Method Article

אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש Epimedii Folium ובדיקת השפעתה על התפתחות עוברית של דגי זברה

DOI:

10.3791/65096

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש של Epimedii folium (EF) עברה אופטימיזציה על ידי יישום מתודולוגיית תכנון-תגובה ניסיונית של Box-Behnken, וההשפעה של EF גולמי וממוטב המופק במים על התפתחות עוברית של דגי זברה נחקרה באופן ראשוני.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל- Epimedii folium (EF) יש היסטוריה ברפואה ובמזון בת > 2,000 שנה. מבחינה קלינית, EF מעובד עם שמן כבש משמש לעתים קרובות כתרופה. בשנים האחרונות התרבו בהדרגה הדיווחים על סיכוני בטיחות ותגובות שליליות של מוצרים המשתמשים ב-EF כחומר גלם. עיבוד יכול לשפר ביעילות את הבטיחות של TCM. על פי תיאוריית TCM, עיבוד שמן כבש יכול להפחית את הרעילות של EF ולשפר את ההשפעה המחזקת שלו על הכליות. עם זאת, קיים מחסור במחקר שיטתי והערכה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF. במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken כדי למטב את הפרמטרים העיקריים של טכנולוגיית העיבוד על ידי הערכת התוכן של רכיבים מרובים. התוצאות הראו כי הטכנולוגיה האופטימלית לעיבוד שמן כבש של EF הייתה כדלקמן: חימום שמן הכבש ב 120 ° C ± 10 ° C, הוספת EF גולמי, מוקפץ אותו בעדינות ל 189 ° C ± 10 ° C עד שהוא מבריק באופן שווה, ולאחר מכן להסיר אותו מגניב. על כל 100 ק"ג של EF, יש להשתמש ב-15 ק"ג שמן כבש. הרעילות והטרטוגניות של תמצית מימית של EF מעובד של שמן גולמי ושמן כבש הושוו במודל התפתחותי של עוברים של דגי זברה. התוצאות הראו כי קבוצת העשבים הגולמי הייתה בעלת סיכוי גבוה יותר לגרום לעיוותים בדגי זברה, וריכוז ה-EF הקטלני החצי מקסימלי שלה היה נמוך יותר. לסיכום, טכנולוגיית עיבוד שמן הכבש האופטימלית הייתה יציבה ואמינה, עם חזרתיות טובה. במינון מסוים, התמצית המימית של EF הייתה רעילה להתפתחות עוברים של דגי זברה, והרעילות הייתה חזקה יותר עבור התרופה הגולמית מאשר עבור התרופה המעובדת. התוצאות הראו כי עיבוד שמן כבש הפחית את הרעילות של EF גולמי. ממצאים אלה יכולים לשמש לשיפור האיכות, האחידות והבטיחות הקלינית של EF מעובד בשמן כבש.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epimedii folium (EF) הוא העלים המיובשים של Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., או Epimedium koreanum Nakai. EF יכול לשמש לטיפול אוסטאופורוזיס, תסמונת גיל המעבר, גושים בשד, יתר לחץ דם, מחלת לב כלילית, ומחלות אחרות1. כרפואה סינית מסורתית (TCM), ל-EF יש היסטוריה ברפואה ובמזון של יותר מ-2,000 שנה. בשל מחירו הנמוך והשפעתו יוצאת הדופן של חיטוב הכליות, הוא נמצא בשימוש נרחב בתרופות ובמזון בריאות. EF מעובד על ידי הקפצה עם שמן כבש, תהליך שתואר לראשונה בתורת עיבוד ליי גונג שנכתבה על ידי ליי שיאו בתקופת ליו סונג2. היעילות של EF גולמי ו-EF מוקפץ שונה לגמרי. EF גולמי בעיקר מפיג שיגרון, בעוד EF מוקפץ מחמם את הכליות כדי לחזק יאנג3. כיום, EF נמצא בשימוש נרחב כחומר גלם בתרופות ומזון בריאות; ישנם 399 תרופות פטנט סיניות רשומות, תשעה מזונות בריאות מיובאים, ו 455 מזונות בריאות מקומיים עם EF כחומר גלם4. חומר מרפא זה יש לקוחות פוטנציאליים יישום גדול. עם זאת, בשנים האחרונות התרבו הדיווחים על תופעות לוואי ופגיעה בכבד האנושי שנגרמו על ידי מזון בריאות ותרופות פטנט סיניות המשתמשות ב-EF כחומר גלם, ומחקרי רעילות קשורים 5,6,7 דיווחו כי ל-EF כחומר גלם יש סיכוני בטיחות פוטנציאליים.

