מאמר שיטה

סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

DOI:

10.3791/65123

⸱

19 במאי 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקות חיסוניות הן בדיקות חשובות לזיהוי מטרות מולקולריות רבות. בין השיטות הקיימות כיום, בדיקת החרוזים הציטומטריים זכתה לבולטות בעשורים האחרונים. כל מיקרוספירה שנקראת על ידי הציוד מייצגת אירוע ניתוח של יכולת האינטראקציה בין המולקולות הנבדקות. אלפי אירועים אלה נקראים בבדיקה אחת, ובכך מבטיחים דיוק ושחזור גבוהים של הבדיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם באימות של תשומות חדשות, כגון נוגדנים IgY, לאבחון מחלות. נוגדנים אלה מתקבלים באמצעות חיסון תרנגולות עם האנטיגן של עניין ולאחר מכן חילוץ אימונוגלובולין מן החלמון של ביצים של בעלי חיים; לכן, זוהי שיטה ללא כאבים ופרודוקטיבית מאוד להשגת הנוגדנים. בנוסף למתודולוגיה לאימות מדויק של יכולת זיהוי הנוגדנים של בדיקה זו, מאמר זה מציג גם שיטה לחילוץ נוגדנים אלה, קביעת תנאי הצימוד הטובים ביותר עבור הנוגדנים וחרוזי הלטקס, וקביעת רגישות הבדיקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין טכניקות immunoassay שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, שכן היא מאפשרת ניתוח של אלפי חלקיקים בבדיקה אחת1. טכניקה זו, בנוסף לפרודוקטיביות גבוהה ומאפשרת שימוש בכמויות קטנות יותר של דגימות, מציגה גם גמישות רבה, שכן היא מאפשרת זיהוי של מספר מולקולות, כגון ציטוקינים, מולקולות הידבקות, איזוטיפים נוגדנים וחלבונים 2,3.

חלקיקים שונים משמשים לפיתוח בדיקות אלה, ביניהם חרוזי לטקס, המהווים תשומה יעילה וזולה. אלה יכולים להציג שינויים על פני השטח שלהם, כגון נוכחות של קבוצות פונקציונליות או חלבונים המאפשרים צימוד קוולנטי או לא קוולנטי של מולקולות מסוימות 3,4,5.

בדיקות חיסוניות אלה משתמשות ברכיבים כגון אנטיגנים ונוגדנים כדי לבצע זיהוי של סמני מחלה ובדרך כלל דורשות נוגדנים מיונקים כגון עכברים, ארנבות ועזים. זה יוצר בעיות הקשורות לסוגיות אתיות, שכן חיסון של יונקים בדרך כלל דורש בעלי חיים רבים כדי להשיג תשואה טובה, כמו גם את הביצועים התכופים של נהלים המובילים לסבל של בעלי חיים 6,7. חלופה לכך היא שימוש בנוגדני IgY שבודדו מחלמוני הביצה של תרנגולות מחוסנות, שכן ניתן למצוא בחלמונים ריכוזים גבוהים של נוגדנים ספציפיים כנגד האנטיגנים המחוסנים; הייצור של עוף שווה לייצור של 4.3 ארנבות במהלך שנה 6,7.

לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להערכת נוגדני IgY המתקבלים מחלמוני ביצת תרנגולת באמצעות ציטומטריית זרימה עם חרוזי לטקס. לשם כך, אנו מציעים שיטת סטנדרטיזציה עבור immunoassay חרוז ציטומטרי בפורמט סנדוויץ' באמצעות חרוזי לטקס. כמודל, השתמשנו בנוגדני IgY המכוונים לאנטיגן Plasmodium falciparum histidine-עשיר בחלבון II (IgY-PfHRP2). אנו מתארים שיטה לחילוץ הנוגדנים, דנים בשלבים הקריטיים להגדרת ריכוז הצימוד שלהם לחרוזי הלטקס, ומציגים הערכה של גבול הזיהוי של האנטיגן. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים טכניקה זו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. שיטה זו יכולה לשמש לאיתור מטרות מגוונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. מיצוי IgY מחלמונים

