הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65122

⸱

21 באפריל 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

תקציר

ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.

מבוא

תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחשוף אותם לרמות משתנות של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית, המחקה את התנאים ההמודינמיים הורידיים והעורקים.

hSVECs מבודדים על ידי דגירה של collagenase וניתן להשתמש בהם עד מעבר 8. פרוטוקול זה דורש פחות מניפולציה של כלי הדם בהשוואה לפרוטוקולים הזמינים האחרים7, אשר מפחית זיהום עם תאי שריר חלק ופיברובלסטים. מצד שני, זה דורש קטע כלי גדול יותר של לפחות 2 ס"מ כדי לקבל מיצוי EC יעיל. בספרות, דווח כי ECs מכלי גדול ניתן להשיג גם על ידי הסרה מכנית 7,8. למרות יעילותה, לגישה הפיזית יש את החסרונות של תפוקת EC נמוכה וזיהום פיברובלסטים גבוה יותר. כדי להגביר את הטוהר, נדרשים צעדים נוספים באמצעות חרוזים מגנטיים או מיון תאים, מה שמגדיל את עלות הפרוטוקול עקב רכישת חרוזים ונוגדנים 7,8. לשיטה האנזימטית יש תוצאות מהירות וטובות יותר לגבי טוהר EC וכדאיות 7,8.

ECs הנפוצים ביותר לחקר תפקוד לקוי של האנדותל הם תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). ידוע כי הפנוטיפ EC משתנה במיטות כלי דם שונות, וחיוני לפתח שיטות המייצגות את כלי השיט תחת חקירה 9,10. מבחינה זו, קביעת פרוטוקול לבידוד hSVEC ותרבית שלו תחת לחץ מכני היא כלי רב ערך להבנת התרומה של תפקוד לקוי של hSVEC במחלת השתלת ורידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מקטעים לא בשימוש של ורידים ספניים התקבלו מחולים שעברו ניתוח מעקפים אבי העורקים במכון הלב (InCor), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתף במחקר, אשר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית.

1. בידוד, תרבית ואפיון של תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs)

