מאמר שיטה

אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס ככלי להפלה ממושכת של lncRNAs גרעיניים בשורות תאים אנושיים

DOI:

10.3791/65124

⸱

1 בספטמבר 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לנתח את תפקודם של lncRNAs בתהליכים תלויי זמן כגון חוסר יציבות כרומוזומלית, יש להשיג אפקט נוקדאון ממושך. למטרה זו, מוצג כאן פרוטוקול המשתמש באוליגונוקלאוטידים אנטיסנס מותאמים כדי להשיג נוקדאון יעיל בשורות התאים למשך 21 יום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAs ארוכים שאינם מקודדים (lncRNAs) ממלאים תפקידי רגולציה מרכזיים בביטוי גנים ברמת השעתוק. ראיות ניסיוניות קבעו כי חלק ניכר מה-lncRNA מצטבר באופן מועדף בגרעין. לניתוח תפקודם של lncRNAs גרעיניים, חשוב להשיג הפלה יעילה של תעתיקים אלה בתוך הגרעין. בניגוד לשימוש בהפרעות RNA, טכנולוגיה התלויה במנגנון ההשתקה הציטופלזמי, טכנולוגיית אוליגונוקלאוטיד אנטיסנס (ASO) יכולה להשיג הפלת RNA על ידי גיוס RNase H לדופלקסים RNA-DNA עבור מחשוף RNA גרעיני. בניגוד לשימוש בכלי CRISPR-Cas להנדסת גנום, כאשר יכולים להתרחש שינויים אפשריים במצב הכרומטין, ASOs מאפשרים הפלה יעילה של תעתיקים גרעיניים מבלי לשנות את הגנום. עם זאת, אחד המכשולים העיקריים לנוקדאון בתיווך SO הוא ההשפעה הזמנית שלו. לצורך חקר ההשפעות ארוכות הטווח של השתקת lncRNA, יש צורך בשמירה על נוקדאון יעיל לאורך זמן. במחקר זה פותח פרוטוקול להשגת אפקט נוקדאון למשך למעלה מ-21 יום. המטרה הייתה להעריך את ההשפעות הרגולטוריות של lncRNA על הגן המקודד הסמוך RFC4, הקשור לחוסר יציבות כרומוזומלית, מצב שנצפה רק לאורך זמן והזדקנות התאים. נעשה שימוש בשני קווי תאים אנושיים שונים: PrEC, תאי אפיתל ראשוניים רגילים של הערמונית, ו-HCT116, קו תאי אפיתל המבודד מקרצינומה של המעי הגס, והשיג נוקדאון מוצלח בשורות התאים שנבדקו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרוב המכריע של הגנום האנושי מתומלל, מה שמוליד מגוון רחב של תעתיקים, כולל lncRNAs, שמספרם עולה על מספר הגנים המקודדים המבוארים בטרנסקריפטום האנושי1. LncRNAs הם תעתיקים ארוכים יותר מ-200 נוקלאוטידים שאינם מקודדים חלבונים 2,3 ונבדקו לאחרונה על תפקידיהם הרגולטוריים החשובים בתא4. הוכח כי תפקידיהם תלויים בלוקליזציה התת-תאית שלהם5, כגון הגרעין שבו חלק משמעותי מ-lncRNAs מצטברים ומשתתפים באופן פעיל בוויסות שעתוק6 ולתחזוקת ארכיטקטורה גרעינית7, בין תהליכים ביולוגיים אחרים 8,9,10.