  1. היגינזציה של הביצים
    1. יש לטבול את הביצים (טריות שהוטלו או עד 4 ימים לאחר ההטלה, משושלת Gallus gallus Dekalb White) בתמיסה מדוללת 0.2% של נתרן היפוכלוריט, לשטוף במהירות תחת מים זורמים ולנגב בעדינות לשימוש מאוחר או מיידי.
      הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד 15 ימים.
  2. הפרדת החלמונים
    1. שוברים את הביצה בזהירות, ומפרידים את החלמון מהלבן בעזרת מפריד חלמונים.
    2. הסר את עודף הלבן בעזרת נייר סינון. מנקבים את החלמון, ואוספים את חלקו הפנימי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. אחסנו את החלמון בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות לפחות לפני השימוש.
      הערה: במהלך ניסויים אלה (נתונים לא מוצגים), נצפה כי השימוש בחלמונים שלא הוקפאו בעבר הפריע לבידוד של אימונוגלובולינים מהחלק השומני של החלמונים.
  3. החמצה של החלמונים
    1. הפשירו את החלמון המאוחסן ודללו אותו ביחס של 1:10 ב-PBS של 1 מילימול. התאימו את רמת החומציות של התמיסה ל-5 עם 1 N HCl, ודגרו על התמיסה ב-4°C למשך 6-24 שעות.
    2. צנטריפוגו את התמיסה במשקל 3,000 × גרם למשך 40 דקות, משחזרים את הסופרנטנט ומסננים אותו באמצעות מסנן תאית בקוטר 0.7 מ"מ.
  4. משקעים של שומנים עם חומצה קפרילית
    1. התאימו מחדש את רמת החומציות של הסופרנאטנטים ל-5, והוסיפו את החומצה הקפרילית (≥98% ריכוז התחלתי) לריכוז סופי של 8.7% תוך ערבוב מתמיד במשך 30 דקות ב-4°C.
      הערה: נפח הסופרנאטנט עשוי להשתנות בהתאם למסת השומנים המואצת בשלב 1.3.2. כך, למשל, 3.107 מ"ל של חומצה קפרילית יש להוסיף 35 מ"ל של supernatant המתקבל לאחר סינון.
    2. צנטריפוגו את הדגימות למשך 15 דקות במשקל של 18,600 × גרם, והפרידו את הסופרנאטנט מהחומר המואץ.
    3. התאימו מחדש את רמת החומציות של התמיסה ל-7.4 באמצעות 1 M NaOH, כמתו את הנוגדנים באמצעות בדיקת ברדפורד8, ואחסנו את הנוגדנים בטמפרטורה של -20°C עד לזמן השימוש.
      הערה: הנוגדנים התקבלו בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, שאומת באמצעות ג'ל SDS-PAGE 12%.