  1. הכנה
    1. Autoclave זוג מלקחיים ישרים או מעוקלים ומספריים רקמות (7-8 ס"מ).
    2. מכינים ג'לטין סטרילי. יש לערבב 0.1 גרם (0.1% w/v) או 3 גרם (3% w/v) של ג'לטין עור חזירי עם 100 מ"ל מים טהורים במיוחד, autoclave במשך 15 דקות, ולאחסן ב 4 ° C. יש לחמם ל-37°C כדי לנזול לפני ציפוי הכלים והמגלשות של תרבית התא.
    3. הכינו קולגן סטרילי (1 מ"ג/מ"ל) בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. לדלל את collagenase ב PBS ולעקר אותו עם מסנן 0.2 מיקרומטר.
    4. מצפים צלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ ומגלשה קאמרית בעלת 8 בארות עם 0.1% ג'לטין עם V למשך 30 דקות לפחות ב-37°C. מוציאים את עודפי הג'לטין לפני זריעת התאים.
    5. הכינו תווך תאי אנדותל מלא: מדיום בסיסי לגדילת תאי אנדותל (EBM-2) בתוספת גורמי גדילה מסוג EGM2.
      הערה: גורמי הצמיחה של EGM2 מסופקים כערכה על-ידי חברה המופיעה בטבלת החומרים. ריכוז הגורמים אינו נחשף על ידי החברה.
    6. מייצרים אלבומין בסרום בקר (BSA) בשיעור 2% ו-5%, 4% פרפורמלדהיד (PFA) ו-0.1% תמיסות Triton X-100, כולן בתמיסות מלח חוצצות פוספט (PBS).
  2. בידוד ותרבות של hSVECs
    1. לאסוף לפחות 2-3 ס"מ מקטע ורידים saphenous ארוך עבור הליך זה.
      הערה. כל הליכי תרבית התאים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים ובתוך מכסה מנוע זרימה למינרית.
    2. מעבירים את מקטע הוורידים לצלחת פטרי מלאה PBS שחומם מראש. הכנס קצה פיפטה לקצה אחד של הווריד ושטוף בעדינות עם PBS כדי להסיר את כל הדם בתוך הלומן. שוטפים אותו עד שזרימת הכביסה הופכת ברורה לחלוטין.
    3. סגור את אחד מקצות הווריד בתפר כותנה סטרילי. בזהירות למלא את הכלי עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase סוג II פתרון. סגרו את הקצה השני של הכלי באמצעות תפר כותנה (איור 1A). לדגור על הכלי עם תמיסת collagenase באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב 37 ° C במשך 1 שעה.
    4. לאחר מכן, לחתוך את אחד הקצוות של הכלי בתוך צינור 15 מ"ל ולאסוף את הפתרון collagenase. חתכו את הקצה השני ושטפו את המשטח המואר עם 1-2 מ"ל PBS כדי לאסוף את כל ה-ECs המנותקים. שים את כל PBS יחד עם תמיסת collagenase בתוך אותו צינור.
    5. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לגלול את התאים.
      הערה. גלולת התא קטנה מאוד וקשה לדמיין. אם הדם אינו מוסר לחלוטין לפני הטיפול בקולגנאז (שלב 1.2.2), תאי הדם יזרזו גם הם, והגלולה תהיה אדמדמה.
    6. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב 3-4 מ"ל של תווך תאי אנדותל מלא (EBM-2 בתוספת גורמי גדילה EGM2) ותמיסת הפרין נוספת (5 U/mL, ריכוז סופי). מקציפים את התאים בכלי תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המצופה מראש בג'לטין 3% w/v.
      הערה: ג'לטין היה הבחירה הראשונה בשל קלות הנגישות שלו ועלותו הנמוכה. מכיוון שהציפוי בג'לטין שומר בהצלחה על פנוטיפ EC, לא נבדק חומר ציפוי אחר. קולגן ופיברונקטין יכולים להיבדק במחקרים שמטרתם לחקור את ההשפעה של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים שונים על הידבקות EC ועל הפנוטיפ.
    7. לדגור על התאים ב 37 ° C באטמוספירה לחה עם 5% CO2 במשך 4 ימים מבלי לשנות את המדיום. לאחר מכן, לשנות את התקשורת כל יומיים. מרגע זה ואילך, תוספת מדיה תאית עם הפרין כבר לא נחוץ. בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו.
    8. לאחר 3-10 ימים לאחר החילוץ, בהתאם לגודל וקוטר של קטע הווריד, לדמיין את hSVECs על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    9. להעריך את מידת המפגש ואת המורפולוגיה המרוצפת שלהם במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    10. המשך לשנות את המדיה כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%.
    11. מעבר hSVECs עם 0.25% טריפסין-0.02% תמיסת חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
      1. שטפו את התאים עם PBS שחומם מראש.
      2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות או עד שכל התאים מנותקים.
      3. הוסף 2 מ"ל של תווך תאי אנדותל מלא כדי להשבית את הטריפסין.
