הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת מכשיר למניעת שינה בעכברים

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65157

⸱

22 בספטמבר 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטה להקמת מכשיר חסכוני מבוסס פלטפורמת נדנדה המשמש לגרימת חסך שינה בעכברים. מכשיר זה הוכח כיעיל בגרימת שיבושים בדפוסי השינה המוכחים באלקטרואנצפלוגרם (EEG), כמו גם בגרימת שינויים מטבוליים ומולקולריים הקשורים למחסור בשינה.

תקציר

הפרעה בשעון הביולוגי מתייחסת לחוסר סנכרון בין הסביבה או ההתנהגות החיצונית לבין השעון המולקולרי האנדוגני, אשר פוגע באופן משמעותי בבריאות. מחסור בשינה הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר להפרעה בשעון הביולוגי. שיטות שונות (למשל, פלטפורמות על המים, טיפול עדין, תאי מוטות הזזה, תופים מסתובבים, שייקרים מסלוליים וכו ') דווחו כגורמים לחוסר שינה בעכברים כדי לחקור את השפעותיו על הבריאות. המחקר הנוכחי מציג שיטה חלופית למחסור בשינה בעכברים. תוכנן מכשיר אוטומטי מבוסס פלטפורמת נדנדה שהוא חסכוני ומשבש ביעילות את השינה בעכברים השוכנים בקבוצה בפרקי זמן מתכווננים. מכשיר זה גורם לשינויים אופייניים של חסך שינה עם תגובת לחץ מינימלית. כתוצאה מכך, שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור חוקרים המעוניינים לחקור את ההשפעות ואת המנגנונים הבסיסיים של מניעת שינה על הפתוגנזה של מחלות מרובות. יתר על כן, הוא מציע פתרון חסכוני, במיוחד כאשר נדרשים מכשירים מרובים למניעת שינה לפעול במקביל.

מבוא

הפרעה בשעון הביולוגי מתייחסת לדה-סנכרון בין הסביבה או ההתנהגות החיצונית לבין השעון הביולוגי האנדוגני. אחד הגורמים השכיחים ביותר להפרעה בשעון הביולוגי הוא חסך שינה1. מחסור בשינה לא רק משפיע לרעה על בריאות האדם, אלא גם מגדיל באופן משמעותי את הסיכון למחלות רבות, כולל סרטן2 ומחלות לב וכלי דם3. עם זאת, המנגנונים העומדים בבסיס ההשפעות המזיקות של מניעת שינה עדיין אינם ידועים במידה רבה, והקמת מודלים של מניעת שינה חיונית כדי לשפר את הבנתנו בהקשר זה.

דווח על שיטות שונות למניעת שינה בעכברים, כגון שימוש בפלטפורמות מים4, טיפול עדין5, תאי מוטות הזזה6, תופים מסתובבים7 ופרוטוקולי תסיסה בכלוב 5,8,9. תאי מוטות הזזה גורפים אוטומטית סורגים את תחתית הכלוב, ומאלצים את העכברים ללכת מעליהם ולהישאר ערים. פרוטוקולי תסיסה בכלובים כוללים הצבת כלובים על מטלטלים מסלוליים במעבדה, וכתוצאה מכך הפרעות שינה יעילות. בעוד שיטות אלה הן אוטומטיות ויעילות, הן יכולות להיות יקרות כאשר מכשירים מרובים נדרשים לפעול במקביל, במיוחד עבור עיצובי מחקר ספציפיים הכוללים מספר רב של עכברים חסרי שינה הדרושים לפרופיל גנים צירקדיים. מצד שני, פלטפורמות מים ופרוטוקולי טיפול עדינים הם שיטות זולות ופשוטות יותר המשמשות בדרך כלל לגרימת חסך שינה. עם זאת, אסדת המים אינה מאפשרת בקרה אוטומטית של מחזורי מנוחה-חסך שנקבעו מראש 10,11, וטיפול עדין דורש ערנות מתמשכת מצד החוקרים כדי להפריע לשינה. בנוסף, שיטות אחרות, כמו תופים מסתובבים, יכולות להתבלבל על ידי בידוד חברתי או מתח12.