2. עקומת רוויה של נוגדני IgY לחרוזי לטקס

  1. צימוד החרוזים לנוגדני IgY
    1. הוסף 21 μL של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, ריכוז התחלתי של 367 mM) ו- 21 μL של N-hydroxysuccinimide (NHS, ריכוז התחלתי של 50 mM) ל- 21 μL של חרוזי לטקס (4% w/v), והתאם לנפח סופי של 2.1 מ"ל עם PBS מסונן של 10 mM.
      הערה: טווח ה- pH של פתרון PBS צריך להיות בין 7.2 ל -7.4, שכן בעבודה זו נצפה שינוי שלילי בצימוד ובצעדים אחרים בעת שימוש בתמיסה מחוץ לטווח זה.
    2. יש לדגור ב-22°C עם רעידות מהירות במשך 3 שעות.
    3. הוסף 4 מיקרוגרם, 2 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 0.5 מיקרוגרם, 0.25 מיקרוגרם, 0.125 מיקרוגרם ו-0 מיקרוגרם של נוגדן IgY-PfHRP2 שחולץ בעבר (ראה שלב 1.4.3) למיקרו-צינוריות שונות המכילות 100 מיקרוליטר של התמיסה המתוארת בשלב 2.1.1 (ריכוז חרוזים סופי של 0.04%), ודגור באותם תנאים כמתואר בשלב 2.1.2 במשך 16 שעות.
    4. צנטריפוגות הדגימות ב 857 × גרם ב 15 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatants, ולשטוף את חרוזי לטקס פעמיים עם 500 μL של 10 mM PBS מסונן (0.008% ריכוז חרוזים סופי) באמצעות מחזורי צנטריפוגה ותרחיף.
      הערה: אין לחרוג מ 857 × גרם, כמו בעבודה זו, נצפתה כי מעבר למהירות זו החרוזים עוברים עיוותים המשנים לרעה את תוצאת הבדיקה.
  2. חסימת החרוזים
    1. יש להשהות מחדש את הדגימות ב-1 מ"ל של חיץ חוסם (ריכוז חרוזים סופי של 0.004%) (מסונן 10 mM PBS + אלבומין בסרום בקר, BSA, 5%), ולדגור באותם תנאים כמתואר בשלב 2.1.2 למשך שעתיים.
    2. לאחר החסימה, יש לשטוף כמתואר בשלב 2.1.4 ולהשהות מחדש במאגר PBS של 10 mM.
  3. דגירה עם נוגדנים משניים נגד עוף המסומנים עם Alexa Fluor 488
    1. הוסף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי נגד עוף (2 מ"ג / מ"ל) מדולל ל 1:2,000 ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לכל מיקרו-צינור, כמתואר בשלב 2.1.3.
    2. דגרו על הדגימות כמתואר בשלב 2.1.2, הפעם בחושך, למשך 30 דקות.
    3. שטפו את החרוזים כמו בשלב 2.1.4, והשהו מחדש עם 250 מיקרוליטר של (ריכוז חרוזים סופי 0.016%) מסונן 10 mM PBS. בצע את קריאת ציטומטר הזרימה כמתואר בסעיף 5.
      הערה: מנתוני אחוז הפלואורסצנטיות שהתקבלו, שימו לב לנקודה הראשונית של היווצרות הרמה (1 מיקרוגרם, כפי שנצפה במחקר זה). אנו ממליצים להשתמש בנקודה השנייה של הרמה (2 מיקרוגרם, כפי שנצפה כאן) עבור השלבים הבאים (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: גרף של ניתוח ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את נקודת הרוויה של צימוד נוגדני IgY-Pf HRP2 לחרוזי הלטקס. ציר ה-x מייצג את ריכוז הנוגדנים, וציר ה-Y מייצג את אחוז הפלואורסצנטיות המתקבלת. מבחן קרוסקל-ואליס, עמ' < 0.0033. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בדיקת ציטומטריית זרימה המבוססת על חרוזי לטקס לזיהוי אנטיגן

  1. לאחר קביעת נקודת הרוויה של נוגדני IgY לחרוזי הלטקס, בצע שוב את תהליך הפעלת החרוזים, לפי שלב 2.1.1.
    1. זוג החרוזים בריכוז הרוויה שנצפה (כמתואר בשלב 2.1.3), ודגור לפי שלב 2.1.2.
      הערה: בבדיקות שבוצעו באמצעות נוגדן IgY-PfHRP2, מצב הרוויה היה 2 מיקרוגרם עבור כל 1 מיקרוליטר של חרוזי לטקס.
  2. חוסמים ושוטפים את החרוזים לפי שלב 2.2.
  3. דגירה עם האנטיגן
    1. כדי לקבוע את גבול הזיהוי, יש להפיץ את המקבילה של 100 μL של הכנת החרוזים החסומים לצינורות המכילים כמויות שונות של החלבון הרקומביננטי Pf HRP2 (1 מיקרוגרם/מ"ל) (r PfHRP2, 10 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 0.1 מיקרוגרם, 0.01 מיקרוגרם, 0.001 מיקרוגרם, 0.0001 מיקרוגרם ו-0 מיקרוגרם) מדוללים ב-10 mM PBS + 0.5% BSA בטריפליקט.
      הערה: חלבון רקומביננטי זה פותח בעבודתם של Sousa et al.9.
    2. דגרו על תמיסות החרוזים עם חלבון rPfHRP2 כמתואר בשלב 2.1.2 למשך שעה אחת.
    3. בצע שטיפות כמתואר בשלב 2.1.4, והשלך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה.
  4. דגירה עם הנוגדן הראשוני
    1. הוסף 2 מיקרוגרם של נוגדן IgG עכבר כנגד חלבון rPfHRP2 מדולל ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לנפח סופי של 100 μL בכל דגימה. לדגור על הדגימות כמתואר בשלב 2.1.2, ולהשליך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה האחרונה.
      הערה: נוגדן זה פותח בעבודה של Sousa et al.9.
  5. דגירה עם הנוגדן המשני
    1. הוסף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי נגד עכבר (2 מ"ג / מ"ל) מדולל ל 1:2,000 ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לכל דגימה. יש לדגור כמתואר בשלב 2.1.2, ולהשהות מחדש ב-250 μL (ריכוז חרוזים סופי של 0.016%) של PBS מסונן של 10 mM. בצע את הקריאה לפי סעיף 5.

