Method Article

אוטומציה של עיבוד Citrus Budwood לזיהוי פתוגנים במורד הזרם באמצעות הנדסת מכשירים

DOI:

10.3791/65159

⸱

April 21st, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

* These authors contributed equally

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסנו, יצרנו ותיקפנו מכשיר שמעבד במהירות רקמות עץ הדר עשירות בקליפת עץ הדר. בהשוואה לשיטות הנוכחיות, מחלץ רקמות Budwood (BTE) הגדיל את תפוקת הדגימה והפחית את עלויות העבודה והציוד הנדרשות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים של פרי הדר כגון וירוסים, וירואידים וחיידקים, המועברים על ידי שתלים, אחראים למגיפות הרסניות ולהפסדים כלכליים חמורים ברחבי העולם. לדוגמה, נגיף טריסטזה הדרים הרג מעל 100 מיליון עצי הדר ברחבי העולם, בעוד "Candidatus Liberibacter asiaticus" עלה לפלורידה 9 מיליארד דולר. השימוש בעצי הדר שנבדקו בפתוגן לריבוי עצים הוא המפתח לניהול פתוגנים כאלה. התוכנית להגנה על שבטי הדרים (CCPP) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, משתמשת במבחני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לבדוק אלפי דגימות מעצי מקור של עצי הדר מדי שנה כדי להגן על פרי ההדר של קליפורניה ולספק יחידות ריבוי נקיות לרשת הלאומית לצמחים נקיים. צוואר בקבוק חמור בזיהוי מולקולרי בתפוקה גבוהה של נגיפי הדר ווירואידים הוא שלב עיבוד רקמות הצמח.

הכנת רקמות נכונה היא קריטית למיצוי חומצות גרעין איכותיות ולשימוש במורד הזרם בבדיקות PCR. קיצוץ רקמות צמחים, שקילה, ייבוש בהקפאה, טחינה וצנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע פירוק חומצות גרעין גוזל זמן רב ודורש ציוד מעבדה יקר ומיוחד. מאמר זה מציג את האימות של מכשיר מיוחד שהונדס לעיבוד מהיר של רקמות קליפה עשירות בפלואם מעצי הדר, הנקרא מחלץ רקמות בודווד (BTE). ה- BTE מגדיל את תפוקת הדגימה ב- 100% בהשוואה לשיטות הנוכחיות. בנוסף, זה מקטין את העבודה ואת עלות הציוד. בעבודה זו, לדגימות BTE הייתה תפוקת דנ"א (80.25 ננוגרם/μL) שהייתה דומה לפרוטוקול החיתוך הידני של CCPP (77.84 ננוגרם/μL). מכשיר זה ופרוטוקול עיבוד רקמות הצמח המהיר יכולים להועיל למספר מעבדות ותוכניות אבחון הדרים בקליפורניה ולהפוך למערכת מודל לעיבוד רקמות עבור גידולים רב-שנתיים עציים אחרים ברחבי העולם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים מוגבלים בפלואם של הדרים, כגון וירואידים, וירוסים וחיידקים, גרמו למגיפות הרסניות ולהפסדים כלכליים חמורים בכל אזור ייצור הדרים בעולם. וירואידים מפירות הדר מגבילים גורמי ייצור בגלל האקסוקורטיס ומחלות הקכקסיה שהם גורמים בסוגי הדרים חשובים מבחינה כלכלית, כגון טריפוליאט, כלאיים טריפוליאטים, מנדרינים, קלמנטינות ומנדרינות 1,2,3. בקליפורניה, סוגי הדרים רגישים לוירואידים אלה הם הבסיס לשוק הצומח והרווחי של "קולפים קלים", בעקבות המגמה המשתנה בהעדפת הצרכנים לפירות קלים לקילוף, מפולחים ונטולי זרעים 4,5,6. לפיכך, וירואידים הדרים מוסדרים תחת מחלקת המזון והחקלאות של קליפורניה (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Clean Program-Senate Bill 140", והמעבדות של אגף אבחון מזיקים צמחיים של CDFA מבצעות אלפי בדיקות וירואידים של הדרים בשנה 7,8,9,10 . נגיף ההדר טריסטזה (CTV) אחראי למותם של למעלה מ -100 מיליון עצי הדר מאז תחילת המגיפה העולמית בשנות השלושים 3,9,10,11. בקליפורניה, פיטינג גזע ועמידות לשבירת טריפוליאט של הנגיף מהווים איום רציני על תעשיית ההדרים בקליפורניה שמגלגלת 3.6 מיליארד דולר. כתוצאה מכך, CDFA מסווג CTV כמזיק צמחי מוסדר מסוג A, והמעבדה של הסוכנות למיגור טריסטזה במרכז קליפורניה (CCTEA) מבצעת סקרי שדה נרחבים ואלפי בדיקות וירוסים מדי שנה15,16. על פי הערכות, החיידק "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) ומחלת הואנגלונגבינג (HLB) גרמו לנזק כלכלי של קרוב ל-9 מיליארד דולר לפלורידה כתוצאה מירידה של 40% בשטחי ההדרים, ירידה של 57% בפעילות ההדרים ואובדן של כמעט 8,000 מקומות עבודה17,18. בקליפורניה, הפחתה היפותטית של 20% בשטחי ההדרים עקב HLB הייתה צפויה לגרום לאובדן של יותר מ-8,200 מקומות עבודה ולהפחתה של יותר מחצי מיליארד דולר בתוצר המקומי הגולמי של המדינה. לכן, התוכנית למניעת מזיקים ומחלות הדרים מוציאה מעל 40 מיליון דולר בשנה על סקרים לבדיקה, זיהוי ומיגור CLas מקליפורניה14,17,19,20.