בהשראת השיטה המבוססת על שייקר מסלולי, אנו שואפים להציג פרוטוקול להקמת מכשיר מבוסס פלטפורמת נדנדה למניעת שינה בעכברים. שיטה זו זולה, יעילה, מלחיצה באופן מינימלי, ניתנת לשליטה ואוטומטית. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר לנו ליצור מכשיר מבוסס פלטפורמת נדנדה בעלות זולה בערך פי עשרה מזו של מטלטלים מסלוליים, בהתבסס על הנגישות שלנו. מכשיר זה שיבש ביעילות את השינה בעכברים ששוכנו בקבוצה וגרם לשינויים אופייניים של חסך שינה עם תגובת דחק מינימלית. זה יהיה שימושי במיוחד עבור חוקרים המעוניינים לחקור את ההשפעות ואת המנגנונים הבסיסיים של מניעת שינה על הפתוגנזה של מחלות מרובות, במיוחד כאשר המחקר כולל מניעת שינה מרובת קבוצות במקביל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי הניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי. עכברי C57BL/6J זכרים, בגילאי 8 עד 10 שבועות, שימשו במחקר. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). החלקים העיקריים הדרושים להקמת המכשיר מפורטים באיור 1A.

1. הכנת המכשיר למניעת שינה

  1. אבטח קצה אחד של תעלת פלדה מחורצת בקוטר 50 ס"מ באמצע תעלת פלדה מחורצת בקוטר 40 ס"מ באמצעות ברגים (ראה טבלת חומרים) ליצירת מבנה בצורת T; חזרו על התהליך וצרו שני מבנים כאלה בצורת T (איור 1B-a).
  2. גרמו לשני המבנים בצורת T לעמוד כלפי מעלה במקביל במרחק של 30 ס"מ זה מזה, וחברו את התחתונים של שני המבנים בצורת T עם גליל פלדה תואם בורג בקוטר 30 ס"מ (ראו טבלת חומרים) באמצעות ברגים (איור 1B-b).
  3. הניחו משטח מלבן פלדה (20 × 25 ס"מ) (ראו טבלת חומרים) בין שני המבנים בצורת T (איור 1B-c).
    הערה: אם פלטפורמות מלבן פלדה מוכנות לשימוש בגודל שצוין אינן זמינות, ניתן ליצור אחת על ידי ריתוך פלדות שטוחות בעובי 2 מ"מ.
  4. אבטחו כל קצה של גליל פלדה תואם בורג בקוטר 30 ס"מ המחובר בפלטפורמה לשני מיסבים קבועים על כל אחד מהמבנים בצורת T במרחק של 10 ס"מ למטה מהחלק העליון (איור 1B-d).
  5. הדקו תושבת מנוע (ראו טבלת חומרים) על אחד המבנים בצורת T בגובה 25 ס"מ למטה מהחלק העליון באמצעות ברגים (איור 1B-e).
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בדבק בנייה כדי לאבטח את תושבת המנוע על המבנה בצורת T במקום צוותים.
  6. התקינו מנוע (ראו טבלת חומרים) על תושבת המנוע עם ברגים (איור 1B-f).
  7. אבטחו מאוורר קירור (ראו טבלת חומרים) עם רצועות נעילה עצמית במבנה בצורת T מתחת למנוע (איור 1B-g).
  8. קבע את קצה המסב של מוט חיבור לפינת פלטפורמה הפונה למנוע באמצעות ברגים (איור 1B-h).
  9. קבע קצה נוסף של מוט החיבור למוט המנוע באמצעות ברגים (איור 1B-i).
  10. קדחו שני חורים בקוטר 4 מ"מ בכל אחת מארבע הפינות של מכל פלסטיק או כלוב חיות סטנדרטי (ראו טבלת חומרים) באמצעות מקדחה חשמלית, וקדחו שני חורים בקוטר 4 מ"מ וחור תחתון בקוטר 6 מ"מ בצד שמאל של הכלוב (איור 1B-j).
  11. אבטחו את הכלוב על משטח המלבן באמצעות רצועות נעילה עצמית דרך חורי הפינה (איור 1B-k).
  12. קדח חור 5 מ"מ במכסה של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מקדחה חשמלית, וחבר את החור עם זרבובית ארוכה המצוידת בשסתום כדורי למניעת דליפת מים.
    הערה: הידרוג'ל יהיה אופציה חלופית לאספקת מים אם קשה להתאים אישית בקבוקי מים.
  13. אבטחו את בקבוק המים המותאם אישית בצד שמאל של הכלוב באמצעות רצועות נעילה עצמית דרך שני חורים בקוטר 4 מ"מ, כאשר הזרבובית עוברת דרך חור ה-6 מ"מ (איור 1B-l).
  14. חברו את חוטי החשמל היוצאים של מתאם לבני החשמל לשני הדקים של המנוע (איור 1B-l).
    הערה: אין דרישת קוטביות ספציפית לחיבור החוטים להדקי המנוע.
  15. חברו את חוטי החשמל של מתאם לבני החשמל למגע הזמן (איור 1B-m).