      4. העבר את מתלה התא לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 3 דקות ב- RT.
      5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום תרבית.
      6. ספרו את תרחיף התא בכחול טריפאן ביחס 1:1 (0.4%) כדי ליצור תאים ברי קיימא.
      7. כדי להרחיב את התרבית, צלחת את התאים בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ עם 10 מ"ל של תווך תאי אנדותל שלם שחומם מראש ותרבית אותו ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
        הערה. בממוצע, הזריעה של 4 x 104 hSVEC / cm2 תהיה 100% שוטפת לאחר 48 שעות.
    12. כדי לשמר את התאים בהקפאה, יש להשהות מחדש את הגלולה משלב 1.2.11.5 ב-5% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בסרום בקר עוברי (FBS) ולאחסן בחנקן נוזלי.
  3. אפיון hSVECs: צביעת ציטומטריה של זרימה עבור CD31
    1. העבר 1 x 10 5 hSVEC לצינור אחד של1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x g למשך 3 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב- 100 μL של PBS המכיל 2% BSA ונוגדן חד שבטי CD31-FITC (1:100).
    2. הכתימו את התאים למשך 30 דקות ב- RT בחושך.
    3. שטפו את התאים המוכתמים על ידי הוספת 0.5 מ"ל PBS וצנטריפוגה אותם ב 300 x גרם למשך 3 דקות ב- RT. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב 400 מיקרוליטר של PBS עם 2% BSA.
    4. השתמש hSVEC ללא תווית, ללא נוגדן CD31, כבקרה שלילית.
    5. המשך לניתוח רכישת ציטומטר זרימה באמצעות לייזר כחול וערוץ FITC (עירור/פליטה מרבי [Ex/Em] של 498/517 ננומטר). אם נעשה שימוש בפלואורוכרומים אחרים, בדוק אם לציטומטר יש ערכות סינון מתאימות לזיהויים. הפרידו את התאים מהפסולת בתפקוד גודלם וגרעיניותם, ואז שערו תאים בודדים על ידי פיזור קדימה ופיזור צדדי.
  4. אפיון hSVECs: צביעה פלואורסצנטית עבור CD31 ו-VE-cadherin
    1. צלחת 0.1 x 105 תאים בשקופית תא 8 בארות מצופה ג'לטין. לדגור על התאים במשך הלילה ב 37 ° C, 5% CO2, כדי לאפשר לתאים להיצמד לפני השטח של התרבית.
    2. הסר את המדיום ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS.
    3. הוסף 0.3 מ"ל / באר של 4% PFA כדי לתקן את התאים. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
    4. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    5. הוסף 0.3 מ"ל / באר של 0.1% תמיסת Triton X-100 כדי לחדור את התאים. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
    6. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    7. כדי לחסום אתרי קישור נוגדנים לא ספציפיים, הוסף 0.3 מ"ל/באר של תמיסת BSA 5% לתאים. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
    8. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    9. לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים (CD31 ו- VE-cadherin, 1:100) מדולל PBS עם 2% BSA לילה עם נדנוד עדין ב 4 ° C. השאירו באר אחת דוגרת עם PBS עם 2% BSA (ללא נוגדן ראשוני) כבקרה השלילית.
    10. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    11. לדגור על התאים עם נוגדנים משניים מסומנים פלואורסצנטית מדוללים (1:500) ב- PBS למשך שעה אחת ב- RT. הוסף 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור צביעה גרעינית לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל.
    12. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
    13. הסר את תא המדיה באמצעות המפריד. הניחו טיפה אחת של מגיב בינוני ההרכבה (50% גליצרול ב-PBS) והניחו מגלשת זכוכית (24 מ"מ x 60 מ"מ) תוך הימנעות מבועות לכידה.
    14. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: DAPI מזוהה באמצעות קוביית אור DAPI (לדוגמה: 335-379 ננומטר; Em: 417-477 ננומטר), ו-CD31/VE-cadherin מזוהה באמצעות קוביית אור של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (לדוגמה: 459-481 ננומטר; Em: 500-550 ננומטר). קוביות אור עם טווח אורכי גל עירור / פליטה דומה מספיקות גם עבור פלואורוכרומים אלה. אם נעשה שימוש בפלואורוכרומים אחרים, בדוק אם במיקרוסקופ המשמש יש ערכות סינון מתאימות לזיהויים.