לצורך אפיון פונקציונלי של lncRNAs גרעיניים, יש להשתמש בשיטות המסוגלות לגרום לנוקדאון (KD) בגרעין, ו-ASOs הם כלי רב עוצמה להשתקת תעתיקים גרעיניים. באופן כללי, ASOs הם רצפי DNA חד-גדיליים ~ 20 זוגות בסיסים באורך הנקשרים ל-RNA משלים על ידי זיווג בסיסי ווטסון-קריק 11,12,13 ויכולים לשנות את תפקוד ה-RNA באמצעות מנגנונים התלויים במבנה הכימי שלהם ובשינויים 13,14. ניתן לחלק את השינויים הכימיים של ASO לשתי קבוצות עיקריות: שינויים בעמוד השדרה ושינויים בטבעת סוכר 2'15, שניהם נועדו להגביר את היציבות על ידי הענקת עמידות גבוהה לנוקלאזות אך גם לשפר את האפקט הביולוגי המיועד13,16. בין השינויים בעמודת השדרה, קשרי פוספורמידאט מורפולינו (PMO), תיופוספורמידאט ומורפולינו נמצאים בשימוש נרחב למטרות כגון הפרעה בשחבור17,18 על ידי שימוש כסוכני חסימה סטריים19 אך לא כדי לגרום לפירוק התעתיק. שינוי נוסף בעמוד השדרה הוא קשר הזרחן (PS), אחד השינויים הנפוצים ביותר ב-ASOs. בניגוד לשינויים שהוזכרו קודם לכן, אגרות חוב PS אינן מפריעות לגיוס RNase H12,20, ובכך מאפשרות הפלת RNA. עם זאת, יש גם מגוון רחב של שינויים בטבעת סוכר בגודל 2 אינץ'21; עם זאת, לצורך הפלת RNA, בין השינויים הגורמים להשפעות השתקה יעילות ניתן למנות חומצות גרעין נעולות (LNAs)22, 23 ו-2'-O-methyl modification24. למרות ש-LNAs הוכחו כיעילים ביותר עבור נוקדאון בהשוואה לשינויים אחרים25, הם יכולים לגרום להשפעות לא רצויות כגון רעילות כבד26 ואינדוקציה של אפופטוזיס in vivo ו-in vitro27.

לצורך הפלת RNA, ASOs עם השינויים המתאימים שהוזכרו קודם יכולים לגייס RNase H1 ו-H220,28, ואנזימים אלה מגויסים להכלאות DNA-RNA ומבקעים את ה-RNA המטרה, ומשחררים את ה-ASO13. תוצרי ה-RNA של מחשוף זה מעובדים לאחר מכן על ידי מנגנון מעקב ה-RNA, וכתוצאה מכך פירוק RNA29 מבלי לשנות את אזור העניין הגנומי, בניגוד לטכניקות אחרות כגון מערכות CRISPR-Cas, שבהן שינויים במצב הכרומטין יכולים ליצור השפעות ביולוגיות לא רצויות30. למרות היתרונות של טכנולוגיית ASO, השפעות ההשתקה הזמניות עקב חלוקת תאים או פירוק ASO לאורך זמן מהוות מכשול שיש להתגבר עליו בעת חקר תהליכים תלויי זמן כגון אי יציבות כרומוזומלית (CIN)31.

בפרט, CIN מוגדר כשיעור מוגבר של שינויים במספר הכרומוזומים ובמבנה בהשוואה לאלו של תאים נורמליים32 ונובע משגיאות בהפרדת הכרומוזומים במהלך המיטוזה, מה שמוביל לשינויים גנטיים שמקורם בהטרוגניות תוך-גידולית33 לאורך זמן. לפיכך, לא ניתן להעריך CIN רק על ידי מציאת קריוטיפ אנופלואידי. למחקר והערכה נאותים של CIN בתרבית תאים, חשוב לעקוב אחר התאים לאורך זמן. לצורך חקר ההשפעות של lncRNA KD על CIN, יש צורך במתודולוגיה המאפשרת אפקט KD ממושך. למטרה זו, נעשה שימוש ב-ASOs בפרוטוקול זה, שבו lncRNA-RFC4 הושתק בהצלחה בשורות התאים האנושיים HCT115 ו-PrEC למשך 18 ו-21 ימים, בהתאמה. תעתיק זה הוא lncRNA לא מאופיין באורך של 1.2 kb, ומיקומו הגנומי הוא על כרומוזום 3 (q27.3). הוא צמוד לגן מקודד החלבון RFC4, גן הקשור ל-CIN בסוגים שונים של סרטן אנושי 34,35,36.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מיועד לביצוע רק על ידי אנשי מעבדה בעלי ניסיון בהליכי בטיחות במעבדה. חיוני לקרוא כראוי את גיליונות נתוני הבטיחות מכל הריאגנטים והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה לפני תחילת הטיפול בחומרים וציוד מסוכנים. חיוני לקרוא, להבין ולמלא את כל דרישות הבטיחות המצוינות במדריך בטיחות המעבדה של המוסד שלך לאורך כל הפרוטוקול. סילוק כל הפסולת הביולוגית והכימית חייב להתבצע על פי המדריך לניהול וסילוק פסולת של המוסד. אם לא מטפלים בזהירות ובהתאם לנוהלי מעבדה בטוחים, חומרים וציוד המשמשים בפרוטוקול זה עלולים לגרום לפציעה חמורה. פעל תמיד לפי מדריך מעבדת הבטיחות ונהלי הבטיחות של המוסד.