מרכיב מרכזי בניהול וירואידים הדרים, וירוסים וחיידקים הוא השימוש בחומרי ריבוי שנבדקו על ידי פתוגן (כלומר, עצי ניצן) לייצור עצים. עצי הדר שנבדקו בפתוגן מיוצרים ומתוחזקים במסגרת תוכניות הסגר מקיפות המשתמשות בטכניקות מתקדמות לסילוק וזיהוי פתוגנים10,21. התוכנית להגנת שבטי הדרים (CCPP) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, בודקת אלפי דגימות של עצי ניצן מדי שנה מזני הדרים שיובאו לאחרונה למדינה ולארה"ב, כמו גם עצי מקור של עצי הדר, כדי להגן על פרי ההדר של קליפורניה ולתמוך בפונקציות של רשת הצמחים הנקיים הלאומית להדרים10,17,22. כדי להתמודד עם הנפח הגדול של בדיקות הדרים, בדיקות זיהוי פתוגנים בעלות תפוקה גבוהה, אמינות וחסכוניות הן מרכיב בסיסי להצלחתן של תוכניות כגון CCPP 7,10,22.

בעוד שמבחני זיהוי פתוגנים מבוססי מולקולרית כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) אפשרו עלייה משמעותית בתפוקה במעבדות אבחון צמחיות, מניסיוננו, אחד מצווארי הבקבוק הקריטיים ביותר ביישום פרוטוקולים בעלי תפוקה גבוהה הוא שלב עיבוד דגימות רקמת הצמח. זה נכון במיוחד עבור הדרים מכיוון שהפרוטוקולים הזמינים כיום לעיבוד רקמות עשירות בפלואם כגון פטיולים של עלים וקליפת עץ ניצן הם עתירי עבודה, גוזלים זמן רב ודורשים ציוד מעבדה יקר ומיוחד. פרוטוקולים אלה דורשים קיצוץ ידני, שקילה, ייבוש בהקפאה, טחינה וצנטריפוגה בטמפרטורות נמוכות כדי למנוע התפרקות חומצות גרעין 8,23,24. לדוגמה, במעבדת האבחון CCPP, עיבוד הדגימות כולל (i) חיתוך ידני (6-9 דגימות/h/מפעיל), (ii) ייבוש בהקפאה (16-24 שעות), (iii) כתישה (30-60 שניות) ו-(iv) צנטריפוגה (1-2 שעות). התהליך דורש גם אספקה מיוחדת (למשל, צינורות כבדים לנעילת כספות, כדורי טחינה מנירוסטה, מתאמים, להבים, כפפות) וחלקים מרובים של ציוד מעבדה יקר (למשל, מקפיא נמוך במיוחד, מייבש בהקפאה, כתישת רקמות, הקפאת חנקן נוזלי, צנטריפוגה בקירור).