2. לחץ גזירה על hSVECs

  1. הכנה
    1. צפו את מגלשת תא הזרימה ב-0.1% עם ג'לטין למשך 30 דקות לפחות ב-37°C. הסירו את עודפי הג'לטין לפני זריעת התאים.
    2. איזון היחידה הנוזלית והזילוח הסטרילי שנקבע עם מאגרים של 10 מ"ל למשך הלילה בתוך האינקובטור באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. ניסוי מתח גזירה
    1. זרעים 2 x 105 ECs מרחפים ב 100 μL של מדיום EC לתוך שקופית תא זרימה מצופה ג'לטין. דגרו על התאים במשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 כדי לאפשר לתאים להיצמד למשטח התרבית.
    2. הנח את ערכת הזילוח על היחידה הנוזלית כמתואר בהוראות היצרן. ממלאים את המאגרים ואת הזלוף להגדיר כ 12 מ"ל של תווך תאי אנדותל שלם שחומם מראש. הסר ידנית בועות אוויר ממערך הזילוח כדי לאזן את רמת שני המאגרים ב -5 מ"ל.
    3. הניחו את היחידה הפלואידית עם מערכת הזילוח הרכובה, ללא שקופית התא, באינקובטור וחברו את כבל החשמל שלה למשאבה המווסתת על ידי מחשב. הסר את כל בועות האוויר מהמאגרים וממערכת הזלוף, תוך הפעלת פרוטוקול מוגדר מראש בתוכנת בקרת המשאבה.
      הערה. חשוב מאוד להסיר בועות אוויר כדי שהמערכת תתפקד כראוי.
    4. קח את היחידה הנוזלית עם זילוח רכוב להגדיר מכסה המנוע זרימה למינרית ולחבר את שקופיות עם monolayer תא confluent.
    5. מניחים את היחידה הנוזלית עם הזלוף המותקן ומחליקים עם תאים באינקובטור ומחברים את כבל החשמל שלה למשאבה.
    6. בתוכנת בקרת המשאבה, הגדר את הפרמטרים הבאים: צמיגות התווך (0.0072), סוג השקף, גורם כיול ערכת זילוח, קצב לחץ גזירה (20 dyn/cm2), סוג זרימה (חד כיוונית) וזמן (72 שעות), והתחל את הזרימה (עיין בהוראות הציוד לפרטים נוספים). קצרו את התאים שטופלו באותה מדיה ללא חשיפה לזרימה כבקרות סטטיות.
    7. לאחר השלמת הגירוי, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ולהמשיך לקצור את הדגימות על פי הבדיקה הנדרשת. עבור צביעה פלואורסצנטית, ראה שלב 2.3.1, ועבור מיצוי RNA, ראה שלב 2.3.2.
  3. הדגמת האפקטיביות של פרוטוקול לחץ הגזירה
    1. צביעה פלואורסצנטית של חוטי אקטין (F-actin)
      1. תקן וחדיר את התאים כפי שמצוין בשלבים 1.4.2-1.4.6. השתמש בעוצמת קול של 100 μL ב- μ-slide.
      2. צבעו את אקטין ה-F בפלואידין עם תווית פלואורסצנטית (דולל ב-1:200 ב-PBS) והכתימו את הגרעין ב-DAPI (ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS) למשך שעתיים ב-RT, מוגן מפני אור.
      3. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
      4. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
        הערה: DAPI מזוהה באמצעות קוביית אור DAPI (לדוגמה: 335-379 ננומטר; Em: 417-477 ננומטר) ופאלואידין מזוהה עם קוביית אור GFP (לדוגמה: 459-481 ננומטר; Em: 500-550 ננומטר). קוביות אור עם טווח דומה של אורך גל עירור / פליטה מספיקות גם עבור פלואורוכרומים אלה. אם נעשה שימוש בפלואורוכרומים אחרים, בדוק אם במיקרוסקופ המשמש יש ערכות סינון מתאימות לזיהויים.
    2. ביטוי גנים על ידי שעתוק לאחור כמותי בזמן אמת (RT-qPCR)
      1. אסוף את התאים מהשקופית μ עם 350 μL של מאגר ליזה מסחרי המכיל גואנידין-תיוציאנט. בודדו את הרנ"א הכולל באמצעות ערכות מיצוי מבוססות עמודות, בהתאם להוראות היצרן.
        הערה: בשל המספר המוגבל של תאים בתרבית בשקופית μ, מומלץ להשתמש במיצוי מבוסס עמודות של RNA.
      2. הכן cDNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA עם אנזים הפוך transcriptase, על פי הוראות היצרן.
      3. ודא את ביטוי הגנים המווסתים על ידי עקה גזירה: KLF2, KLF4 ו- NOS3. השתמש בגן עוזרת הבית PPIA / ציקלופילין כדי לנרמל את התוצאות. הפריימרים הספציפיים לתגובה מפורטים בטבלה 1.
      4. בצעו RT-qPCR באמצעות ערכת כתמים פלואורסצנטית של DNA ירוק SYBR בתנאי התגובה הבאים: i) 50°C למשך 2 דקות, ii) 95°C למשך 15 דקות, iii) 94°C למשך 15 שניות, iv) 60°C למשך 30 שניות, v) 72°C למשך 30 שניות. חזור על שלבים iii עד v במשך 40 מחזורים. הוסף שלב התכה בסוף התגובה כדי לאמת את הספציפיות של הפריימר.