1. תכנון ASOs

  1. תכנון ידני של ASOs כמתואר להלן.
    1. השג את הרצף המלא של תמליל היעד ונתח אותו בשרת האינטרנט של RNAfold, אוניברסיטת וינה37 (טבלת חומרים), תוך שימוש בפרמטרי ברירת המחדל באתר כדי להשיג את המבנה המשני של האנרגיה החופשית המינימלית (MFE).
    2. כאשר התוצאות מוכנות, עבור אל ציור מבנה רגיל MFE ולחץ על הצג בפורנה כדי לפתוח את המבנה המשני של MFE באתר, והתוכנה תציג את המבנה המשני החזוי של התמליל המנותח.
    3. מהמבנה המשני החזוי של MFE, בחר אזור באורך של 20 bp ב-RNA, הימנע ממחרוזות G (רצפים של 3 גואנינים ברציפות) בעת תכנון האוליגונוקלאוטידים. לבחירת אזור היעד הטוב ביותר עבור ה-ASO, השתמשו באזורים הצפויים להיות בעלי הסתברות נמוכה יותר לזיווג בסיסים פנימיים (איור 1).
    4. מהאזור שנבחר של 20 bp, צור את רצף ההשלמה ההפוך. צור ידנית את ההשלמה ההפוכה או השתמש בכלי המקוון של השלמה הפוכה (טבלת חומרים). רצף המשלים ההפוך יהיה ה-ASO שיש לסנתז עבור הניסוי.
    5. נתח את רצף ה-ASO באמצעות Nucleotide Blast NCBI (blastn) ו-UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). ודא ש-ASOs אינם מראים הומולוגיה לתעתיקים אחרים או לאזורים גנומיים אחרים בגנום האנושי.
      הערה: סינתזה וטיהור ASO בוצעו על ידי חברה מסחרית (טבלת חומרים).
  2. ודא שלאוליגונוקלאוטידים המסונתזים יש את המאפיינים הבאים.
    1. ודא קשרי PS לאורך כל הרצף של האוליגונוקלאוטיד38 (איור 2A). ודא ש-ASOs הם כימריים, עם 5 נוקלאוטידים המאגפים את הקצוות 5' ו-3' עם טבעות סוכר ששונו עם 2'-O-methyl (איור 2B).
    2. ודא של-10 הנוקלאוטידים באמצע יש טבעת סוכר לא שונה כדי לתמוך בקשירת RNase H (איור 2C).
    3. בקשו מהחברה לבצע טיהור באמצעות התפלה סטנדרטית ושלב הפוך (RP) HPLC39.
    4. הזמינו משלוח ASO בפורמט ליופילי.
  3. יש להמיס את ה-ASOs שעברו ליופיליזציה בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום לריכוז סופי של 200 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  4. הכן את תמיסת העבודה של ASO על ידי דילול המלאי המרוכז לריכוז של 20 מיקרומטר. הכן את הדילול באמצעות DPBS. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור מחקר זה, תוכננו שני ASOs המכוונים ל-lncRNA-RFC4. לאופטימיזציה של ריכוז ה-ASO עבור טרנספקציה ויעילות, בוצע הפרוטוקול של Zong et al.40 . שני ASOs תוכננו ועברו אופטימיזציה ניסויית על פי הפרוטוקול של Zong: ASO-lncRFC4 ו-ASO-lncRFC4-2. לאחר האופטימיזציה, נבחר ASO יעיל אחד המכוון ל-lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, עבור פרוטוקול הנוקדאון הממושך (איור משלים 1). כבקרה חיובית, נעשה שימוש ב-ASO יעיל שאושר בעבר המכוון ל-lncRNA MALAT18 : ASO-MALAT1. עבור הבקרה השלילית, תוכנן ASO המכוון לגן Escherichia coli lacZ, ASO-lacZ (מספר כניסה NCBI: FN297865).

