. הכניסה מציינת את הטכניקה הנכונה כדי לקבוע אילו זחלים נספרים בריבוע נתון. ספירה מלמעלה למטה, משמאל לימין. ספרו את כל התולעים שנמצאות לגמרי בתוך הריבוע. יש לספור תולעים הנוגעות בגבול על פי מיקום ראש התולעת, ולא הזנב. ספירת תולעים הפונות לרשת הנוכחית או רשתות שנספרו בעבר (כלומר, קצה עליון וקצה שמאלי). אין לספור תולעים עם ראשים הנוגעים בקצוות התחתונים או הימניים. מההתחלה, תולעים כחולות ייספרו ואילו תולעים אדומות לא. (E) תמונה מייצגת של זחלים בריאים N2 L1 שבקעו (ראש חץ לבן). (F) תמונה מייצגת של ביצית לא מופרית (ראש חץ שחור) ועובר שלא בקע (ראש חץ אדום). ביציות לא מופרות לא צריך להיספר עבור בדיקה זו. פסי קנה מידה (E,F) = (100 מיקרומטר). הערה: התמונות ב-C, E ו-F צולמו במיקרוסקופ Zeiss AxioZoom, עם מצלמה מחוברת לצורך הדגמת המראה של זחלים, עוברים וביציות על לוחות תולעים. עבור בדיקות כדאיות עוברית, הספירה נעשית תוך התבוננות בלוחות באמצעות סטריאומיקרוסקופ (ללא מצלמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: גרפים מייצגים המתארים את התוצאות של מבחני כדאיות עובריים וגדלי ברוד. (A) אחוז הכדאיות העוברית של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) ב-20°C. (B) גדלי Brood של N2, him-5(e1490) ו-spo-11(ok79) ב-20°C . צאצאיהם של לפחות 28 הרמפרודיטים הובקעו עבור כל זן. המספר הכולל של עוברים שלא בקעו בתוספת זחלים שנבדקו היו N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945, ו- spo-11(ok79) = 7,230. קווי שגיאה מציינים את סטיית התקן על-פני שלושה עותקים משוכפלים נפרדים. סטטיסטיקה מחושבת באמצעות מבחן t של תלמיד, n.s. = לא מובהק, *p < 0.0005. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ריבוי מינים המתרבים מינית דורש היווצרות של גמטות הפלואידים (כלומר, ביציות וזרע) באמצעות מיוזה, אשר לאחר מכן מאוחדים בעת ההפריה, שחזור מספר הכרומוזום הדיפלואידי והתחלת התפתחות עוברית. טעויות בכל אחד מהתהליכים הללו עלולות להוביל לאי פוריות, קטלניות עוברית ו / או מומים מולדים. C. elegans היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקר רבייה מינית. ניתן להעריך את ההשפעות של מוטציות גנטיות או הפלת ביטוי גנים (למשל, הפרעות RNA) במהירות ובקלות יחסית באמצעות מבחני הכדאיות העוברית ומבחני גודל הברוד שתוארו לעיל. השתמשנו בשיטות אלה לאפיון ראשוני של גנים המעורבים בהפרדת כרומוזומים מיוטיים והפריה/הפעלת ביציות10,11,12. ירידה שנצפתה בכדאיות העוברית או בגודל הברוד מצביעה על הפרעה במיוזה, בגמטוגנזה, בהפריה או באמבריוגנזה.

מכיוון שהכדאיות העוברית וגודל הצאצא מוערכים בקלות יחסית באמצעות ספירת צאצאים וחישוב מתמטי פשוט, אלה הם ניסויי מבוא אופטימליים לטירוני מחקר במעבדה או בכיתה. קלות הגידול של C. elegans והיתרונות הכלכליים הופכים אותם למתאימים במיוחד לשיעורי ביולוגיה ניסויית. הסטודנטים צוברים ניסיון מחקרי רב ערך באמצעות גידול C. elegans , לומדים להשתמש במיקרוסקופים מנתחים, ויכולים לשאול שאלות ביולוגיות במערכת התפתחותית שניתן לענות עליהן בזמן קצר יחסית (כ -5 ימים עם הפרוטוקול המתואר במאמר זה).

העיתוי של ספירת הצאצאים חשוב מאוד לבדיקות כדאיות עוברית. ב 20 ° C, embryogenesis לוקח בערך 16 שעות, ובוגרים רבייה מתחילים להטיל ביצים כ 60 שעות לאחר בקיעה כמו זחלי L1. מכיוון שמחזור החיים מהיר, חשוב לספור את הצאצאים בחלון המתאים, מה שמאפשר מספיק זמן לעוברים לבקוע אך לפני שהצאצאים עצמם מתחילים להטיל ביצים. חשוב גם לציין כי תקופות הצמיחה משתנות בהתאם לטמפרטורה. הצמיחה היא בערך 2.1 פעמים מהר יותר ב 24-25 ° C מאשר 15-16 ° C, וכ 1.3 פעמים מהר יותר ב 20 ° C מאשר 15-16 ° C13. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים שהספירה תתרחש 48 שעות לאחר שהמבוגרים מונחים על צלחת טרייה. מסגרת זמן זו מבטיחה כי לכל העוברים עם התפתחות מסוג בר יש מספיק זמן לבקוע (>16 שעות), אך הם אינם מזדקנים עד לנקודת יכולת הרבייה. ייתכן שיהיה צורך להאריך בדיקות המבוצעות בטמפרטורות נמוכות מ-20 מעלות צלזיוס (להעביר בעלי חיים למשך 4 ימים) כדי שהעוברים יבקעו וכדי שצאצאים שבקעו יגיעו לשלבי זחל שקל יותר לצפות בהם בקרב החיידקים על לוחות MYOB (שלבי L3-L4).