4. קריאת ציטומטר זרימה של הדגימות

  1. הגדרת ציטומטריה: יישור הפרמטרים האופטיים של הציטומטר המצומדים למחשב
    1. הפעל את המחשב ואת ציטומטר הזרימה והמתן מספר דקות עד שהציוד יתחבר למחשב.
    2. לחץ על תוכנת הציטומטריה המותקנת במחשב והיכנס אליה. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | סטארט-אפ | מצב נקי | נוזלי SIT.
      הערה: יש להסיר בועות אוויר וחסימות במהלך תהליך התחלת הציטומטר לפני רכישת הדגימה.
  2. בקרת איכות
    1. השתמש בריאגנט בקרת האיכות כדי לבדוק את המתחים של צינורות מכפיל האור ולהעריך את רגישות הציטומטר.
    2. מקם את מגיב הגדרת הציטומטר וחרוזי המעקב בצינור פוליסטירן מכוסה בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ.
    3. מערבבים בעדינות את הצינור על ידי ערבול.
  3. הכנת חרוזי ההשעיה
    1. להגדרת קו הבסיס, הוסף 0.5 מ"ל של מדלל (PBS מסונן 10 מ"מ, pH 7) ושלוש טיפות חרוזים לצינור פוליסטירן מכוסה 12 מ"מ x 75 מ"מ. סובבו את הצינור בעדינות לפני השימוש.
    2. בסביבת העבודה של תוכנת הציטומטר, בחר Cytometer | CST, והמתן עד שהציטומטר יתנתק מממשק התוכנה של הציטומטר ויתחבר לממשק CS&T. שים לב להודעה הבאה בשורת המצב של תוכנת הציטומטר בתחתית המסך: ציטומטר מנותק.
    3. השתמש בצינור פוליסטירן מכוסה בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכיל את מגיב בקרת האיכות וחבר אותו לבדיקת ציטומטר הזרימה.
  4. אימות תצורת הציטומטר
    1. בחלון סיכום מערכת , ודא שתצורת הציטומטר מתאימה לניסוי.
  5. הגדרה לבדיקת ביצועים
    1. בחר את מזהה חרוזי ההתקנה המתאים לכמות חרוזי המחקר של CS&T.
  6. בדיקת ביצועים
    1. חבר את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה ולחץ על חלון בקרת התקנה. בחר בדוק ביצועים ולחץ על הפעל.
    2. לאחר השלמת בדיקת הביצועים, המתן לפתיחת תיבת דו-שיח. בצע אחת מהפעולות הבאות:
      1. כדי להציג את דוח הביצועים של Cytometer , לחץ על הצג דוח.
      2. כדי להשלים את בדיקת הביצועים ולחזור לתצוגת ההגדרה של סביבת העבודה, לחץ על סיום.
      3. שים לב לתוצאה הסופית של ניתוח הרגישות המורפומטרית והפלואורסצנטית המופיע בסיכום מערכת | תוצאת ביצועי ציטומטר עם המצב PASSED.
      4. הסר את הצינור מהציטומטר. בדוק את תוצאות ביצועי הציטומטר המוצגות בחלון סיכום מערכת .