עיבוד רפואי סיני מתייחס לטכניקות פרמצבטיות שיכולות להפחית או לחסל ביעילות את הרעילות ולשפר את הבטיחות של TCMs. שיטת העיבוד המסורתית של EF היא הקפצה עם שמן כבש, אשר מפחית את הרעילות של EF ומגביר את השפעתו של חימום הכליות וקידום יאנג8. שיטת עיבוד זו כלולה בפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד שונים1. התהליך של EF מוגדר רק כדלקמן: על כל 100 ק"ג של EF, 20 ק"ג שמן שפיר (מזוקק) מתווסף, והוא נורה בעדינות עד אחיד ומבריק1. אין פרמטרים קפדניים של שיטת עיבוד EF בתקנים לעיל, ולכן מפרטי עיבוד מקומיים לא אוחדו כדי לספק עקביות. לכן, זה יהיה שימושי לנהל מחקר שיטתי של תהליך EF. במאמר זה, שיטת משטח התכנון-תגובה הניסיונית Box-Behnken שימשה לאופטימיזציה של טכנולוגיית העיבוד של EF.

התכנון הניסיוני של Box-Behnken הוא שיטה המשמשת בדרך כלל לאופטימיזציה של הגורמים בתהליך. ניתן למטב את פרמטרי החילוץ על ידי קביעת הקשר הפונקציונלי בין גורמים המתאימים למשוואות רגרסיה מרובות לבין ערכי אפקט. לאחרונה, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקר מיצוי TCM 5,6,7 ועיבוד 9,10,11. מחקרים שונים דיווחו על שיטות הכנת TCM הכוללות עיבוד מלח, עיבוד יין והקפצה בעקבות עיצוב Box-Behnken, כגון Psoraleae fructus 12 מעובד במלח, Cnidii fructus13 מעובד יין, ו Cinnamomi ramulus14 קלוי. שיטה זו צמצמה את זמן הבדיקה, דיוק בדיקה גבוה, והיא מתאימה לבדיקות מרובות גורמים ורב-שכבתיים. השיטה פשוטה יותר משיטת בדיקת התכנון האורתוגונלי ומקיפה יותר משיטת התכנון האחיד15. הקשרים המתקבלים יכולים לקבוע את הערך החזוי של כל נקודת בדיקה בטווח הבדיקה, וזה יתרון גדול. מודל דג זברה יכול לשמש כדי לבדוק אם EF הוא פחות רעיל לאחר עיבוד.

במחקרי רעילות TCM, למודל דגי הזברה יש את היתרונות הכפולים של התפוקה הגבוהה של ניסויים בתאים ואת הדמיון לניסויים במכרסמים16. מודל זה מאופיין בגודלו הקטן, קצב השרצה גבוה, מחזור רבייה קצר וקלות הרבייה. ניתן להשתמש במודל בניסויים סינכרוניים בקנה מידה גדול בצלחות תרבית תאים, ומינון התרופה הניסיונית קטן, מחזור הניסוי קצר, העלות נמוכה, וכל תהליך הניסוי קל לצפייה ולתפעול17. עוברי דגי זברה הם שקופים ומתפתחים במהירות. לכן, את הרעילות ואת ההשפעות הטרטוגניות של תרופות על רקמות הקרביים בשלבים התפתחותיים שונים ניתן לראות ישירות תחת מיקרוסקופ18. ההומולוגיה הגנטית בין דגי זברה לבני אדם היא גבוהה עד 85%18. מסלול העברת האותות של דגי זברה דומה לזה של בני אדם18. המבנה הביולוגי והתפקוד הפיזיולוגי של דגי הזברה דומים מאוד לאלה של יונקים18. לכן, מודל דגי זברה לבדיקות סמים יכול לספק חיות ניסוי אמינות וישימות באופן מלא לבני אדם19.