2. הכנת תאים

הערה: עבוד בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים בכל פעם שמטפלים בקווי תאים, תמיסות, חומר או כל מוצר לשימוש במהלך מניפולציה של תרבית תאים. בעת מניפולציה של נוזלים לתרבית תאים, השתמש תמיד בפיפטות סרולוגיות מעוקרות או במיקרופיפטות עם קצות מעוקרים. מלא תמיד ופעל לפי כל דרישות הבטיחות המצוינות במדריך הבטיחות במעבדה של המוסד במהלך כל הפרוטוקול.

  1. הכן את אמצעי תרבית התאים השלם עבור כל שורת תאים כמתואר להלן.
    1. עבור HCT116, הכינו את מדיום 5A של מקוי עם 10% סרום בקר עוברי (FBS).
    2. עבור PrEC, הכינו את המדיום הבסיסי של תאי האפיתל של הערמונית עם ערכת גידול תאי האפיתל של הערמונית.
  2. השתמש בשלוש לוחות תרבית של 100 מ"מ (55 ס"מ2 שטח פנים) לניסויי KD, אחד לכל אוליגונוקלאוטיד לשימוש: ASO המכוון ל-lncRNA, ASO שישמש כבקרה חיובית (ASO-MALAT1) ו-ASO שישמש כבקרה שלילית (ASO-lacZ).
  3. השתמש בשתי לוחות תרבית של 35 מ"מ (9 ס"מ2 בשטח פנים) שישמשו כנקודות ביקורת עבור KD בין מעברי תאים, שאחת מהן תועבר עם מדיית טרנספקציה מלאה עבור ASO-lncRFC4 והשנייה עבור ASO-lacZ.
    הערה: טרנספקציה תוכננה על פי הנהלים והפרוטוקולים של יצרן הטרנספקציה מבוססת השומנים (ראה טבלת החומרים) שדווחו בעבר41,42.
  4. תאי זרע בצפיפות של 1 x 104 תאים/ס"מ2 בצלחות תרבית תאים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה באמצעות 5% CO2 באוויר עד שהתאים מגיעים למפגש של 50% (כאשר 50% משטח השטח מכוסה על ידי שכבת התא החד-שכבתית). עם מפגש של 50%, התאים מוכנים להעברה עבור פרוטוקול זה.
    הערה: לצורך טרנספקציה של ASO-lncRFC4 ו-ASO-lacZ, נזרעו צלחת אחת של 100 מ"מ וצלחת אחת של 35 מ"מ. עבור טרנספקציה של ASO-MALAT1, רק צלחת של 100 מ"מ נזרעה (איור 3A).