כמו בכל ענף, הנדסת ציוד ואוטומציה של תהליכים הם המפתח להוזלת עלויות, הגדלת התפוקה ואספקת מוצרים ושירותים איכותיים ואחידים. תעשיית ההדרים זקוקה למכשירים זולים לעיבוד רקמות הדורשים מיומנות מינימלית להפעלה, וככאלה, קל להעביר אותם למעבדות אבחון ותפעול בשטח כדי לאפשר יכולת עיבוד דגימה גבוהה לזיהוי פתוגן מהיר במורד הזרם. Technology Evolving Solutions (TES) וה-CCPP פיתחו (כלומר, תכננו וייצרו) ותיקפו (כלומר, נבדקו עם דגימות הדרים והושוו לנוהלי מעבדה סטנדרטיים) מכשיר בעלות נמוכה (כלומר, ביטלו את הצורך בציוד מעבדה מיוחד) לעיבוד מהיר של רקמות הדרים עשירות בפלואם (כלומר, Budwood), בשם Budwood Tissue Extractor (BTE). כפי שניתן לראות באיור 1, ה-BTE כולל רכיב בסיס להספק ולפקדים, בתוספת תא נשלף לעיבוד עצי הדר. תא ה-BTE מורכב מגלגל השחזה שתוכנן במיוחד כדי להסיר את רקמות הקליפה העשירות בפלואם מעץ ההדר. רקמת הקליפה הגרוסה נפלטת במהירות דרך פתח החלקה לתוך מזרק המכיל חיץ מיצוי, מסוננת ומוכנה למיצוי וטיהור חומצות גרעין ללא כל טיפול או הכנה נוספים (איור 1). מערכת BTE כוללת גם אפליקציה למעקב אחר דגימות ללא נייר ואפליקציית שקילה משולבת, המתעדות את עיבוד הדגימה במסד נתונים מקוון בזמן אמת.

מערכת BTE הגדילה את יכולת אבחון המעבדה של CCPP ביותר מ-100% וייצרה באופן עקבי תמציות רקמת הדרים המתאימות לטיהור חומצות גרעין באיכות גבוהה ולזיהוי במורד הזרם של פתוגנים הניתנים להעברה בשתלים של הדרים באמצעות בדיקות PCR. באופן ספציפי יותר, BTE צמצם את זמן עיבוד הרקמה מיותר מ-24 שעות ל~3 דקות לדגימה, החליף מכשירי מעבדה שעלותם מעל 60,000 דולר (איור 2, שלבים 2-4), ואיפשר עיבוד של דגימות גדולות יותר.

מאמר זה מציג את נתוני עיבוד רקמת קליפת ההדר BTE בתפוקה גבוהה, מיצוי חומצות גרעין ואימות זיהוי פתוגנים עם דגימות עצי הדר מעצי מקור, כולל כל הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות ממתקן ההסגר CCPP Rubidoux ומתקן קרן לינדקוב, בהתאמה. אנו מציגים גם את השינויים בתפוקה ובזמן העיבוד בהשוואה לנוהל המעבדה הנוכחי (איור 2). בנוסף, עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב עבור מעבדות לבדיקת פתוגן הדרים ומדגימה כיצד BTE יכול לתמוך בפונקציות של מלאי משתלה נקי מפתוגנים, סקר ותוכניות מיגור.

figure-introduction-1
איור 1: מחלץ רקמות Budwood. ה- BTE כולל רכיב בסיס להספק ובקרות, בתוספת תא נשלף לעיבוד עץ ניצן הדרים. תא ה-BTE מורכב מגלגל השחזה שתוכנן במיוחד כדי להסיר את רקמות הקליפה העשירות בפלואם מניצני הדרים. רקמת הקליפה הגרוסה נפלטת במהירות דרך פתח החלקה לתוך מזרק, מסוננת ומוכנה למיצוי וטיהור חומצות גרעין ללא כל טיפול או הכנה נוספים. קיצור: BTE = מחלץ רקמת ניצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-introduction-2
איור 2: השוואה שלב אחר שלב בין הליך המעבדה הקונבנציונלי לחיתוך ידני לבין עיבוד BTE. עיבוד BTE כולל עיבוד רקמת קליפת הדרים בתפוקה גבוהה, מיצוי חומצות גרעין וזיהוי פתוגנים. הזמן עבור כל שלב מצוין בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף דגימות ניצני הדרים למשלוח