במחקר זה, השתמשנו במתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken כדי למטב את הכמות והטמפרטורה של שמן כבש ואת טמפרטורת הטיגון המשמשת בטכנולוגיית עיבוד EF, עם התוכן של icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C ו- baohuoside I כמדדי הערכה. מודל דגי הזברה שימש לחקירה ראשונית של ההשפעה של תמצית מים EF על התפתחות עוברית של דגי זברה לפני ואחרי עיבוד כדי להעריך את השפעת ההנחתה של העיבוד על EF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים הקשורים בבעלי חיים נערכו באישור ועדת האתיקה של הניסויים של מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מספר תעודת סקירת אתיקה של חיות מעבדה: ZJS2022-03).

1. קביעת המרכיבים הביו-אקטיביים

הערה: המין ששימש במחקר זה היה Epimedium sagittatum, והדגימות נאספו במחוז פנגדו, צ'ונגצ'ינג. הדגימה זוהתה כחלק יבש מעל פני הקרקע של E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) מקסים. על ידי חוקרי המכון לרפואה ביולוגית, מכון צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית.

  1. הכן את פתרון מוצר הבקרה על ידי שקילה מדויקת של הכמות המתאימה של כל חומר ייחוס, כלומר, icariin, epimedin A (EA), epimedin B (EB), epimedin C (EC), ו baohuoside I (BI), באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני, ולהמיס מתנול. באמצעות אלה, הכן תמיסת מלאי ייחוס מעורבת המכילה 381.61 מיקרוגרם/מ"ל איקריאין, 124.14 מיקרוגרם/מ"ל EA, 110.24 מיקרוגרם/מ"ל EB, 1091.75 מיקרוגרם/מ"ל EC ו-184.98 מיקרוגרם/מ"ל BI.
  2. הכן את פתרון מוצר הבדיקה על ידי ריסוק EF דרך מסננת מס '3. מניחים כ-0.2 גרם (באמצעות איזון אנליטי אלקטרוני) של EF כתוש לתוך בקבוק ארלנמאייר עם פקק, מוסיפים 20 מ"ל אתנול מדולל, ולאחר מכן אולטרסאונד בהספק של 400 ואט ובתדר 50 קילוהרץ למשך שעה אחת. נערו היטב, ועברו דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר כדי לקבל את פתרון הבדיקה.
  3. בצע את הכרומטוגרפיה באופן הבא. השתמש בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) עם עמודת C18 בממדים של 4.6 מ"מ x 250 מ"מ וקוטר פנימי של 5 מיקרומטר. השתמש אצטוניטריל כשלב A נייד ומים אולטרה-טהורים כשלב נייד B. השתמש בפרמטרי האלוציה ההדרגתיים הבאים: 0-30 דקות, 24% A עד 26% A; 30-31 דקות, 26% A עד 45% A; 31-45 דקות, 45% A עד 47% A. השתמש באורך גל גילוי של 220 ננומטר (עבור הגלאי שבו נעשה שימוש, ראה טבלת חומרים). שמור על טמפרטורת העמודה על 30°C ועל המהירות הנוכחית על 1.0 מ"ל/דקה, והשתמש בגודל דגימה של 10 μL.