3. טרנספקציה

  1. חימום סרום מופחת בינוני ל-37 מעלות צלזיוס לפני תחילת ההליך.
  2. עבור טרנספקציה עם ASO-lacZ ו-ASO-lncRFC4, בצע את השלבים המתוארים להלן.
    הערה: טרנספקציה עם ASO-lacZ ו-ASO-lncRFC4 מתוכננת לתאים בשטח פנים של 55 ס"מ2; כאשר משתמשים באזורים שונים, ניתן לכוונן את עוצמת הקול בהתאם. יש לבצע הליך זה עבור כל ASO המשמש באותם תנאים.
    1. הכן את צינור 1 בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים על ידי המסת 43.75 מיקרוליטר של ASO (20 מיקרומטר) ב-1.4 מ"ל של מדיום סרום מופחת חם בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל.
    2. הכן את צינור 2 בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים על ידי ערבוב של 18.66 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים עם 1.4 מ"ל של מדיום סרום מופחת חם בצינור מיקרופוגה נטול RNase של 1.5 מ"ל.
    3. דגרו את הצינורות 1 ו -2 בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    4. הוסף את התמיסה הכלולה בצינור 2 (מגיב טרנספקציה + סרום מופחת) ישירות לצינור 1 (ASO + סרום מופחת) לאט, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע פיזור הריאגנטים על פני הצינור.
    5. דגרו את התערובת הכלולה בצינור 1 למשך 20 דקות בתוך מכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
    6. יש להוסיף סרום בינוני חם ומצומצם לשפופרת 1 לנפח סופי של 8.75 מ"ל.
      הערה: אמצעי הטרנספקציה הסופי הכיל ASO בריכוז של 100 ננומטר.
    7. הסר את אמצעי התרבות מתבנית תרבית התאים המכילה את התאים שיש להעביר והוסף 7.5 מ"ל מאמצעי הטרנספקציה לצלחת התרבות של 100 מ"מ ו-1 מ"ל לצלחת התרבות של 35 מ"מ ישירות בשכבת התא החד-שכבתית, טיפה אחר טיפה. ודא שהמדיה מפוזרת באופן שווה על פני כל המשטח על ידי ניעור עדין של המנה.
    8. דגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 באוויר למשך 6 שעות.
    9. לאחר 6 שעות של דגירה באמצעי הטרנספקציה, הוסף 7.5 מ"ל של מדיה שלמה לתאים בצלחת התרבות של 100 מ"מ ו-1 מ"ל של מדיה שלמה לתאים בצלחת התרבות של 35 מ"מ. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  3. עבור טרנספקציה עם ASO-MALAT1, בצע את הניסויים כמתואר להלן.
    הערה: טרנספקציה עם ASO-MALAT1 מתוכננת לתאים בשטח פנים של 55 ס"מ2.
    1. הכן את צינור 1 בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים על ידי המסת 37.5 מיקרוליטר של ASO (20 מיקרומטר) ב-1.2 מ"ל של מדיום סרום מופחת חם בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל.
    2. הכן את צינור 2 על ידי ערבוב של 16 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים עם 1.2 מ"ל של מדיום סרום מופחת חם.
    3. דגרו את צינורות 1 ו -2 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים.
    4. הוסף את התמיסה הכלולה בשפופרת 2 (מגיב טרנספקציה על בסיס שומנים + סרום מופחת) ישירות לצינור 1 (ASO + סרום מופחת) לאט, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע פיזור הריאגנטים על פני הצינור.
    5. דגרו את התערובת הכלולה בצינור 1 למשך 20 דקות בתוך מכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
    6. יש להוסיף סרום חם ומצומצם בינוני לשפופרת 1 לנפח סופי של 7.5 מ"ל. אמצעי הטרנספקציה הסופי הכיל ASO בריכוז של 100 ננומטר.
    7. הסר את אמצעי התרבות מצלחת תרבית התאים המכילה את התאים שיש להעביר והוסף 7.5 מ"ל של אמצעי הטרנספקציה ישירות לתא חד-שכבתי טיפתית כדי להבטיח שהמדיום יתפזר באופן שווה לאורך כל המשטח על ידי ניעור עדין של המנה.
    8. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה באמצעות 5% CO2 באוויר למשך 6 שעות.
    9. לאחר 6 שעות של דגירה עם אמצעי הטרנספקציה, הוסף 7.5 מ"ל של מדיה שלמה לתאים ודגירה בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  4. העריכו תאים במיקרוסקופ כל 12-24 שעות עד שהתאים מוכנים לסבב הטרנספקציה הבא.
    הערה: לאחר מכן, יש לבצע טרנספקציה כאשר התאים משיגים מפגש של 70%. במידת הצורך, החלף מדיה במדיום תרבותי שלם.
  5. כאשר התאים מתכנסים ב-70% בצלחת תרבית התאים, חזור על ההליך (שלבים 3.1 עד 3.4) ובצע את סבב הטרנספקציה הבא.
    הערה: לאחר הטרנספקציה השנייה, יש להעריך את התאים במיקרוסקופ כל 12-24 שעות. יש לבצע קצירת תאים ומעבר כאשר התאים משיגים מפגש של 80%-85%. במידת הצורך, החלף מדיה במדיום תרבותי שלם.

