מאמר שיטה

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

DOI:

10.3791/65141

⸱

30 ביוני 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנבגים של Bacillus subtilis כבר הוצעו ליישומים ביוטכנולוגיים ואימונולוגיים שונים; עם זאת, יש צורך הולך וגובר בפיתוח מתודולוגיות המשפרות את הזיהוי של אנטיגנים משותקים על פני השטח של נבגים יחד עם כימות שלהם. ניתוחים מבוססי ציטומטריית זרימה הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לאיתור תאים מסומנים של B. subtilis. כאן אנו מציעים להשתמש בציטומטריית זרימה כדי להעריך את יעילות התצוגה של נוגדן פלואורסצנטי (FA) על פני הנבג ולכמת את מספר הנבגים באמצעות ספירת חרוזים.

לשם כך השתמשנו באתידיום ברומיד כסמן דנ"א ובנוגדן עם תווית אלופיקוציאנין (APC), שהוצמד לנבגים, כסמן פני השטח. כימות הנבגים בוצע באמצעות ספירת חרוזים, שכן טכניקה זו מדגימה דיוק גבוה בזיהוי תאים. הנבגים המסומנים נותחו באמצעות ציטומטר זרימה, שאישר את הצימוד. כתוצאה מכך, הוכח כי תיוג DNA שיפר את דיוק הכימות על ידי ציטומטריית זרימה, לזיהוי נבגים מונבטים. נצפה כי אתידיום ברומיד לא היה מסוגל לתייג נבגים רדומים; עם זאת, טכניקה זו מספקת קביעה מדויקת יותר של מספר הנבגים עם חלבון פלואורסצנטי המצומד לפני השטח שלהם, ובכך מסייעת בפיתוח מחקרים המתמקדים בשימוש בנבגים כפלטפורמה ביוטכנולוגית ביישומים שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus subtilis הוא חיידק גראם-חיובי בצורת מוט המסוגל לייצר נבגים שקטים כאשר תנאי הסביבה אינם מאפשרים צמיחת תאים1. נבגים הם צורות תאים יציבות ביותר ואלה של כמה מינים, כולל B. subtilis, נמצאים בשימוש נרחב כפרוביוטיקה לשימוש בני אדם ובעלי חיים2. בשל תכונות העמידות והבטיחות שלו, הנבג של B. subtilis, המציג חלבונים הטרולוגיים, הוצע כאדג'ובנט רירי, מערכת אספקת חיסונים, ופלטפורמת אימוביליזציה של אנזימים 3,4.

כדי להשיג נבגים מ B. subtilis, יש צורך לחשוף אותו למחסור תזונתי באמצעות מדיום תרבות מיוחד. לאחר השגת נבגים אלה וטיהורם, יש לכמת אותם כדי לשפר את יעילות הבדיקה 5,6. לפיכך, שיטות מסוימות מיושמות כדי לנתח את ריכוז הנבגים המתקבלים. ניתן להשתמש בספירת לוחות ובתא פטרוף-האוסר, הידוע גם בשם תא ספירה. האחרון פותח במקור כדי לקבוע את ריכוז תאי הדם; עם זאת, ניתן להשתמש בו בתחום המיקרוביולוגיה לספירת נבגים 7,8. למרות היותה השיטה הסטנדרטית המשמשת לספירת תאים, הקריאה מייגעת מכיוון ששיטה זו ידנית לחלוטין והדיוק שלה תלוי בניסיון של המפעיל.

ניתוחים מבוססי ציטומטריה של זרימה (FC) הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לזיהוי תאים מסומנים של Bacillus spp. השימוש בציטומטריית זרימה לספירת חרוזים הבטיח יכולת שחזור בספירת תאים בבדיקות שגרתיות (ספירה מוחלטת של לימפוציטים מסוג CD4 ו-CD8 T) ובפיתוח מחקר המערב חלקיקים המסוגלים לגילוי ולספירה באמצעות ציטומטריית זרימה9. גודג'פרי ואלשריף הציעו להשתמש בספירת חרוזים לכימות FC של נבגים לא מסומנים10. השימוש בציטומטריית זרימה תואר לניטור נבגים ב- Bacillus spp. באמצעות תיוג DNA של נבג 10,11,12,13. מחקר נוסף השתמש ב-FC כדי להעריך את כמות החלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג15.