  4. כדי לחקור את הקשר הליניארי, השתמש בפתרון הייחוס המעורב כמו בשלב 1.1 מדולל פעמיים, 4 פעמים, 8 פעמים, 16 פעמים ו- 32 פעמים, עבור icariin, EA, EB, EC ו- BI, בהתאמה. השתמש אצטוניטריל כשלב A נייד ומים אולטרה-טהורים כשלב B נייד.
  5. השתמש בפרמטרים הבאים של הדרגתיות elution: 0-30 דקות, 24% A עד 26% A; 30-31 דקות, 26% A עד 45% A; 31-45 דקות, 45% A עד 47% A. השתמש באורך גל גילוי של 220 ננומטר (עבור הגלאי שבו נעשה שימוש, ראה טבלת חומרים). שמור על טמפרטורת העמודה ב- 30 ° C ואת המהירות הנוכחית על 1.0 מ"ל / דקה והשתמש בגודל דגימה של 10 μL. לבסוף, תעד את אזורי השיא. שרטט את הרגרסיה הליניארית עם ריכוז הייחוס (ציר x, μg/mL) כאבסקיסה ואת אזור השיא (ציר y) כאורדינטה באמצעות תוכנה מקצועית (ראה טבלת חומרים).
  6. בצע את הבדיקה המדויקת על ידי מדידת תמיסת הבקרה המעורבת שש פעמים רצופות על ידי HPLC באמצעות התנאים הכרומטוגרפיים המוצגים בשלב 1.3. רשום את זמן הגילוי ואת אזורי השיא של כל הרכב כימי, וחשב את סטיות התקן היחסיות (RSD) של אזורי השיא כדי להעריך את הדיוק (יכולת השחזור) באמצעות הנוסחה הבאה:
    RSD% = סטיית תקן (SD)/ממוצע אריתמטי של תוצאות מחושבות (X) x 100%
  7. כדי לבצע את בדיקת השחזור, יש לשקול במדויק את אבקת ה-EF ולהכין שישה חלקים של תמיסת מוצר הבדיקה במקביל בהתאם לשיטה בשלב 1.2. נושא את הפתרונות המוכנים ל- HPLC בתנאים הכרומטוגרפיים המוצגים בשלב 1.3. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי וחשב את הכמויות של כל תרכובת מעקומה סטנדרטית (אזורי שיא לעומת ריכוזים). חשב את ה- RSD% כמפורט לעיל.
  8. כדי לבצע את בדיקת היציבות, אחסן את תמיסות הבדיקה בטמפרטורת החדר, ומדוד את תכולתן בשיטת HPLC המתוארת בשלב 1.3 ב- 0 שעות, שעתיים, 4 שעות, 8 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות לאחר ההכנה כדי להעריך את היציבות. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי וחשב את ה- RSD% של אזורי השיא כמפורט לעיל.
  9. כדי לבצע את בדיקת התאוששות הדגימה, לשקול 0.2 גרם של אבקת EF לתוך בקבוק Erlenmeyer פקק עבור שישה עותקים משוכפלים. הוסף כמות מתאימה של תמיסת הייחוס (כמות חומר הייחוס שנוספה למדגם שווה ל -100% מהתוכן הידוע של המדגם) והכן את פתרון הבדיקה בהתאם לשיטה המוצגת בשלב 1.2.
  10. הזריקו את הדגימות לכרומטוגרף ונתחו בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים בשלב 1.3. רשום את אזורי השיא וחשב את ממוצע ההתאוששות ואת ערכי ה- RSD% כמפורט להלן:
    שיעור שחזור דגימה ספייק = (תוכן דגימה קוצנית - תוכן דגימה)/כמות דגימה x 100%

2. אופטימיזציה של טכנולוגיית עיבוד שמן כבש EF באמצעות מתודולוגיית משטח התכנון-תגובה Box-Behnken