4. קצירת תאים ומעבר

הערה: קצירת תאים ומעבר מבוצעים לאחר כל 2 סבבים של טרנספקציה ולאחר סבבי הטרנספקציה ה-2, ה-4ו-6. הזמן הממוצע לקציר בתאי HCT116 היה 6 ימים לאחרהטרנספקציות ה-1, ה-3וה-5, ועבור תאי PrEC, הזמן הממוצע היה 7 ימים לאחרהטרנספקציות ה-1, ה-3 וה-5. נקודת הזמן לטרנספקציה שונה עבור שני קווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה. עבור HCT116, הטרנספקציותה-2,ה-3, ה-4,ה-5 ו-6 מבוצעות 3, 6, 9, 12 ו-15 ימים לאחר הטרנספקציה הראשונה, בהתאמה. עבור PrEC, הטרנספקציות ה-2, ה-3,ה-4, ה-5 וה-6 מבוצעות 3, 7, 10, 14 ו-18 ימים לאחר הטרנספקציה הראשונה, בהתאמה. עיין בציר הזמן באיור 3 כדי לבדוק נקודות זמן עבור טרנספקציה, מעבר וקציר.

  1. לבצע קצירת תאים ומעבר לניסויי KD בלוחות תרבית של 100 מ"מ כמתואר להלן.
    1. המשך לקצירת תאים ומעבר כאשר התאים משיגים מפגש של 80%-85%.
    2. מחממים את המדיום השלם ותמיסות הכביסה ל -37 מעלות צלזיוס. מחממים את מגיב הדיסוציאציה לטמפרטורת החדר. מחממים את תמיסת הנטרול של מגיב הדיסוציאציה לטמפרטורת החדר.
      הערה: תמיסות כביסה, ריאגנטים לדיסוציאציה ותמיסות נטרול שונות עבור שני קווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה. תאי HCT116 נשטפים עם PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט) ומפורקים עם תמיסת טריפסין-EDTA. נטרול מגיב הדיסוציאציה מתבצע עם אמצעי תרבית שלם לתאי HCT116. עבור PrEC, תמיסת מלח עם חוצץ HEPES משמשת כתמיסת כביסה. טריפסין-EDTA משמש כמגיב דיסוציאציה. לנטרול מגיב הדיסוציאציה, השתמש בתמיסת נטרול טריפסין.
    3. בתוך מכסה המנוע, הסר את אמצעי התרבות מכלי תרבית התאים ושטוף בעדינות עם 3 מ"ל תמיסת כביסה, ולאחר מכן השלך את תמיסת הכביסה. חזור על שלב זה פעמיים.
    4. הוסף 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה בהתאם לקו התאים לשכבת התא החד-שכבתית ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. העריכו תאים כל 2 דקות עד להשלמת הדיסוציאציה.
    5. הוסף 2 מ"ל של תמיסת נטרול בהתאם לקו התאים והעביר את כל נפח תרחיף התא מצלחת תרבית התא לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל.
    6. לצורך מיצוי RNA, קח 500 מיקרוליטר מתרחיף התא והעביר אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הנח את הצינור על קרח והמשך לשלב 5.1 למיצוי RNA ו-RT-qPCR.
    7. צנטריפוגה את שאר תרחיף התא ב-120 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט.
    8. השעו מחדש את גלולת התא ב-2 מ"ל של מצע תרבית שלם והמשיכו לספירת תאים על פי נהלים סטנדרטיים.
    9. לקריוטיפ, תאי זרע בצפיפות של 1 x 104 תאים/ס"מ2 בצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ (שטח פנים של 9 ס"ממ"ר), דוגרים באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 באוויר למשך 24 שעות וממשיכים לקריוטיפ על פי נהלים סטנדרטיים.
    10. כדי להמשיך את ניסויי KD במעבר התאי הבא, תאי זרע לצפיפות של 1 x 104 תאים/סמ "ר בצלחת תרבית תאים חדשה בקוטר 100 מ"מ. מנה זו תהיה מעבר מספר 2 לניסוי. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה באמצעות 5% CO2 באוויר עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%.
