מאמר שיטה

מודל אוזן עכבר להערכת דרמטיטיס במגע אלרגי

DOI:

10.3791/65120

⸱

24 במרץ 2023

 ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou University, 2Department of Traditional Chinese and Western Medicine, Medical College, Yangzhou University, 3The Key Laboratory of Syndrome Differentiation and Treatment of Gastric Cancer of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Yangzhou University, 4Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases, Yangzhou University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את השיטות לגרימת דרמטיטיס מגע אלרגי באוזני עכבר על ידי 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) וכיצד להעריך את חומרת דרמטיטיס מגע אלרגי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העור הוא קו ההגנה הראשון של גוף האדם ואחד האיברים החשופים ביותר לכימיקלים סביבתיים. דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD) היא מחלת עור נפוצה המתבטאת בפריחה מקומית, אדמומיות ונגעים בעור. המופע וההתפתחות של ACD מושפעים מגורמים גנטיים וסביבתיים כאחד. למרות שחוקרים רבים בנו סדרה של מודלים של ACD בשנים האחרונות, הפרוטוקולים הניסיוניים של מודלים אלה שונים זה מזה, מה שמקשה על הקוראים לבסס אותם היטב. לכן, מודל יציב ויעיל של בעלי חיים הוא בעל משמעות רבה למחקר נוסף של הפתוגנזה של אטופיק דרמטיטיס. במחקר זה, אנו מפרטים שיטת מידול באמצעות 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) כדי לגרום לתסמינים דמויי ACD באוזניים של עכברים ומתארים מספר שיטות להערכת חומרת דרמטיטיס במהלך דוגמנות. פרוטוקול ניסויי זה יושם בהצלחה בכמה ניסויים ויש לו תפקיד קידום מכירות מסוים בתחום מחקר ACD.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת עור אלרגית במגע (ACD) היא מחלת עור נפוצה המאופיינת בתסמינים דמויי אקזמה במקום המגע, בצקת ואריתמה במקרים מתונים, ופפולות, שחיקה, הפרשה או אפילו צלקות מסיביות במקרים חמורים1. זה משפיע על עד 20% מהאוכלוסייה והוא יכול להשפיע על אנשים בכל גיל2. ACD מתרחשת לעתים קרובות אצל אנשים שנחשפו לאלרגנים שוב ושוב ויכולה להיגרם על ידי התגובה החיסונית של הפרט לאלרגן אחד או יותר בביתאו במקום העבודה 3. רגישות יתר מאוחרת מסוג IV נחשבת לסוג העיקרי של תגובה חיסונית ב- ACD4. באזורים בעור שנחשפו שוב ושוב לאלרגנים, תאי זיכרון T מצטברים במספרים גדולים ומעוררים תגובות חיסוניות ודלקתיות 3,5,6. מטרת עבודה זו היא להציע טכניקת מעבדה אמינה לחקירה נוספת של תגובות אימונולוגיות ודלקתיות בפיתוח ACD.

הופעת ACD נובעת בדרך כלל מרגישות יתר למגע הנגרמת על ידי חשיפה חוזרת ונשנית לכימיקלים. חוקרים רבים פיתחו מודלים שונים של בעלי חיים ACD בעכברי בית7,8, שרקנים 9,10 ובעלי חיים אחרים במהלך העשורים האחרונים, על מנת לדמות את הופעת המחלה. רוב שיטות הניסוי מורכבות משני שלבים: רגישות בטן (אינדוקציה) ומתן גירויים על הגב או על תנוך האוזן (גירוי). חומרים כימיים נפוצים כוללים בעיקר 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)/1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB)8,9,11, oxazolone 12, urushiol 13, וכו ' ביניהם, DNFB ו- DNCB הם הנפוצים ביותר, שדווחו לראשונה באוקטובר 195810. דגם רגישות ניקל14 ודרמטיטיס מגע פוטואלרגי מודל15 משמשים לעתים קרובות.