5. ניתוח דגימה באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. היכנס לתוכנת ציטומטר.
    1. בסביבת העבודה של תוכנת הציטומטר, בחר Cytometer | מצב נקי | נוזלי SIT.
    2. התאם לסביבת העבודה של התוכנה.
    3. הגדירו את אסטרטגיית ה-gating בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של חלקיקי הבקרה השליליים (חרוזים ללא פלואורסצנטיות).
    4. כדי לקבוע את מורפומטריית התא, בחר Dot Plot Plot Graphic לניתוח פרמטרים של FSC-A באמצעות SSC-A (איור משלים 1A).
    5. קבע תאים בודדים על-ידי SSC באמצעות Dot Plot Plot Plot Graphic לניתוח SSC-H בציר y ו-SSC-W בציר x (איור משלים 1B), וקבע תאים בודדים על-ידי FSC באמצעות Dot Plot Plot Plot Graphic לניתוח FSC-H בציר y ו-FSC-W בציר x (איור משלים 1C).
    6. עבור ניתוחי הפלואורסצנטיות, בחר FL1 Dot Plot Plots באמצעות FCS-A. השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכילה דגימות ללא תווית ודגימות שסומנו בעבר עם Alexa Fluor 488 בצבע יחיד (איור משלים 1D, E).
  2. רכוש את המדגם בציטומטריית זרימה.
    1. השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכילה את הדגימות שסומנו קודם לכן. ערבבו את תכולת הצינור בזהירות, חברו את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה ולחצו לחיצה שמאלית על Acquire.
    2. כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים, לחץ על פרמטרים, ובאפשרויות שלהלן, התאם את המתח של ה- FSC ל- 182 V ואת המתח של ה- SSC ל- 236 V. לקביעת אחוז החסימה, לחצו על ציטומטר | סף, ובאפשרויות הבאות, התאם את FSC ל- 500 V.
    3. הגדר את שער הניתוח כדי לאפיין חלקיקים לפי גודל ומורכבות, כמו גם לבצע ניתוח תא בודד.
    4. כדי להסיר autofluorescence, לנתח את הדגימה ללא צבע המכיל רק את חרוזי לטקס, ולהתאים את המתחים של הגלאי: באפשרויות הבאות, להתאים את המתח של FL1 (FITC) ל 332 V.
    5. הגדר את שער הניתוח הפלואורסצנטי בתבנית מרובעת מהנקודה השלילית המוצגת בגרף התוויית הנקודות.
    6. לאחר התאמת הניתוחים המורפומטריים והפלואורסצנטיים, הגדר את המכשיר עבור 50,000 אירועים: תחת רכישה, לחץ על הקלט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מספק ייצוג גרפי של תהליך מיצוי נוגדני IgY באמצעות החמצה, ואחריו הפרדה באמצעות חומצה קפרילית (איור 2).

figure-results-1
איור 2: ייצוג סכמטי של שלב מיצוי נוגדני IgY והפרדה באמצעות חומצה קפרילית . (A) הפרדת החלמון, התאוששות בצינור חרוטי והקפאה. (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת המשקעים של נוגדן IgY על ידי הפחתת pH ואחריה הפרדת שומנים באמצעות חומצה קפרילית יעילה בבידוד סך הנוגדנים ללא כל אובדן פונקציונליות. השיטה המוצעת כאן פשוטה וזולה יותר מזו שדווחה על ידי Redwan et al.11, שהשתמשו גם במשקעים על ידי החמצה וחומצה קפרילית אך עם פרוטוקול מורכב ומייגע יותר. שיטה זו מציגה גם יתרונות על פני מתודולוגיות נפוצות לבידוד IgY מחלמון ביצה, כגון אלה המשתמשות במשקעים PEG 12,13, נתרן סולפט 14,15 וכלורופורם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים פוטנציאליים ביחס למחקר, לכתיבה ולפרסום של מאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ל- FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), לתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה (PPGBIOTEC באוניברסיטה הפדרלית של אמזונס - UFAM), ל- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), ול- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) על מתן המלגות. איור 2 ואיור 4 נוצרו עם biorender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IgY נגד עוף (H+L), נספג מאוד צולב, CF  נוגדן 488A המיוצר בחמורסיגמא-אולדריץ'SAB4600031
נגד עכבר IgG (H+L), F(ab′)2סיגמא-אולדריץ'SAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS& חרוזי מחקר T (CS& חרוזי מחקר T)BD Biosciences655050
BD FACSDiva software 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad Protein Assay Colour Reagent ConcentrateBio-Rad#5000006
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA4503
חומצה קפריליתSigma-AldrichO3907
צנטריפוגה 5702 REppendorfZ606936
כלוריד 37% חומצה בדרגה מולקולריתNEON02618 NEON
CML לטקס, 4% w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide אבקת הידרוכלוריד (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
מי מלח חוצץ פוספטסיגמא-אולדריץ1003335620
נתרן הידרוקסידAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
נתרן היפוכלוריטAcs CientificaR09211000
מיקסר תרמו חום/מגניבKASVIK80-120R
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IgY

מאמרים קשורים