      הערה: אם תרצה, ניתן להשתמש בתאים הנותרים למיצוי ו/או הקפאה של חלבון על פי נהלים סטנדרטיים.
    11. חזור על שלבים 3.1 עד 4.1.10 עבור טרנספקציה וקציר ממעבר 2 וממעבר 3.
  2. עקוב אחר הנוהל הבא לקצירת תאים עבור נקודות הביקורת של ניסויי KD בכלי תרבית 35 מ"מ.
    הערה: הקציר עבור המחסום הראשון בניסוי KD מתבצע יומיים לאחר הליכי הטרנספקציהה-2 וה-4.
    1. לחמם את כל המדיה ופתרונות הכביסה ל-37 מעלות צלזיוס. מחממים את מגיב הדיסוציאציה לטמפרטורת החדר. מחממים את תמיסת הנטרול של מגיב הדיסוציאציה לטמפרטורת החדר.
    2. בתוך מכסה המנוע, הסר את אמצעי התרבות מכלי תרבית התאים ושטוף בעדינות עם 0.5 מ"ל תמיסת כביסה ואז השליך את תמיסת הכביסה. חזור על שלב זה פעמיים.
    3. לאחר השלכת תמיסות הכביסה, הוסיפו 0.5 מ"ל של מגיב דיסוציאציה בהתאם לקו התאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות. הערך תאים כל 2 דקות עד להשלמת הדיסוציאציה.
    4. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת נטרול בהתאם לקו התאים והעביר את כל נפח תרחיף התא מצלחת תרבית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל והניח אותו על קרח.
    5. המשך לשלב 5.1 למיצוי RNA ו-qPCR.

5. מיצוי RNA ו-RT-PCR

  1. צנטריפוגה את מתלה התא ב-200 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. שטפו את גלולת התא עם 600 מיקרוליטר PBS קר (4 מעלות צלזיוס).
  2. צנטריפוגה את מתלה התא ב-200 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    השתמש בכדור התא למיצוי RNA על פי נהלים סטנדרטיים.
  3. המשך לטיפול DNase ב- RNA המטוהר על פי ההליך הסטנדרטי הנהוג במעבדה. בנקודת ההפסקה, אחסן RNA מטוהר ב-80 מעלות צלזיוס לתקופות ארוכות.
  4. השתמש ב-RNA לסינתזה סטנדרטית של cDNA עם כל דגימת RNA שהתקבלה. בנקודת ההפסקה, אחסן cDNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לתקופות ארוכות.
  5. בצע qPCR סטנדרטי לפי השלבים המתוארים להלן.
    1. עבור qPCR, אוליגונוקלאוטידים מגבירים את התעתיקים הבאים: lncRNA מעניין, MALAT1 וגן המתבטא באופן מכונן כבקרה פנימית (טבלה 1). עבור פרוטוקול זה, הביטוי RPS28 שימש כבקרה פנימית.
    2. בצע תגובות qPCR כדי להגביר את הבקרה הפנימית, ה-lncRNA המעניין ו-MALAT1 באמצעות cDNA מדגימת ASO-LacZ. דגימה זו תשמש לנורמליזציה של הביטוי מהדגימות האחרות.
    3. בצע תגובות qPCR כדי להגביר את הבקרה הפנימית RPS28 ואת ה-lncRNA המעניין באמצעות cDNA מדגימת ASO-lncRNA.
    4. בצע תגובות qPCR כדי להגביר את הבקרות הפנימיות RPS28 ו-MALAT1 באמצעות cDNA מדגימת ASO-MALAT1. עקוב אחר הגדרת התגובה ותנאי התרמו-ציקלר כמתואר בטבלה 2.
    5. נתח נתוני qPCR על ידי נורמליזציה של ΔΔCt של ביטוי התעתיק המעניין כנגד הבקרה הפנימית, ולאחר מכן, נרמל את הביטוי של תעתיק העניין (lncRNA או MALAT1) כנגד הביטוי של אותו תעתיק בדגימת ASO-LacZ כדי לקבל את רמת הביטוי היחסית של התמליל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, השימוש ב-ASOs הותאם ל-KD של lncRNA גרעיני למשך זמן ממושך בשורות התאים האנושיים PrEC ו-HCT116.