  1. בחר את הפרמטרים העיקריים בעיבוד EF, כגון כמות שמן הכבש (A; 15%-35%), טמפרטורת שמן הכבש (B; 50-120 ° C) וטמפרטורת הטיגון (C; 80-300 ° C), כגורמים משפיעים. השתמש בציונים המקיפים של תוכן icariin, EA, EB, EC ו- BI כאינדקסי הערכה. אחוז שמן הכבש כאן הוא אחוז המסה.
  2. השתמש בתוכנה לניתוח משטח תגובה (ראה טבלת חומרים) כדי לתכנן את ניסויי משטח התגובה Box-Behnken, לחקור את משטח התגובה הריבועי ולבנות מודל פולינומי מסדר שני. בחרו בעיצוב Box-Behnken החדש והגדירו את האפשרות 'גורמים מספריים' על 3; הגדר את הגורמים A, B ו- C. לחץ על המשך. הגדר את האפשרות תגובות ל- 1 (שהיה הציון המקיף). לחץ על המשך כדי להשלים את העיצוב. סה"כ תוכננו 17 ניסויים (ראו טבלה 1).
    הערה: עבור המשתנים הבלתי תלויים והתלויים, יחד עם רמתם הנמוכה, האמצעית והגבוהה, ראה טבלה 2.
  3. לעבד את ה-EF בהתאם לפרמטרים הספציפיים בטבלה 1; לדוגמה, בהזמנה מספר 1, שקלו שמן כבש מזוקק כ-15% V/V, ולאחר מכן חממו ל-50°C כדי להמיס אותו. מוסיפים את ה-EF הגולמי לכבש המומס, מקפיצים על אש עדינה (190°) עד שהוא מבריק באופן שווה, ואז מסירים ומצננים. ביצע 17 פעולות ניסיוניות. בסך הכל התקבלו בעבודה זו 17 קבוצות של מוצרים מעובדים EF.
    הערה: שמן כבש מוצק בטמפרטורת החדר (25°C) ונמס לנוזל בעת חימום. שמן כבש במצב נוזלי יכול לשמש כמעורר.
  4. הכן את פתרונות הבדיקה של המוצרים המעובדים בהתאם לשיטה המתוארת בשלב 1.2. לאחר מכן, נתח אותם באמצעות HPLC בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים המתוארים בשלב 1.3. רשום את זמני השמירה ואזורי השיא של כל הרכב כימי, וחשב את תכולת האיקרין, EA, EB, EC ו- BI בכל פתרון בדיקה מול עקומת תקן חיצונית. השתמש בנוסחת חישוב הניקוד המקיפה להלן כדי לחשב את הציונים המקיפים של 17 קבוצות הניסוי:
    ציון כולל = Z/Zמקסימום × 0.5 + BI/BIמרבי × 0.5
    כאשר Z הוא סכום התוכן icariin, EA, EB ו- EC; Zmax הוא הערך המרבי של סכום התוכן icariin, EA, EB ו- EC ב- 17 קבוצות הניסוי; BI הוא תוכן ה-BI; ו- BImax הוא הערך המרבי של תוכן BI ב- 17 קבוצות הניסוי.
  5. ייבא את תוצאות הניקוד המקיפות עבור 17 קבוצות הניסויים לתוכנת ניתוח הנתונים (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח את נתוני הניסוי. תחת פריטי ההערכה, בחר באפשרות סדר התהליך הריבועי ובאפשרות סוג מודל פולינומי.