3. מתיחה מחזורית על hSVECs

  1. הכנה
    1. יש למרוח חומר סיכה על בסיס סיליקון על החלק העליון והצדדים של תחנת ההעמסה השווה של 6 בארות של 25 מ"מ.
      הערה: פעולה זו מפחיתה את החיכוך בין קרום לוחית התרבית לבין התחנה, ומאפשרת פיזור טוב יותר של המתח המחזורי. שלב זה חייב להיעשות לפני כל ניסוי.
  2. ניסוי מתיחה מחזורי
    1. זרע 4 x 105 תאים מרחפים ב 3 מ"ל לכל באר של 6 צלחות תרבית בעלות תחתית גמישה המצופה בקולגן I (טבלה של חומרים). תכנן לקבל לוח(ים) במצב סטטי כקבוצת ביקורת. שמור את התאים באינקובטור (37 ° C באוויר לח עם 5% CO2) עד שהם מגיעים 100% מפגש (בדרך כלל 48 שעות לאחר הזריעה). לפני תחילת פרוטוקול המתיחה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש והוסיפו 3 מ"ל של מדיום תרבית טרי לכל באר.
    2. הכנס את לוח הבסיס עם כל תחנות ההעמסה המשומנות באינקובטור וחבר כראוי את הצינור עם ציוד הבקר של מערכת הביוריאקטור המתיחה של תאי מתח (ראה הוראות ציוד לפרטים נוספים).
    3. חברו כל צלחת תרבית לאטם אדום אחד, המסופק על ידי מערכת הביוריאקטור המתיחה של תאי מתח. לאחר מכן, הכניסו אותם ללוחית הבסיס בתוך האינקובטור.
      1. ודאו שהפלטות יושבות, לחוצות ואטומות במלואן לפלטת הבסיס כדי למנוע דליפת אוויר במהלך שאיבת הוואקום. חשוב להחזיק את כל ארבעת לוחות התרבית בלוח הבסיס כדי לקבל את הוואקום הנכון ואת העמסת המתיחה.
      2. במקרה שיש פחות לוחות ניסיוניים, השתמש בלוח ריק כדי להשלים את ארבעת המיקומים בלוח הבסיס. הוסף את יריעת האקריליק (שסופקה עם הציוד) על גבי לוחות התרבית כדי לשפר את איטום לוח הבסיס. מניחים את הלוחות הסטטיים באותה אינקובטור.
    4. הפעל את ציוד הבקר ואת מערכת המחשב. פתח את סמל התוכנה והגדר את המשטר הרצוי: גודל תחנת הטעינה שיש להשתמש בה, סוג המתח, אחוז ההתארכות, צורת הגל, התדר והזמן. לקבלת מידע מפורט, עיין בהוראות היצרן. בחר והורד את משטר המשטר. כאן נעשה שימוש במשטר הבא: 1/2 צורת גל סינוס, תדר 1 הרץ, 5% התארכות (כדי לחקות מתיחה ורידית), ו-15% התארכות (כדי לחקות מתיחה עורקית) עד 72 שעות.
    5. הפעל את מערכת הוואקום ולחץ על התחל במסך המחשב כדי להפעיל את המתיחה. בדקו אם קרום הסיליקון זז ומותח את התאים.
    6. לאחר השלמת הגירוי, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ולהמשיך לקצור את הדגימות על פי הבדיקה הנדרשת. כאן, כדי להדגים את היעילות של מתיחה מחזורית, לאסוף את מדיום תרבית hSVEC, לשמור אותו על -80 ° C למדידה נוספת תחמוצת החנקן (NO), ולתקן את התאים עבור כתמים פלואורסצנטיים.
      הערה. לא ניתן לאחסן את לוח הבסיס בתוך האינקובטור כאשר אינו בשימוש; אחרת, הטמפרטורה יכולה לשנות את הצורה השטוחה ולהפוך אותה לחסרת תועלת.
  3. הדגמת האפקטיביות של פרוטוקול המתיחה המחזורי
    1. צביעה פלואורסצנטית של F-אקטין
      1. תקן את התאים כפי שמצוין בשלב 1.4.3. השתמש נפח של 1 מ"ל לכל באר.