2. אינדוקציה של מניעת שינה

  1. לחצו על לחצני סימן הפלוס הימני ביותר בחצי השמאלי והימני של מגע הזמן (ראו טבלת חומרים), בהתאמה, עד שיופיע האות M על הדלפקים המכניים משני הצדדים (איור 1C-a).
  2. לחצו על כפתורי סימן הפלוס האמצעיים בחצי השמאלי והימני של מגע הזמן עד שיופיע "5M" על הדלפקים המכניים משני הצדדים (איור 1C-b).
  3. לחץ על לחצן סימן הפלוס השמאלי ביותר בחצי השמאלי של מגע הזמן עד שיופיע "15M" על המונה המכני השמאלי (איור 1C-c).
    הערה: לאחר מכן מגע הזמן יהיה מופעל למשך 15 דקות וכבוי למשך 5 דקות במצב מחזורי.
  4. הכניסו עכברים לכלוב עם מים ומזון עד ליביטום.
  5. ספק חשמל למגע הזמן ולמאוורר הקירור.
    הערה: הפלטפורמה תתנדנד כעת ב-10 סל"ד.
  6. שקול כל עכבר בזמן Zeitgeber 0 (ZT0) בכל יום.
    הערה: האור דולק מ-8 בבוקר (ZT0) עד 20:00 בערב (ZT12).

3. בדיקת סובלנות גלוקוז דרך הפה

  1. מדדו את רמות הגלוקוז בצום בעכברים בצום על ידי דגימת דם מוורידי הזנב.
  2. הזריקו תמיסת גלוקוז לכל עכבר (2 גרם/ק"ג משקל גוף) תוך צפקית באמצעות מזרקים של 1 מ"ל.
  3. לאסוף דגימות דם דרך וריד הזנב, ולבדוק את רמת הגלוקוז בדם ב 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, ו 120 דקות לאחר הזרקת גלוקוז, בהתאמה.
  4. החזירו את העכברים לכלוב עם המזון והמים לאחר הבדיקה.

4. קצירת רקמות המוח

  1. ערפו את ראשיהם של העכברים לאחר הרדמה מספקת על ידי חשיפתם לאיזופלורן (2%) למשך 3-5 דקות.
  2. חשוף את הגולגולת ובצע חתך אנכי של 1 ס"מ בגולגולת באמצעות מספריים כירורגיים.
  3. הסר את הגולגולת באמצעות המוסטטים של יתושים (ראה טבלת חומרים) כדי לחשוף את רקמת המוח.
  4. הוציאו בעדינות את כל המוח מחלל הגולגולת באמצעות פינצטה מעוקלת.
    הערה: יש להסיר רקמת מוח בהתאם למדיניות המקומית.
  5. שטפו את רקמת המוח באמצעות מלח חוצץ פוספט קר (1x PBS, 4 °C).
  6. הצמד להקפיא את רקמת המוח השלמה בחנקן נוזלי ולהעביר את הרקמה ל -80 ° C לאחסון לטווח ארוך .
    הערה: כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C, רקמת המוח שהוקפאה במהירות הבזק יציבה למשך 6 חודשים לפחות.