אנו מציגים שיטה ניסיונית לבניית מודל ACD. שיטה זו מסוכמת ומותאמת על בסיס מחקרים קודמים והשוואה עם ניסויים מרובים. בהשוואה למודלים אחרים של ACD, למודל זה יש כמה יתרונות, כגון הבדלים בודדים קטנים, תקופות ניסוי קצרות, כמות קטנה של גירוי כימי וכו '. בנוסף, מחקר זה חל על עכברים, שהם לא רק חסכוניים אלא גם יש אפשרויות רבות יותר עבור נוקאאוט גנים או הכנת עכברים טרנסגניים16. אנו מתארים גם את השיטות השונות המשמשות למעקב אחר התקדמות ACD בניסוי, כגון מדידת עובי האוזן, שימוש בצבע כחול אוונס למדידת הפרשה דלקתית ועוד. מודל זה יכול לא רק לנתח אוזני עכבר, דם, טחול ודגימות אחרות באמצעי מעבדה כדי לחקור את הפתוגנזה של ACD, אלא גם ישים להערכה פרה-קלינית של שיטות טיפוליות חדשות, שיש לה משמעות פרסומית מסוימת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הטיפול והטיפול בעכברים היו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים תחת רישיון הפרויקט SYXK(SU) 2022-0044. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות BALB/c בגילאי 6-8 שבועות. כל קבוצה כללה שישה עכברים (ראו טבלת חומרים). הכלובים הוכנסו לתא מבוקר טמפרטורה (22 ± 2 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ומים. דיאגרמת זרימה ניסיונית מוצגת באיור 1.

1. הכנת בעלי חיים

  1. התחל את הדוגמנות לאחר שבוע של התאקלמות לסביבה.
  2. השתמשו במנורה אולטרה סגולה ובחומר חיטוי 75% אלכוהול כדי לנקות ולחטא את הסביבה ואת משטחי העבודה לפני ביצוע מניפולציה על העכברים.
    הערה: על מנת למנוע השפעה של גורמים חיצוניים, לא ניתן לבצע סימון העכברים לזיהוי על אוזן העכבר; כתמים על הגב או על הזנב יכולים לשמש כחלופה.
  3. השתמש צמר גפן קטן כדי להחיל מי סבון על הבטן של העכברים (כ 1-2ס" מ גודל). יש לגלח את האזור בכיוון צמיחת השיער בעזרת להב או מכונת גילוח (ראו טבלת חומרים) בתחילת הדוגמנות (יום 0; איור 2A).
    הערה: השימוש בסכין גילוח ישר להסרת שיער דורש מפעיל מיומן. אם לא מבוצע כראוי, הוא עלול לגרום לגירוי בעור. שקלו להשתמש בקרם מסיר שיער, קוצץ או סכין גילוח בטיחותי להסרת שיער.
  4. שקלו את העכבר והשוו את שינויי המשקל בין כל קבוצה.

2. גירוי רגישות בטן

  1. להבטיח החלמה מלאה של כל פציעה קלה בעור הבטן הנגרמת על ידי גילוח. יש למרוח את רגישות הבטן יומיים לאחר הגילוח (יום 2).
  2. הכינו את תמיסת DNFB 0.5%: דללו DNFB בתערובת אצטון:שמן זית ביחס של 4:1 (למשל, 400 מיקרוליטר אצטון מעורבב עם 100 מיקרוליטר שמן זית; ראו טבלת חומרים). השתמש באקדח פיפטה כדי לנשוף ולערבב 20 פעמים כדי לערבב היטב את תמיסת DNFB. לפני כל מתן של פתרון DNFB לעכבר, לנשוף ולערבב אותו שלוש עד חמש פעמים.
    הערה: הכינו את התמיסה לפני השימוש ועטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור שמש ישיר.
  3. מרחו 25 μL של תמיסת DNFB 0.5% על העור של האזור המגולח על בטן העכברים עם פיפטור (איור 2B).
  4. טפטפו את תמיסת ה-DNFB על אמצע אזור גילוח הבטן ופזרו קלות עם הצד החלק של קצה הפיפטור לפיזור אחיד.
  5. בגיל 30 שניות לאחר גירוי DNFB, הניחו את העכברים בכלובים ריקים ללא מצעים כדי למנוע מהם לשפשף את תמיסת DNFB. כאשר תמיסת DNFB יבשה לחלוטין (כ-2 דקות), החזירו את העכברים לכלוב המקורי שלהם.
  6. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בתמיסת DNFB מכיוון שהיא מגרה מאוד את עור האדם.