3. בדיקת השפעת העיבוד על התפתחות עוברית של דגי זברה

  1. הכנת דוגמאות
    1. כתשו את ה-EF הגולמי והמעובד דרך מסננת מס' 3 (ראו טבלת חומרים). ל-100 גרם מכל דגימת EF, יש להוסיף 1,000 מ"ל מים טהורים במיוחד. משרים את ה-EF למשך שעה וחצי, מרתיחים את המים פעמיים למשך 30 דקות כל אחד, ולאחר מכן מסננים עם נייר סינון.
    2. מערבבים את התסנין ומרכזים את הדגימה בחימום. הוסף מים טהורים במיוחד לנפח סופי של 100 מ"ל כדי לקבל את פתרונות המלאי המעובדים EF (PEF, 1 גרם/מ"ל) וה-EF הגולמי (CEF,1 גרם/מ"ל). למדוד את כמות התרופה הגולמית בכל פתרון מלאי.
    3. הניחו תמיסות מלאי של 1 מ"ל, 1.5 מ"ל, 2.5 מ"ל, 5 מ"ל ו-7.5 מ"ל בצלוחיות נפחיות של 10 מ"ל, ולאחר מכן הוסיפו מים אולטרה-טהורים לנפח כדי להכין את תמיסות הבדיקה בריכוזים של 100 מ"ג/מ"ל, 150 מ"ג/מ"ל, 200 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ג/מ"ל ו-750 מ"ג/מ"ל למחקר רעילות העוברים של דגי הזברה.
      הערה: הריכוזים של תמיסות הבדיקה הוכנו על ידי הפניה לספרות הרלוונטית 20,21 ועל ידי ביצוע ניסויים מקדימים כדי לתת את שיפוע הריכוז פי10 המשמש בטוקסיקולוגיה רגילה. CEF היה מדגם לא מעובד, ו- PEF היה מדגם שהוכן עם טכנולוגיית העיבוד הטובה ביותר המתוארת בסעיף 2.
  2. גידול דגי זברה וטיפול בעוברים21
    1. התאימו דגי זברה מסוג בר (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה מבוקרת למשך יומיים, שמרו אותם באקווריום זורם ב-pH 7.0-7.4 והאכילו אותם פעמיים ביום.
      הערה: עיכוב היווצרות המלנין בדגי זברה הושג על ידי הוספת 1-פניל-2-תיאוריאה בריכוז של 0.003% (מסה/נפח) למדיום התרבית, אשר שמר על גופם שקוף לתצפית מורפולוגית.
    2. בחרו דגי זברה פוריים בוגרים בערב והפרידו ביניהם באמצעות מבוכים בתיבות הזדווגות. הסירו את המבוכים למחרת בבוקר, והניחו לדגים להשריץ במשך 30 דקות. אסף את הביציות המופרות עם טפטפת כל 15 דקות. בסך הכל נאספו 520 עוברים בריאים מסוג בר. שמור את עוברי דגי הזברה באינקובטור ב 28.5 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
    3. הקצו באופן אקראי את העוברים הבריאים ב-24 שעות לאחר ההפריה (hpf) ל-13 קבוצות, ויחד עם קבוצת ביקורת אחת, השרו בנפרד 10 מ"ל מכל אחד מהפתרונות הבאים בצלחת תרבית: PEF: 100 מיקרוגרם/מ"ל, 150 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל; CEF: 100 מיקרוגרם/מ"ל, 150 מיקרוגרם/מ"ל, 200 מיקרוגרם/מ"ל, 250 מיקרוגרם/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל, 750 מיקרוגרם/מ"ל. התייחס לקבוצת הבקרה הריקה עם המדיום כפתרון. כל קבוצה הכילה 40 עוברים במחקר זה.
      הערה: ההרכב הבינוני הוא 0.15 M NaCl, 5 mM KCl, 0.25 mM Na 2 HPO 4,0.45 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO 4 ו- 4 mM NaHCO3.
    4. תרבית את דגי הזברה באינקובטור טמפרטורה קבועה עד 120 כיפות. ספרו את מספר הזחלים המתים מדי יום, צפו במורפולוגיית האיברים העיקרית של הזחלים בכל קבוצת ניסוי תחת סטריאומיקרוסקופ (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים), וחשבו את ריכוז מחצית המוות (LC50) של דגי זברה ב-72 HPF באמצעות תוכנת ניתוח נתונים (ראו טבלת חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות חקירה מתודולוגית
נצפה קשר ליניארי בין ריכוז איקרין, EA, EB, EC, BI ואזורי שיא כרומטוגרפיים (ראה טבלה 3). ערכי ה-RSD% (n = 6) של אזורי השיא הכרומטוגרפיים של icariin, EA, EB, EC ו-BI היו 0.28%, 1.22%, 0.65%, 1.67% ו-1.06%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שהדיוק של מדידות HPLC היה טוב. ערכי RSD% (n = 6) של התוכן של icariin, EA, EB, EC ו- BI היו 1.59%, 1.46%, 1.86%, 2.29% ו- 0.98%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שלשיטה הייתה יכולת חזרה טובה. ערכי ה-RSD% (n = 6) של אזורי השיא של icariin, EA, EB, E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משתנים בלתי תלויים וקביעת רמתם
טכנולוגיית עיבוד EF מתוארת רק במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית ובמפרטי עיבוד הרפואה הסינית המקומיים שפורסמו על ידי 26 מחוזות, עיריות ואזורים אוטונומיים ברחבי המדינה1. התיאור כולל את השלבים הבאים: לקיחת שמן כבש וחימום להמסתו, הוספת שברי EF, הקפצה באש איטית עד שהוא אחיד ומבריק, הוצאתו ונתונה לו להתקרר. בנוסף, 20 ק"ג (מקוצר כמו 20%) של שמן כבש (מזוקק) משמש עבור כל 100 ק"ג של אפימדיום. עם זאת, הפרמטרים של תהליך העיבוד של EF אינם מוגדרים. בין המשתנים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי פרויקט המחקר המדעי הבסיסי של האקדמיה לרפואה סינית מסורתית של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: jbky20200013), פרויקט הנחיית תמריץ ביצועים של מוסדות המחקר המדעי של צ'ונגצ'ינג (מספר פרויקט: cstc2021jxjl 130025), ופרויקט בניית משמעת מפתח של ועדת הבריאות העירונית של צ'ונגצ'ינג של עיבוד Materia Medica הסיני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher197164