      2. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. שמרו על התאים ב-PBS כך שלא יתייבשו בזמן הכנת קרום הסיליקון לשלבים הבאים.
      3. השתמשו במקלון צמר גפן כדי להסיר את עודפי חומר הסיכה על בסיס סיליקון מתחתית הממברנה. לאחר מכן, יש למרוח בעדינות חומר לניקוי חלונות או סבון ידיים עם צמר גפן חדש. חזור על התהליך עד שכל חומר הסיכה מוסר מהממברנה. לאחר מכן, נקו עם מים נטולי יונים.
        הערה. חשוב להסיר לחלוטין את חומר הסיכה מממברנת הסיליקון כדי לקבל תמונות מיקרוסקופיה באיכות טובה.
      4. חתכו בזהירות את קרומי הסיליקון לחתיכות קטנות כדי להתאים לשקופיות קאמריות בנות 8 בארות לצביעה. חדור את התאים כפי שמצוין בשלב 1.4.5.
      5. לאחר שלבי הכביסה, הכתימו את ה-F-אקטין באמצעות פאלואדין ואת הגרעין עם DAPI. המשך לניתוח, כפי שמצוין בשלבים 2.3.1.2 ו- 2.3.1.3. השתמש נפח של 0.3 מ"ל לכל תא היטב.
      6. הסר את תא המדיה באמצעות המפריד. מניחים טיפה אחת של מגיב בינוני הרכבה (50% גליצרול ב-PBS) ומניחים מגלשת זכוכית (24 מ"מ x 60 מ"מ).
      7. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
        הערה: DAPI מזוהה באמצעות קוביית אור DAPI (לדוגמה: 335-379 ננומטר; Em: 417-477 ננומטר) ופאלואידין מזוהה עם קוביית אור של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) (לדוגמה: 511-551 ננומטר; Em: 573-613 ננומטר). קוביות אור עם טווח דומה של אורך גל עירור / פליטה מספיקות גם עבור פלואורוכרומים אלה. אם נעשה שימוש בפלואורוכרומים אחרים, בדוק אם במיקרוסקופ המשמש יש ערכות סינון מתאימות לזיהויים.
    2. NO measurement - מוערך על ידי הצטברות ניטריט (NO2) בתווך המותנה hSVEC באמצעות בדיקת כימילומינסנציה רדוקטיבית מבוססת אשלגן יודיד
      1. הכנה
        1. הכינו עקומה סטנדרטית בין 0.01-10 מילימטר של תמיסת נתרן ניטריט (NaNO2 במים טהורים במיוחד).
        2. הוסף 5 מ"ל של חומצה אצטית ו 1 מ"ל של יודיד אשלגן (50 מ"ג ב 1 מ"ל של מים טהורים במיוחד) לתוך כלי הטיהור של מנתח תחמוצת החנקן.
      2. אין מדידה
        1. הוסף 20 μL של העקומה הסטנדרטית NaNO2 לתוך כלי הטיהור של מנתח תחמוצת החנקן. מדוד אותו בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    3. הוסף 20 μL של המדיום המותנה לתוך כלי הטיהור של מנתח תחמוצת החנקן. מדוד אותו בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    4. חשב את ריכוזיNO2 בהתבסס על כיול העקומה הסטנדרטית. התאם את הערכים המתקבלים על ידי הנפח הכולל של המדיום המותנה שניתח 6,11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדרך כלל, ECs דבק ניתן לראות 3-4 ימים לאחר החילוץ. hSVECs יוצרים בתחילה אשכולות של תאים ומציגים מורפולוגיה טיפוסית של "אבן מרוצפת" (איור 1B). הם מבטאים את סמני EC CD31 (איור 1C,D) ו-VE-cadherin (איור 1D). hSVECs יכולים להיות מופצים בקלות על צלחת תרבית תאים מטופלת ללא ציפוי, והם שומרים על פנוטיפ האנדותל בתרבית עד שמונה מעברים.