5. זיהוי ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

  1. הפשירו את רקמות המוח בטמפרטורה של 4°C צלזיוס או על קרח.
  2. מעבירים את הרקמה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ומחלצים את סך הרנ"א בשיטה13 המבוססת על TRIzol.
  3. למדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר (ראו טבלת חומרים) לאחר מיצוי הרנ"א.
  4. בצע שעתוק לאחור של סך כל הרנ"א (1 מיקרוגרם) לדנ"א משלים (cDNA) באמצעות ערכה מסחרית14.
  5. מדידת רמות ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור בזמן אמת15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המכשיר שנקבע למניעת שינה בעכברים מוצג באיור 1D. ביום השביעי לאחר תחילת החסך בשינה, ניטור אלקטרואנצפלוגרם (EEG) ואלקטרומיוגרפיה (EMG)16 הצביע על כך שהמכשיר הפחית באופן משמעותי את משך השינה והגדיל את משך הערות בעכברים (איור 2A-D). בינתיים, הפרוטוקול הנוכחי הגביר באופן משמעותי את הצטברות האדנוזין ואת רמות ה-mRNA של Homer1a במוח (איור 2E,F), שהם סמנים של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודלים עכבריים של חסך שינה חיוניים לחקר ההשפעות של הפרעות שינה על מחלות שונות, כולל מחלות לב וכלי דם21, מצבים פסיכיאטריים22 והפרעות נוירולוגיות23. מבין אסטרטגיות מניעת השינה הקיימות בעכברים, גישות פיזיות הכוללות הפרעות חוזרות ונשנות לטווח קצר של שינה הןהנפוצות ביותר 5,7,12. גישות פיזיקליות אלה כוללות שימוש בפלטפורמות מים4, טיפול עדין<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82230014, 81930007, 82270342), תוכנית המנהיגים האקדמיים המצטיינים של שנחאי (18XD1402400), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), תוכנית הכישרונות של שנחאי פוג'יאנג (2020PJD030), SHWSRS (2023-62), מרכז המחקר הקליני של שנגחאי להזדקנות ורפואה (19MC1910500), ותוכנית חדשנות לתואר שני של המכללה הרפואית בנגבו (Byycxz21075).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה צינורAxygenMCT-150-C-S
50 מ"ל צינור צנטריפוגהNEST602002
אדנוזין ELISA ערכתRuifan טכנולוגיהRF8885
כלוב בעלי חייםZeYa techMJ2
מד גלוקוז בדםYuYue580
C57BL/6J עכבריםJieSiJie מעבדה חיותגיל: 8-10 שבועות
מוט חיבורShengXiang TechN/Aאורך:  20 ס"מ
מאווררקירור LiMingEFB0805VHמתח אספקה: 5 וולט; צריכת חשמל: 1.2 וואט; זרימת אוויר: 26.92 cfm; מידות: 40 מ"מ * 40 מ"מ * 56 מ"מ
ערכת קורטיקוסטרון ELISAElabscienceE-OSEL-M0001
מערכת הקלטה וניתוח EEG / EMGPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
המוסטטים נגד יתושיםFST13011-12מכשיר כירורגי
תושבת מנוע ומנועMingYangMY36GP-555מתח אספקה: 24 וולט DC; קוטר פיר: 8 מ"מ; מומנט פלט מרבי: 100 Kgf.cm; מהירות פלט מקסימלית: 10 סל"ד
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
מתאם לבנים מתח מתחכניסה: 110-220V ac; מתח יציאה: 24 וולט DC; זרם יציאה: 2 A; אורך הכבל: ערכה מסחרית 2 מ'
qPCRVazymeQ711-02
qPCR ציוד מדידהRoche480
פלטפורמת מלבן מחוברת עם גליל פלדה תואם בורגמותאם אישיתN/Aרוחב: 20 ס"מ; אורך: 25 ס"מ; אורך הגליל: 30 ס"מ, עובי: 2 מ"מ
RNA הפוך לערכה מסחרית cDNAVazymeR323-01
בורג ואוםGuwanjiN / Aקוטר פנימי: 6 מ"מ, 12 מ"מ
גליל פלדה תואם בורגמותאם אישיתN/Aאורך: 300 מ"מ
תעלות פלדה מחורצותמותאם אישיתN/Aאורך: 400 מ"מ או 500 מ"מ, עובי: 2 מ"מ
מגע זמןLiXiangDH48S-Sמתח אספקה: 110-220 וולט AC; יחידות שנמדדו: שעות, דקות, שניות; תצורת איש קשר: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

מקורות

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292(2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90(2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35(2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559(2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430(2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017(2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

EEGEMG
הקמת מכשיר למניעת שינה בעכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.