Baohuoside figure-materials-1 (Bfigure-materials-2 ) צ'נגדו מנסט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMUST-20042402
עמודה כרומטוגרפיתתאגיד ווטרססימטריה C18
Design מומחה תוכנהStat- Ease Inc., מיניאפוליס, מינסוטהגרסת ניסוי8.0.6.1
גלאיווטרס תאגיד2998
מפרקHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
איזון אנליטי אלקטרונימטלר-טולדו אינטרנשיונל בע"מ
Epimedin A (EA)צ'נגדו מנסט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMUST-21112118
Epimedin B (EB)צ'נגדו מנסט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMUST-20080403
Epimedin C (EC)צ'נגדו מנסט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מMUST-20080310
אתנולצ'ונגצ'ינג צ'ואנדונג כימיקלים (קבוצה) ושות', בע"מ
תוכנת Graphpad GraphPadSoftware Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב6.02
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.
מתנולצ'ונגצ'ינג צ'ואנדונג כימיקלים (קבוצה) ושות', בע"מ
ממברנה מיקרופוריתטיאנג'ין Jinteng ציוד ניסיוני ושות', בע"מ0.22μ m
שמן כבשKuoshan Zhiniu חנות מזון טרי20211106
תוכנת Office Excel MicrosoftOffice Excel 2021
מסננת פרמקופיאהShaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
מכונת מים טהוריםצ'ונגצ'ינג אנדרסן ציוד להגנת הסביבה ושות', בע"מAT Sro 10A
נייר סינון איכותישנחאי Leigu Instrument Co., Ltd.18 ס"מ
סטריאומיקרוסקופקארל זייס, אוברקוכן, גרמניהסטמי 2000
מנקה אולטרסאונדברנסון אולטרסאונד (שנחאי) ושות', בע"מBUG25-12
מרכז משאבי דג הזברה בסין (CZRC)זן
MS205DU201808012109140120171101 AB

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
  2. Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
  3. Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
  4. Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
  5. Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
  6. Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
  7. Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
  8. Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
  9. Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
  10. Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
  11. Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
  12. Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
  13. Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
  14. Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
  15. Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
  16. Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
  17. Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
  18. Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808(2019).
  19. Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
  20. Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74(2018).
  21. Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114(2022).
  22. Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
  23. Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
  24. Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051(2019).
  25. Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263(2019).
  26. Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
  27. Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638(2022).
  28. Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
  29. Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
  30. He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
  31. Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
  32. He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
  33. Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
  34. Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
  35. Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
  36. Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
  37. Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
  38. Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
  39. Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
  40. Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
  41. Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epimedii FoliumMutton Oil ProcessingResponse Surface MethodBox Behnken DesignZebrafish Embryo DevelopmentHPLC AnalysisToxicity AssessmentChinese Medicine PreparationIcariin ContentTeratogenicity Testing

Related Articles