  1. שלח ל- Technology Evolving Solutions גיליון אלקטרוני של מידע על עצים כדי שהם יוכלו לטעון לשרת האינטרנט שלהם (בסופו של דבר, המשתמש ייצור עצים חדשים).
  2. השתמש במעקב TES של אפליקציית הטלפון כדי לבחור עץ, והחזק תג צווארון של תקשורת שדה קרוב (NFC) לטלפון כדי לטעון את פרטי העץ לתג.
  3. הכניסו שלוש עד ארבע דוגמאות עץ הדר למנשא שקיות הניילון תואם BTE, וסגרו עם המכסה.
    1. ודא שאורך עץ הניצן אינו עולה על 8 אינץ 'ואינו קטן מ -5 אינץ '.
      1. אם האורך גדול מ-20 ס"מ, השתמשו בסכין גילוח חד-פעמי סטרילי או בגזוז גזוז שזוהר בתמיסת אקונומיקה 10% (1% נתרן היפוכלוריט) כדי לקצר אותו.
      2. אם האורך הוא פחות מ -5 אינץ ', לאסוף דגימת budwood אחרת לשים לתוך השקית.
    2. יש לוודא שכל גידול בבית השחי או קוצים גדולים מוסרים ביד או באמצעות כלי חיתוך 10% חיטוי אקונומיקה (1% נתרן היפוכלוריט).
      הערה: שלב זה חשוב כדי שיהיה קל יותר לתמרן את הניצן בפתח החדר.
    3. ודא שאין דוגמאות budwood שיש להם תכונות מעוקלות. אם כן, הסירו אותם באמצעות כלי חיתוך 10% חיטוי אקונומיקה (1% נתרן היפוכלוריט), והניחו בשקיות BTE רק את החלקים הישרים של הדגימה.
      הערה: עץ ניצן מעוקל קשה מאוד לתמרון לתוך המכשיר, וכתוצאה מכך פסי קליפה לא אחידים.
  4. השתמש בגשש TES של אפליקציית הטלפון כדי לסרוק את תג צווארון NFC של העץ ולקשר אותו לתג קליפ NFC בתיק הדגימה.
  5. שימו לב לעובי הבודווד מכיוון שזה קובע כיצד המפעיל יפשיט את קליפת הבודווד העשירה בפלואם בתוך תא BTE.
    1. אם עובי הבודווד נמוך מ-0.20 אינץ', היזהרו בעת הפשטת עץ הניצן מכיוון שהחוטים המסתובבים במהירות גבוהה בתא יכתשו את כל עץ הניצן עד היסוד, מעבר לשכבת הקליפה ולרקמות הלא עשירות בפלואם של עץ ופית.
    2. בחר budwood עבה יותר כי קל יותר לפשוט את רקמות הקליפה תוך הימנעות רקמות budwood שאינם עשירים phloem.
  6. הכניסו את הדגימות למכולה מבודדת עם כמה חבילות קרח.

2. התקנה במכסה האדים

הערה: עדיף להפעיל את ה- BTE בתוך מכסה אדים. זה יפחית את הסיכון לזיהום צולב של רקמות צמחים וזיהום מעבדה.