hSVECs, כאשר הם מתורבתים תחת לחץ גזירה, מתיישרים בכיוון הזרימה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס"מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphenous צריך להיות עדין מאוד במהלך ההליך כולו. חשוב להיות זהירים בעת החדרת קצות פיפטה לתוך משטחים לומינליים כדי להסיר דם במהלך המבוא של פתרון collagenase. החשיפה לתמיסת אנזים צריכה להיות מבוקרת היטב (לא יותר מ 1 שעות) כדי להפחית א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי - 407911/2021-9).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-0.02% תמיסת EDTAגיבקו25200072
15 ומיקרו I 0.4 לואר Ibidi80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, דילקטט (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571
תחנת טעינה שווה ערך של 6 בארות של 25 מ"מ תאגיד פלקסל אינטרנשיונלLS-3000B25. VJW
8 בארות תא שקופיות עם באר נשלפת תרמופישר סיינטיפיק154453
חומצה אצטית (קרחון)Millipore100063
גיליון אקרילי 1 ס"מ עוביפרספקס
אנטי-CD31 נוגדןAbcamab24590
Anti-CD31, נוגדן FITCתרמו פישר מדעיMHCD3101
נוגדן אנטי-VE-cadherinאיתות תאים2500
צלחות ביופלקס קולגן IFlexcell International CorporationBF3001C
תמיסת אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA8412
תפר כותנה EP 3.5 15 x 45 ס"מBrasutureAP524
Cyclophilin קדימה פריימרThermo Fisher ScientificCustom פריימר
תרמו פישר מדעימעוצב
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D4540
EBM-2 בינוני בסיסיLonzaCC3156
EGM-2 תוספי SingleQuotsLonzaCC4176
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific2657-029
מערכת מתח Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX-5000T
Fluoromount מדיום הרכבה מימיSigma-AldrichF4680
ג'לטין מעור חזירSigma-AldrichG2500
גליצרולSigma-AldrichG5516
עיזים נגד עכבר IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
עיזים נגד ארנב IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11008
נתרן הפרין מרירית מעי חזיר 5000 IU/mLBlau Farmacê uticaמק"ט 68027
מערכת משאבת איבידי (משאבה + יחידת נוזל)Ibidi10902
KLF2 פריימר קדימהThermo Fisher Scientificפריימר הפוך KLF2 בעיצוב
תרמו פישר סיינטיפיקבעיצוב
KLF4 פריימר קדימהThermo Fisher Scientificפריימר הפוך KLF4 בעיצוב
תרמו פישר מדעימעוצב
NOA 280 מנתח תחמוצת החנקןSievers מכשיריםNOA-280i-1
NOS3 פריימר קדימהתרמו פישר מדעימעוצב
NOS3 פריימר הפוךתרמו פישר מדעימעוצב
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא-אולדריץ'158127
סט זלוף 15 ס"מ, ID 1.6 מ"מ, אדום, מיכלי 10 מ"לIbidi10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380
Phosphate buffered מלח (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010031
אשלגן יודידSigma-Aldrich221945
QuanTitec SYBR ערכת PCR ירוקהQiagen204143
פלטפורמת QuantStudio 12K flex אפלייד ביוסיסטמס4471087
ערכת מיקרו RNeasy Quiagen74004
זכוכית שקופיות (24 מ"מ x 60 מ"מ)Knittel GlassVD12460Y1D.01
נתרן ניטריטSigma-Aldrich31443
SuperScript IV מערכת סינתזה של גדיל ראשוןThermo Fisher Scientific18091200
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
כתם כחול טריפן 0.4%Gibco15250-061
קולגנאז מסוג II מ- Clostridium histolyticumSigma-AldrichC6885
הפוך ציקלופילין מעוצב בהתאמה אישיתאישימותאם אישיתמותאם אישית בהתאמה אישיתבהתאמה אישיתבהתאמה אישית

מקורות

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413(2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.