מגבלה במבחני הכדאיות העוברית ובגודל הברוד היא שהתהליך ההתפתחותי הספציפי שמוטרד אינו נראה לעין. עם זאת, בדיקות ראשוניות אלה ניתן לעקוב עם טכניקות ציטולוגיות כדי לקבוע איזה תהליך מושפע. לדוגמה, דיסקציה של התולעים הבוגרות כדי לשחרר את הגונד ואחריה צביעה של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) וניתוח זהיר של מורפולוגיה של DNA בתוך קו הנבט יכולים לגלות אם תהליכים מיוטיים משובשים. בנוסף, צביעת DAPI של עוברים יכולה לחשוף באיזה שלב אמבריוגנזה נעצרת.

לסיכום, תיארנו פרוטוקול להערכת מספר העוברים המיוצרים (brood) ואחוז העוברים שהם ברי קיימא עבור מוטציות שונות של C. elegans. בדיקה זו יכולה לשמש הן להרמפרודיטים המפרים את עצמם והן לצלבים זכריים/הרמפרודיטים. עם מחזור החיים הקצר של C. elegans, פרוטוקול זה יכול להסתיים בתוך פחות משבוע אחד. מבחני כדאיות עוברית וגדלי ברוד יכולים לשמש כאנליזות ראשונות של גנים המעורבים במיוזה, הפריה או התפתחות עוברית, והם פרוטוקולים מתאימים לחוקרים מתקדמים יותר ולטירוני מחקר (סטודנטים לתואר ראשון ושנה א' לתואר שני) כאחד.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

העבודה במעבדת Jaramillo-Lambert נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS R35GM142524. כל זני C. elegans סופקו על ידי המרכז לגנטיקה Caenorhabditis , הממומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, P40 OD010440. איור 1D נוצר באמצעות Biorender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
35 מ"מ צלחות פטריTritech researchT3501ניתן לערום למחצה, לא מאוורר.
בקטו אגרבקטון, דיקינסון ושות'214010עבור MYOB
בקטו-פפטוןג'יבקו211677עבור MYOB
כולסטרולסיגמא C8503עבור MYOB
נתרן כלורידJ.T. בייקרFW 58.440עבור MYOB
Trizma בסיסSigmaT1503עבור MYOB
Trizma hydrochlorideSigmaT3253עבור MYOB
זנים
C. elegans wild סוגזן Caenorhabditis Genetics CenterN2
Escherichia coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
him-5(e1490)Caenorhabditis Genetics CenterDR466
spo-11(ok79)Caenorhabditis Genetics CenterAV106
Equipment/software
מונה תאים דיפרנציאליפישר סיינטיפיק02-670-12
MicroSoft Excel או PrismMicroSoft או GraphPadלהקלטה ויצירת ייצוגים גרפיים של נתונים.
חוט פלטינהTritech researchPT9901להכנת קטיף תולעים. 99.5% פלטינה, 0.5% אירידיום. זה מגיע כ-3 רגל/חבילה, וזה מספיק לביצוע 36 פיקים של תולעים (~1 אינץ' חוט פלטינה לכל פיק).
סטריאומיקרוסקופNikonSMZ-745בסיס דיאסקופי עם תושבת מיקוד, מודול LED משולב, כבל חשמל, טווח זום של 6.7x עד 50x [WD 115 מ"מ], עינית שדה רחב C-15x/17 (הערה: סטריאומיקרוסקופים מקבילים זמינים מיצרנים אחרים.)
תולעת פיק ידיתTritech מחקרTWPH1להכנת קטיף תולעים. התקן ~1 בחוט פלטינה לתוך ידית איסוף תולעת. לחלופין, ניתן לבצע קטיף תולעים על ידי הרכבת חוט פלטינה בפיפטה פסטר מזכוכית.

מקורות

  1. Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. Meiosis. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).
  2. O'Connor, C. Chromosomal abnormalities: aneuploidies. Nature Education. 1 (1), 172(2008).
  3. Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. Fertilization. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).
  4. Marcello, M. R., Singson, A. Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans. BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).
  5. Robertson, S., Lin, R. The oocyte-to-embryo transition. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).
  7. Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  8. Chu, D. S., Shakes, D. C. Spermatogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).
  9. Dernburg, A. F., et al. Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis. Cell. 94 (3), 387-398 (1998).
  10. Bhandari, N., et al. Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans. G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).
  11. Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis. Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).
  12. Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans. microPublication Biology. , (2020).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

התפתחות תולעיםהפריה של הרמפרודיטהפריה צולבתסופר תאים דיפרנציאליקטלניות עובריתספירת זחלים חייםמוטציות התפתחותיות
מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.