  1. יש לחטא באמצעות בקבוק תרסיס 10% (1% נתרן היפוכלוריט).
    1. רססו את פני מכסה המנוע והניחו לאקונומיקה לשבת כדקה לפני שתנגבו אותה במגבת נייר.
    2. רססו מגבת נייר בתמיסת האקונומיקה. נגב את בסיס TE, רכיבי סולם משקל (קנה מידה, מגן אוויר ומגדל) ועט טוש.
  2. שחררו סט מזרקים למספר הדגימות שיש לעבד, והניחו אותן בתוך קופסת קרטון מכוסה.
  3. החזיקו חבילת מטושים זמינה מחוץ למכסה המנוע למקרה שיהיה בהם צורך.
  4. הכינו את סולם המשקל.
    1. הסר את מגדל המשקולות מהמאזניים והחזק את לחצן ההפעלה כדי להפעיל אותו. מקם את המגדל במרכז הסולם לאחר שהסולם מציג 0.
    2. החליקו את מגן האוויר של סולם המשקל מעל חזית המאזניים.
  5. הכן את בסיס חילוץ הרקמה על ידי היפוך המתג בגב. ודא שהמתג בצד שמאל של הקופסה נלחץ כלפי מטה בחלק העליון. המתן לנורית LED ירוקה מהבהבת, המציינת שהחדר מוכן.

3. הגדירו את עמדות הניקוי (איור משלים S1).

  1. יש להכניס 1 ליטר מים לשואב האולטרסוני.
  2. עטפו שתי שקיות אשפה מעל החלק העליון של השואב האולטרסוני.
  3. שפכו ~ 5 ליטר של 10% אקונומיקה (1% תמיסת נתרן היפוכלוריט) לתוך השואב האולטרסוני.
  4. מלאו את אמבט המים בכמות מספקת של מים כדי לטבול את החדר.
  5. הפעל את מדחס האוויר ופתח את השסתום.
  6. הגדירו רקע כדי לתפוס את הנוזל בזמן שהתא מתייבש.