ללא ספק, ניסוי KD הצליח בקו התאים PrEC במשך 21 ימים של הניסוי, כפי שנצפה באיור 4. כדי לאשש קביעה זו, בנוסף לניתוח הביטוי בימי המעבר בין התאים (איור 4 A-C), ניתחנו את המחסומים שהוקמו בין מעברים 1 ו-2 ובין מעברים 2 ו-3; סה"כ 5 פעמים (איור 4-D). KD מוצלח של lncRNA-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שצוין קודם לכן, ל-lncRNAs יש פונקציות רגולטוריות מרכזיות בתא; לפיכך, חוסר ויסות של תעתיקים אלה עשוי להיות מעורב במחלות. סרטן היא מחלה כזו המאופיינת בחוסר ויסות lncRNA43,44. במחלה זו, ידוע כי lncRNAs ממלאים תפקידים רגולטוריים חשובים כמו אונקוגנים45 או מדכאי גידול46. חלקם מעורבים בהתפתחות סימני היכר של סרטן, והם יכולים לווסת, למשל, התפשטות47,48,49

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונטיאל-מנריקז, רוחליו הוא דוקטורנט מ-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) וקיבל מלגת CONACyT עם מספר CONACyT CVU: 581151.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל - צינורות חרוטיים 15 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק339650
קורנינג 100 מ"מ צלחת תרבית מטופלת TCקורנינג 430167שטח פנים: 55 ס"
מ קורנינג 35 מ"מ צלחת תרבית מטופלת TCקורנינג 430165 שטח פנים: 9 ס"מ
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermo Fisher Scientific14190144
סרום בקר עוברי (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 קו תאיםATCCCCL-247
HEPES, תמיסת חיץ 1MThermo Fisher Scientific15630122
טכנולוגיות DNA משולבות NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagentThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
תאי אפיתל ראשוניים אנושיים רגילים (HPrEC)ATCCPCS-440-010
פיצוץ נוקלאוטידים NCBI NANA https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM מדיה סרום מופחתתThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
ערמונית תא אפיתל בסיסיבינוני ATCCPCS-440-030
ערכת צמיחת תאי אפיתל ערמוניתATCCPCS-440-040
כלי מקוון להשלמה הפוכהNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANA http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
צינורות מיקרופוגה ללא RNase, 1.5 מ"לתרמו פישר מדעיAM12400
TrypLE אקספרס אנזים (1X), ללא פנול אדוםתרמו פישר מדעי12604013תמיסת טריפסין-EDTA
תמיסת נטרול טריפסיןATCCPCS-999-004
טריפסין-EDTA לתאים ראשונייםATCCPCS-999-003
UCSC דפדפן גנום, אנושי (GRCh38 / hg38)NANA https://genome.ucsc.edu/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832(2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119(2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501(2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377(2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693(2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019(2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , Humana Press. New York. (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56(2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608(2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9(2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

lncRNARNARNase HRNAcisPrECHCT116
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים