Method Article

ניסוח ואפיון חומר ביו-אקטיבי המכיל ננודיסקים

DOI:

10.3791/65145

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים ייצור ואפיון של חומרים ביו-אקטיביים המכילים ננו-דיסקים. ננודיסקים של Amphotericin B נלקחים כדוגמה לתיאור הפרוטוקול בצורה מדורגת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המונח ננו-דיסק מתייחס לסוג בדיד של ננו-חלקיק המורכב מליפיד דו-שכבתי היוצר שומנים, חלבון פיגום וסוכן ביו-אקטיבי משולב. ננו-דיסקים מאורגנים כדו-שכבה ליפידית בצורת דיסק שהיקפו מוקף על ידי חלבון הפיגומים, בדרך כלל חבר במשפחת אפוליפופרוטאין הניתן להחלפה. חומרים ביו-אקטיביים הידרופוביים רבים נמסו ביעילות בננו-דיסקים על ידי שילובם בסביבה ההידרופובית של דו-שכבת השומנים של החלקיק, והניבו אוכלוסייה הומוגנית ברובה של חלקיקים בקוטר של 10-20 ננומטר. הניסוח של ננודיסקים דורש יחס מדויק של רכיבים בודדים, תוספת רציפה מתאימה של כל רכיב, ואחריו סוניקציה של תערובת הפורמולציה. חלבון הפיגום האמפיפתי בא במגע ספונטני ומארגן מחדש את תערובת השומנים/חומרים ביו-אקטיביים המפוזרים ויוצר אותם ליצירת אוכלוסייה בדידה והומוגנית של חלקיקי ננו-דיסק. במהלך תהליך זה, תערובת התגובה עוברת ממראה אטום ועכור לדגימה מזוקקת, שכאשר היא ממוטבת במלואה, אינה מניבה משקעים בצנטריפוגה. מחקרי אפיון כוללים קביעת יעילות מסיסות של חומרים ביו-אקטיביים, מיקרוסקופ אלקטרונים, כרומטוגרפיית סינון ג'ל, ספקטרוסקופיית ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV/Vis) ו/או ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. זה בדרך כלל ואחריו חקירה של פעילות ביולוגית באמצעות תאים בתרבית או עכברים. במקרה של ננודיסקים המכילים אנטיביוטיקה (כלומר, אנטיביוטיקה פוליאן מקרוליד אמפוטריצין B), ניתן למדוד את יכולתם לעכב צמיחה של שמרים או פטריות כפונקציה של ריכוז או זמן. קלות הניסוח היחסית, הרבגוניות ביחס לחלקי הרכיבים, גודל החלקיקים הננומטריים, היציבות הטבועה והמסיסות המימית מאפשרים יישומים רבים במבחנה ו-in vivo של טכנולוגיית ננו-דיסק . במאמר זה, אנו מתארים מתודולוגיה כללית לניסוח ואפיון ננודיסקים המכילים אמפוטריצין B כסוכן ביו-אקטיבי הידרופובי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ליפופרוטאינים דיסקואידים בצפיפות גבוהה (HDLs) הם אבות טבעיים של HDL כדורי הרבה יותר נפוץ הקיים במערכת הדם האנושית. חלקיקים חדשים אלה, המכונים גם pre-ß HDL, הם בעלי תכונות מבניות ייחודיות וייחודיות1. ואכן, במקום להתקיים כחלקיק כדורי, HDL מתהווה הוא בצורת דיסק. מחקרי אפיון מבניים נרחבים על HDL דיסקואידים טבעיים ומשוחזרים גילו כי הם מורכבים מדו-שכבה פוספוליפידית שהיקפה מוקפת על ידי אפוליפופרוטאין אמפיפתי הניתן להחלפה (apo), כגון apoA-I. במטבוליזם של ליפופרוטאינים אנושיים, HDLs מתהווים במחזור צוברים שומנים מתאים היקפיים ומבשילים ל-HDL כדוריים בתהליך התלוי במתווכי חלבונים מרכזיים, כולל מעביר קלטות קושר ATP A1 ולציטין:כולסטרול אצילטרנספראז

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טרנספורמציה, ביטוי וטיהור של רכיב חלבון פיגום