מחקר זה ביקש להשתמש בחרוזי ספירה מסחריים כדי להבטיח סטנדרט של יכולת שחזור ביחס לספירת אירועים באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן, אנו מציעים להשתמש בספירת חרוזים לספירת תאים ב- FC כדי לחדד את ספירת הנבגים ולהעריך את יעילות הצימוד של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הגדרת ציטומטריית זרימה

  1. יישור פרמטרים אופטיים של ציטומטר זרימה המוצמד למחשב
    1. היכנס לתוכנת Cytometer.
    2. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | הפעלה והמתנה של מספר דקות | מצב נקי | שב נוזלים.
      הערה: בועות אוויר וחסימות הוסרו במהלך תהליך התחלת הציטומטר, לפני רכישת הדגימה.
  2. בקרת איכות
    1. השתמש בריאגנט בקרת האיכות כדי להתאים את המתחים של צינורות photomultiplier ולהעריך את רגישותם.
      1. הכן את מגיב בקרת האיכות בצינור פוליסטירן.
      2. להגדרת קו הבסיס, הכינו את חרוזי התלייה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדלל (PBS מסונן 10 מ"מ, pH 7) ו -3 טיפות חרוזים לצינור המסומן.
      3. מערבבים את בקבוקון החרוזים בהיפוך עדין.
    2. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | CST כדי להתחבר לממשק CST. המתינו מספר דקות ושימו לב שציטומטר ההודעה מנותק.
    3. חבר את צינור הפוליסטירן המכיל את מגיב בקרת האיכות לבדיקת ציטומטר הזרימה.
  3. אימות תצורת הציטומטר
    1. בחלון סיכום מערכת , בדוק שתצורת הציטומטר מתאימה לניסוי.
    2. בחר את מזהה אצווה חרוזי ההתקנה המתאים כדי לוודא שמזהה פריט חרוזי ההגדרה שנבחר תואם לכמות הנוכחית של חרוזי מחקר CS&T.
  4. בדיקת ביצועים
    1. בחר באפשרות בדוק ביצועים ולחץ על הפעל.
    2. עם השלמת בדיקת הביצועים, יוצגו תוצאות הביצועים. הצג את דוח ביצועי הציטומטר. לחץ על סיום כדי להשלים את בדיקת הביצועים או הסר את הציטומטר וסקור את התוצאות בחלון סיכום מערכת .
    3. שימו לב לתוצאה הסופית של ניתוח הרגישות המורפומטרית והפלואורסצנטית שתופיע ב | סיכום מערכת| תוצאת ביצועי ציטומטר| עם המצב: PASSED

2. הכנת הנבגים

  1. לאחר הנבגים, שטפו את הנבגים 3 פעמים במים קרים כקרח טהורים במיוחד על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 17,949 × גרם למשך 10 דקות.
  2. להשעות את הגלולה המתקבלת מן הצנטריפוגה האחרונה עם 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
  3. Autoclave את הנבגים במשך 45 דקות ב 121 מעלות צלזיוס עבור inactivation של תאים צמחיים.
    הערה: בדיקות קודמות שבוצעו על ידי הקבוצה שלנו שהשוו בין שיטות אינאקטיבציה שונות הראו כי התנאים שהוזכרו בשלב 2.3 הציגו יעילות גבוהה, והראו כי לא היווצרות מושבה בשיטת ניתוח הציפוי על מדיום אגר LB.