3. גירוי רגישות האוזן

  1. הכינו תמיסת DNFB 0.2% כאמור לעיל, תמיסת הרכב (תערובת 4:1 של אצטון ושמן זית) ומים טהורים.
  2. כיוון את גוף העכבר והפוך את הגבול החיצוני של האאוריקל כלפי מטה במהלך כל הניתוח כדי למנוע מהתמיסה להיכנס לתעלת האוזן במהלך גירוי DNFB.
  3. בימים 4, 6, 8 ו-10, השתמשו בפיפטור כדי למרוח 20 μL של תמיסת DNFB 0.2% או תמיסת רכב לאט ובאופן אחיד על פני השטח הפנימיים של האאוריקים השמאליים של העכברים. כדי למנוע מתמיסת DNFB להיכנס לתעלת האוזן, השתמש בצד החלק של קצה הפיפטור כדי לפזר בעדינות את תמיסת DNFB במהלך הממשל. השאירו את אוזני ימין ללא טיפול (איור 2C).
  4. המתינו עד שתמיסת DNFB יבשה והחזירו את העכברים לכלוב (כ-30 שניות).
  5. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול בתמיסת DNFB.

4. רישום משקל עכבר ותסמיני ACD

  1. לשקול את העכבר כל יום, להתחיל ביום 1, ולהשוות עם המשקל המתאים שלה ביום 0; להעריך את ההשפעה של ACD על משקל הגוף של עכברים כמו שינוי משקל (g) ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).
  2. צלם תמונות ברזולוציה גבוהה של אוזני העכבר כדי להקליט תסמינים קליניים של ACD כל יומיים, החל מהיום הראשון.

5. מדידת עובי האאוריקל

  1. מדדו את עובי האאוריקל כל יומיים, החל מהיום הראשון. מדוד והקלט את שתי האוזניים בפירוט.
  2. השתמשו בקליפרים של ורנייה (ראו טבלת חומרים) כדי למדוד את עובי האאוריקל באותה שעה בכל יום לקבלת תוצאות מדויקות (איור 3A). עצור את קליפרים vernier מלהמשיך הידוק פנימה כאשר יש חסימה קלה, כדי למנוע נזק רקמות לאוזן העכבר. שמור על המיקום קבוע ורשום את הנתונים.
  3. אספו את העובי משלושה מיקומים שונים על כל אאוריקל (איור 3B). רשום את הממוצע של שלושת הנתונים כערך חוקי. להעריך את נפיחות האוזן במיקרומטרים (מיקרומטר) ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).

6. הערכת מידת הנפיחות הדלקתית

  1. הכינו 0.5% צבע כחול אוונס (ראו טבלת חומרים) פתרון: דללו את הצבע הכחול של אוונס במי מלח חוצצים פוספט (PBS) ביום ה-11. לבשו מעיל מעבדה וכפפות בכל עת, מכיוון שהצבע הכחול של אוונס רעיל מעט לבני אדם.
  2. לשתק את העכברים עם קיבוע: לפתוח את מכסה הקיבוע (ראה טבלת חומרים), להחזיק את זנב העכבר, לגרום לראש העכבר מול הקיבוע, ולגרום לעכבר לטפס אינסטינקטיבית לתוך הקיבוע. כסו את המכסה, גרמו לזנב העכבר לצאת מהחור במכסה וכווננו את אורך הקיבוע כך שיחשוף את זנב העכבר כולו.
  3. נגבו את הזנב שוב ושוב עם כדור צמר גפן אלכוהולי או השרו אותו במים חמים למשך 30 שניות, וצבטו בעדינות את שורש הזנב כדי למלא ולהרחיב את הוורידים משני הצדדים. בצע את ההזרקה תחת הקרנה של מקור אור קר.
  4. הזריקו באיטיות תמיסת צבע כחול של אוונס לווריד זנב העכבר באמצעות מחט אינסולין 1 מ"מ. המתן 15 דקות ולאחר מכן צלם את אוזני העכבר.
    הערה: הנח את העכבר על השולחן והחזק אותו בעדינות כדי לחשוף את אזור האוזן לצורך רכישת תמונה. זמן קצר לאחר ההזרקה עם תמיסת הצבע הכחול של אוונס והתבוננות באינדיקציות המתאימות, השתמש בנקע צוואר הרחם כדי להרדים את העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחת גירוי DNFB חוזר, אוזני העכבר של קבוצת DNFB הראו תסמינים קליניים ברורים דומים ל- ACD, כאשר אזורים רגישים הראו את הסימפטומים האופייניים של אדמומיות, יובש ואפילו שחיקה והפרשה. אולם מתן אוזניים של מים טהורים (קבוצת ביקורת) או בקרת ממס (קבוצת רכב) לא הניב תסמינים דומים (איור 4).

בינתיים, בקבוצת DNFB, בהשוואה לאוזן ימין שלא טופלה, עובי האוזן השמאלית גדל באופן משמעותי לאחר גירוי DNFB (איור 5A), בעוד שלא היה הבדל משמעותי בקבוצת הביקורת וב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן לגרימת תסמינים דמויי ACD באוזניהם של עכברים יכול לשמש לחקר הפתופיזיולוגיה של ACD וככלי סינון לפיתוח תרופות חדשות.

ישנם שני שלבים מרכזיים לביסוס מודל ACD: רגישות ראשונית, וגירוי עוקב. הבטן היא בדרך כלל האתר של רגישות ראשונית, אבל אתר הגירוי הבא נבחר מעט אחרת. מחקרים קודמים הראו כי רוב החוקרים בוחרים להשתמש בחומרים רגישים כימיים כגון DNFB/DNCB או אוקסזולון כדי לבסס מודלים של ACD על הגב או הצוואר של עכברים, וזה בלתי נמנע להשתמש בלהבים או גוזמים כדי לנטרל את אזור המידול של עכב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) ל- N.-N. י' (81904212); פרויקט המדע והטכנולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית בג'יאנגסו (YB201995); ופרויקט המימון המיוחד לפוסט-דוקטורנטים בסין (2020T130562).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-פלואורו-2,4-דיניטרובנזן (DNFB)Merck200-734-31-פלואורו-2,4-דיניטרובנזן, ≥ 99%
אצטוןסינופארם ריאגנט כימי ושות 'בע"מ10000418≥ 99.5%
רדיד אלומיניום CleanwrapCF-2
Evans צבע כחולSolarbio314-13-6תכולת צבע כ. 80%
מקבע עכברZHUYANBANGGEGD-SM1830
שמן זיתSolarbio8001-25-0500 מ"ל
קצה פיפטBiofountFT-20010 - 200 μ l
פיפטוראפנדורף AG312300025020 - 200 μ l
סכין גילוחשנחאי ג'ילט ושות' בע"מ74-S
קליפרים ורנייהדליקסי אלקטריקDECHOTVCS1200

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
  2. Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
  3. Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
  4. Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J. Allergic contact dermatitis. International Immunopharmacology. 2 (2-3), 201-211 (2002).
  5. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  6. Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
  7. Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
  8. Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
  9. Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
  10. Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
  11. Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
  12. Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
  13. Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
  14. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
  15. Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
  16. Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397(2022).
  17. Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
  18. Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
  19. Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237(2021).
  20. Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNFBEvans Blue

מאמרים קשורים