  1. טרנספורמציה חיידקית BL21 עם apoE4-NT המכיל פלסמיד
    1. הפשירו צינור של תאים מוכשרים BL21 (DE3) על קרח למשך 10 דקות.
    2. לאחר שכל הקרח נמס, ערבבו בעדינות ובזהירות פיפטה 50 μL של התאים לתוך צינור טרנספורמציה על קרח.
    3. הוסף 5 μL המכיל 50 ng של DNA פלסמיד (עבור רצף, ראה טבלה משלימה 1) לתערובת התא. בזהירות להעיף את הצינור ארבע או חמש פעמים כדי לערבב. אין לערבל.
    4. מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.
    5. מחממים את התערובת בדיוק ב-42°C למשך 10 שניות.
    6. מניחים על קרח למשך 5 דקות.
    7. פיפטה 950 μL של S.O.C. בינוני לתוך הצינור בטמפרטור....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך ניסוח ננודיסק סוכן ביו-אקטיבי
בהליך ניסוח ampB-nanodisk המתואר, התגובה נחשבת לשלמה כאשר מראה הדגימה משתנה מעכירות לצלולה (איור 1). שינוי זה מצביע על כך שננו-דיסקים נוצרו וכי הסוכן הביו-אקטיבי היה מסיס. לעתים קרובות, חומרים ביו-אקטיביים בולעים אור באזור אורך הגל הנראה (למשל, ampB, כורכומין, לוטאין, קואנזים Q10) ובמקרים אלה, הדגימה מאמצת את צבע החומר הביו-אקטיבי. לאחר השלמת בירור הדגימה (בדרך כלל 5-20 דקות של סוניקציה באמבטיה), הדגימה מועברת לצינור מיקרו-צנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסוח של חומר ביו-אקטיבי המכיל ננו-דיסקים מספק שיטה נוחה להמיס תרכובות הידרופוביות בלתי מסיסות אחרת. מאחר שהננו-דיסקים של הסוכן הביו-אקטיבי של המוצר מסיסים לחלוטין במדיה מימית, הם מספקים שיטת העברה שימושית למגוון רחב של מולקולות הידרופוביות (טבלה 1). אלה כוללים מולקולות קטנות, תרופות טבעיות וסינתטיות, פיטונוטריאנטים, הורמונים וכו '. אסטרטגיית הניסוח בדרך כלל עוקבת אחר פרוטוקול סטנדרטי שחייב לקחת בחשבון את תכונות המסיסות של הסוכן הביו-אקטיבי בממסים אורגניים. בנוסף לבחירת ממס אורגני מתאים להמסת החומר הביו-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R37 HL-64159).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אמפוטריצין Bקיימן כימיקלים חברה11636ND פורמולציה & תכשיר סטנדרטי
AmpicillinFisher ScientificBP17925Transformation & הרחבה
ApoE4-NT פלסמידGenScriptN/Aטרנספורמציה
בקבוק מבולבלניו ברונסוויק מדעיN/Aהרחבה & ביטוי
BL21 מוכשר E coliניו אינגלנד BiolabsC2527Iבקבוקי צנטריפוגה טרנספורמציה
Nalgene3140-0250ביטוי
כלורופורםפישר מדעיG607-4ניסוח ND
DMSOSigma Aldrich472301סטנדרטי Prepartation
DymyristoylphosphatidylcholineAvanti Lipids850345PND ניסוח
בקבוק Erlenmeyer BellcoBiotechnologyN/Aהרחבה &
שפופרות בזSarstedt Ag & CoD51588בדיקת כדאיות שמרים
צינורות בורוסיליקט מזכוכיתVWR47729-570ND ניסוח
GraphPad (תוכנה)DotmaticsN/Aבדיקת כדאיות שמרים
אמבט סוניקציה מחומםVWRN / AND
מודול חימום וחנקןFormulaton Thermo ScientificTS-18822ND ניסוח
HiTrap הפרין HP (5 מ"ל)GE Healthcare17-0407-03טיהור
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside פישר סיינטיפיקBP1755ביטוי
J-25 צנטריפוגהבקמן קולטרJ325-IM-2ביטוי
JA-14 רוטורבקמן קולטר339247ביטוי
ליופילייזרLabconco7755030ניסוח ND
מתנולפישר סיינטיפיקA452-4ND ניסוח
גז חנקןPraxairUN1066ND ניסוח
NZCYM מדיהRPI מוצרי מחקרN7200-1000.0הרחבה & ביטוי
Pet-22B וקטורGenScriptN/Aטרנספורמציה
צלחת פטריפישר FB0875718 מדעיטרנספורמציה & הרחבת
קוורץ קובטספישר מותג14385 928Aניתוח ספקטרלי
טלטול חממהניו ברונסוויק סיינטיפיקM1344-0004טרנספורמציה, הרחבה & ביטוי
Slide-A-Lyzer מצופיםThermo Scientific66430טיהור
SnakeSkin צינורות דיאליזהThermo Scientific68100טיהור
SnakeSkin צינורות דיאליזהThermo Scientific88243טיהור
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271טיהור
נתרן פוספט דו-בסיסיפישר סיינטיפיקS374-500טיהור
נתרן פוספט מונו-בסיסיפישר סיינטיפיקBP329-500טיהור
ספקטרום/POR סגירות משוקללותספקטרום תעשיות רפואיות132736
טיהור ספקטרופוטומטרShimadzu UV-1800220-92961-01ניתוח ספקטרלי
צנטריפוגה שולחניתבקמן קולטר366816ניסוח ND
UVProbe 2.61 (תוכנה)ShimadzuN/Aניתוח ספקטרלי
מסנן ואקוםMillipore9004-70-0ביטוי &
משאבת ואקוםGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAביטוי & Purification
VortexFisher Scientific12-812ND פורמולציה
שמריםN/ABY4741בדיקת כדאיות שמרים
תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוזBD242820בדיקת כדאיות שמרים
ביטוי טיהור

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanodisk FormulationBioactive NanodisksAmphotericin B NanodisksScaffold ProteinLipid Bilayer NanoparticlesDrug Delivery NanodisksUV Visible SpectroscopyDialysis TubingYeast Growth InhibitionHydrophobic Bioactive Agents

Related Articles