3. כימות של נבגים אוטוקלאביים באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. קחו 50 מיקרוליטר של נבגים אוטוקלאביים ודגרו עליהם מוגנים מפני אור עם אתידיום ברומיד (EtBr, 10 מ"ג/מ"ל מדולל במים) במקדם דילול של 0.05% v/v למשך 30 דקות (איור 1A).
  2. יש לשטוף את הנבגים 3x במי מלח חוצצי פוספט (PBS) אחד על ידי צנטריפוגה ב-17,949 × גרם למשך 10 דקות ולהשהות מחדש ב-1x PBS.
  3. מוסיפים 10 μL חרוזים, בהתאם להמלצות היצרן לדילול.
  4. נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה כמתואר בשלב 4.
    הערה: חשוב להדגיש כי החרוזים צריכים להיות pipeted הומוגני ככל האפשר מאז פערים נצפו בחישובים כאשר שלב זה לא בוצע היטב.

4. ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. היכנס לתוכנת Cytometer.
  2. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | מצב נקי | שב נוזלים.
  3. התאם לסביבת העבודה כדי לקבוע את הניתוח בציטומטריית זרימה.
    1. הגדירו את שערי הניתוחים (איור 2).
      1. הגדירו את אסטרטגיית הגאטינג בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של החלקיקים בהתבסס על הבקרה השלילית (נבגים לא מסומנים).
    2. לקביעת מורפומטריית תאים, בחר גרפיקת Dotplot לניתוח פרמטרי FSC-A בציר x ו- SSC-A בציר y.
    3. לקביעת פלואורסצנטיות, בחרו תרשימי FL3 Dotplot על ציר y באמצעות FL5 על ציר x וצרו את השערים בארבעה רבעים.
  4. השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 x 75 מ"מ המכילה דגימות ללא תווית, שסומנו בעבר עם EtBr בצבע יחיד, APC בצבע יחיד ו- EtBr+ APC צבעוני.
  5. מערבבים את הצינור בעדינות רבה המכיל את הבקרה השלילית ומחברים אותו לבדיקת ציטומטר הזרימה.
  6. לחץ על Acquire.
  7. הגדר את עוצמת הלייזרים על-ידי ניווט אל Cytometer | פרמטרים | FSC (375) ו- SSC (275).
  8. הגדר את הסף ל- (500) ציטומטר | סף.
  9. כדי להסיר autofluorescence, לנתח את הדגימה ללא צבע המכיל רק נבגים.
  10. התאם את המתחים עבור גלאי המסננים: FL3 (603) ו- FL5 (538) כדי להפלות אוכלוסיות שליליות וחיוביות ביחס לפלואורסצנטיות שנבחרה בבקרות. ציטומטר | פרמטרים.
  11. ציטומטר | פיצוי | הגדר את הסטת ההתקנה של FL5/FL3 ל - 1.0.
  12. לאחר ניתוח מורפומטריה ופלורסנט, הגדר את המכשיר לרכישת 30,000 אירועים | ניסוי | פריסת ניסוי | רכישה |30,000 אירועים....
  13. לאחר התאמת הפרמטרים, רכוש נתונים עבור הדגימות המסומנות ומכילות חרוזים בציטומטר הזרימה.
  14. חישוב ריכוז הנבגים כמתואר בהוראות היצרן באמצעות משוואה (1).
    figure-protocol-1(1)
    הערה: במחקר זה, שיטת כימות החרוזים הושוותה לניתוח תא הספירה של פטרוף-האוזר. בנוסף, התיוג של נבגים autoclaved הושווה לתיוג של נבגים שאינם autoclaved.

5. הערכת מדד צימוד החלבונים על משטח נבג באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. קציר על ידי צנטריפוגה של 50 μL של נבגים (103/μL) 17,949 × גרם במשך 10 דקות ולאחר מכן, resuspend עם 25 μL של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
  2. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 25 μL של N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) לתרחיף הנבג ודגור אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. שטפו את הנבגים 3x עם 1x PBS באמצעות צנטריפוגה כמתואר בשלב 5.1.
  5. מוסיפים חלבון פלואורסצנטי ומשאירים את הדגימות למשך הלילה ב-15°C (75 °F).
    הערה: החלבון הפלואורסצנטי ששימש בעבודה זו היה נוגדן IL-10 אנטי-אנושי שכותרתו APC. נוגדן זה שימש כמודל למחקר, אם כי יישום של מולקולות פלואורסצנטיות אחרות אפשרי מכיוון ש- EDC/NHS מקדם קשירה קוולנטית בין קבוצות -COOH ו- NH2 הקיימות בחלבונים על פני הנבג.
  6. יש לשטוף את הנבגים לפי שלב 5.3.
  7. הוסיפו 10 מ"ג/מ"ל של אתידיום ברומיד מדולל ב-1:50, ואז השאירו שעה אחת על קרח ומוגנים מפני אור (איור 1B).
  8. יש לשטוף את הנבגים לפי שלב 5.3.
  9. חזור על שלב 4.
  10. כדי לקבוע פלואורסצנטיות, שנה את הפרמטרים FL3 בציר X ו- FL5 בציר Y של dotplot.
  11. נתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה עם הלייזר הכחול (488 ננומטר) ב- FL3 (מסנן 670 LP) והלייזר האדום (633 ננומטר) ב- FL5 (מסנן 660/20), כמתואר בשלב 4.
    הערה: אותן דגימות נותחו עבור immunofluorescence על שקופיות תחת מיקרוסקופ, בטווח הגדלה של 1,000 x, ובאמצעות המסננים הבאים: FITC 480/30 nm (ירוק) ו- TRITC 540/25 nm (אדום).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדגימות נבגים אוטוקלאביים (AS), 2 × 103 נבגים/μl ו-1 × 103 נבגים/μl זוהו באמצעות ספירת חרוזים ושיטת Petroff-Hausser, בהתאמה (איור 2).

figure-results-1
איור 1: סכמה כללית לכימות נבגים. (A) נבגים המסומנים ב-EtBr ו-(B) נבגים בעלי תווית כפולה. קיצורים: EDC = 1-ethyl-3-(3-dim...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מסורתיות, כגון ספירת לוחות של מושבות, אינן רק גוזלות זמן, אלא גם זקוקות לתאים בני קיימא ואינן מאפשרות כימות של נבגים בלתי פעילים5. תא פטרוף-האוזר הוא מתודולוגיה חלופית, אך נדרש מיקרוסקופיסט מנוסה כדי לבצע אותה. ציטומטריית זרימה הוכחה כחלופה שימושית למטרה זו.

Genovese et al.12 תיארו את השימוש בציטומטריית זרימה לכימות תאים ונבגים בני קיימא של Bacillus sp. באמצעות שני סמנים של חומצות גרעין ויכולת בקרה גבוהה של קצב הזרימה (נפח / דקה) ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas עם משאבים מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). המחברים מודים לתוכנית לפיתוח טכנולוגי בכלים לבריאות PDTIS-FIOCRUZ על השימוש במתקניה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)Sigma130672
נוגדן פלואורסצנטי אנטי אנושיBioLegend501410APC אנטי-אנושי IL-10
נוגדן פלואורסצנטי נגד עכברThermo ScientificA32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSקנטו II  ציטומטר זרימה
BD FACSהגדרת ציטומטר דיווה & ערכת חרוזי מעקב (שימוש עם BD FACSDiva תוכנה v 6.x)BD642412בקרת איכות ריאגנט
BD FACSDiva תוכנה v. 6.1.3BD 643629 תוכנה
צנטריפוגה MegaFuge 8Rתרמו מדעי75007213
ספירת חרוזיםBD340334TruCount צינורות
Eclipse 80iניקוןפלואורסצנטי מיקרוסופ
אתידיום ברומידלודוויג ביוטק
פוספט חוצץמלח סיגמא-אולדריץ'A4503
מיקרו-צינורות פלסטיקאפנדורף
צינור פוליסטירןפלקון352008צינור פוליסטירן 5 מ"ל, 12 x 75 מ"מ, ללא מכסה, לא סטרילי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Bacillus Subtilis

מאמרים קשורים