4. עיבוד החומר עבור BTE להפשטת קליפת עץ ניצן הדרים

  1. טען את התא על בסיס BTE.
    1. הכינו את תא ה-BTE.
      1. חברו שקית דגימה ריקה לחלק האחורי של התא. השתמש בשני אורינגים כדי להצמיד את השקית הריקה לפייה האחורית של תא ה-BTE.
      2. בדוק את הלהב עבור סימנים של בלאי או נזק, כגון חתכים שנוצרו על הלהב שבו הוא ממשיך לתוך הפלסטיק או חתכים שנוצרו על הקצה. ודא שהחץ על הלהב מיושר עם סמל המנעול היחיד.
      3. ודא ששחרור האוויר בתחתית התא מופנה לכיוון סמל O . הניחו את המכסה השקוף מעל פתח התא, והחליקו את שקופית ה-BTE השקופה אל התא באמצעות המסילה מימין לתא. לחץ על המנעול בתחתית התא ככל שהוא יכול להיכנס למגלשה. ודא שמכסה הבוכנה מותקן בחלק העליון של המגלשה.
    2. הניחו את התא על בסיס BTE כאשר זרבובית בסיס ה-BTE בולטת לתוך החלק האחורי של התא. המתן עד שהנורית הכחולה תהבהב, כדי לציין שהמיקום הצליח.
  2. טען את הדגימה לבסיס BTE על-ידי הזזת המדבקה הלבנה על תג קליפ NFC ל- Z בצד ימין של התיבה. הזז את התג בתנועה מעגלית איטית על Z עד שהאור הצהוב יתחיל להבהב. צרף את הדגימה לבסיס BTE, וודא כי שקית הדגימה אינה כוללת חורים; אם יש חור, לתקן אותו עם קלטת. הניחו את טבעת ה-O מעל שקית הדגימה כדי להצמיד אותה לקדמת פיית ה-BTE.
  3. טען את ערכת המזרקים שאינה בשימוש.
    1. טרפו את סט המזרקים. מניחים את המזרק שאינו בשימוש על מגדל סולם השקילה. הסר את ערכת המזרקים כאשר נורה אדומה מתחילה להבהב או כאשר קנה המידה מציג 0.
    2. הסר את הבוכנה מהמזרק עם המסנן. ודא שהנוזל נמצא במזרק התחתון (שאינו מסנן). הניחו את הבוכנה בצד על מגבת נייר או על המגדל שבו הבוכנה השחורה אינה נוגעת במשטחים.
    3. חבר את המזרק ליציאת השקופיות על ידי לחיצה על יציאת היציאה לתוך המזרק וסיבוב של 90°.
  4. עבד את דוגמת budwood.
    זהירות: ל-BTE יש חלקים נעים במהירות גבוהה. כל הפעולה צריכה להתרחש בתוך מכסה אדים. כל המשתמשים צריכים להשתמש במשקפי מגן, מחממי אוזניים וכל ציוד מגן אישי אחר (PPE), כגון כפפות ומעילי מעבדה.
    1. לחץ על הלחצן השחור העליון כדי להפעיל את המכשיר. לחץ פעם שנייה כדי לעצור את המנוע בכל עת במהלך העיבוד.
      הערה: לקופסה יש חישת מהירות וטמפרטורה כדי להבטיח שהיא פועלת כראוי.
    2. תפוס מקל Budwood אחד דרך השקית, ולשים אותו דרך החלק העליון של זרבובית BTE.
    3. תפוס את מקל הבודווד בצד השני של התא ביד השנייה, ולאט לאט למטה לתוך הלהב. הקשיבו לצליל זמזום עדין המעיד על כך שהניצן מופשט מקליפתו. הזיזו את הניצן באיטיות קדימה ואחורה תוך כדי סיבוב שלו.
      1. אם נשמע צליל חיתוך חזק ואגרסיבי, הזז במהירות את הענף למעלה ו / או לחץ על הכפתור העליון כדי לעצור את המנוע. כדי לעצור את המנוע, השתמש במתג הימני כדי לסיים את העיבוד (ראה שלב 4.4.3.2).
      2. אם שום חומר לא יוצא מהיציאה בעת החיתוך, אז החדר יש סתימה. כבה את המנוע, הסר את מכסה הבוכנה המחליק והשתמש בפלסטיק של המקלון כדי לדחוף את הסתימה החוצה מיציאת המכונה. השתמש במתג הימני כדי לסיים את העיבוד: למעלה = חיתוך קדימה; אמצע = מנוע כבוי; למטה = חיתוך הפוך.
    4. חזור על שלב 4.4.2 ושלב 4.4.3 עבור הסניפים הנותרים.
      הערה: אינדיקטור כללי לכך שהופשטה מספיק קליפת עץ ניצן הוא כאשר 25% מהמזרק התמלא ברקמת הצמח. פתוגנים הניתנים להעברה של הדרים יכולים להיות מופצים באופן לא אחיד בעץ. לכן, שלוש עד ארבע דגימות ניצנים נאספות סביב חופת עץ הדר. חשוב שכל דגימת עץ ניצן בשקית נושאת BTE תתרום לדגימת רקמת הקרקע הסופית כדי להבטיח שדגימה מלאה של עץ מייצגת תיבדק לפתוגנים.
    5. לחץ על הלחצן השחור העליון כדי לעצור את העיבוד. המתן עד שהאור יתחיל להבהב שוב בצהוב.
  5. אמת את משקל הדגימה.
    1. סובבו את המזרק ב-90°, ומשכו אותו כלפי מטה כדי לנתק. מניחים את הבוכנה בחזרה על המזרק, ומניחים את המזרק על המגדל.
    2. המתן עד שהסולם יזהה אוטומטית את הדגימה, וקבע אם היא נמצאת בטווח המשקל הנכון (0.25 ± 0.05 גרם). אם משקל הדגימה נמוך מדי (<0.20 גרם), חזור על שלב 4.4; נורית ה-LED האדומה תתחיל להבהב. אם משקל הדגימה גבוה מדי (>0.30 גרם), הסר חלק מחומר הדגימה; נורית ה-LED הצהובה תתחיל להבהב לאט יותר. אם הדגימה נמצאת בתוך הטווח, נורית ה- LED הירוקה תתחיל להבהב.
  6. הומוגניזציה של דגימת הבודווד
    1. מוציאים את הבוכנה מהמזרק עם הדגימה, דוחפים את הנוזל למזרק עם הדגימה ומוסיפים מחדש את הבוכנה. הבוכנה דוחפת את החיץ ואת לשד הצמח דרך מסנן הרשת (מניעת חתיכות רקמת קליפה גדולות) ודרך צינור הגומי לתוך המזרק הריק.
    2. מערבבים את הדגימה על ידי דחיפת החיץ ולשד הצמח קדימה ואחורה ממזרק אחד למשנהו. חזור על ~ 3x-4x ועד שהדגימה הופכת לתערובת נוזלית ירוקה הומוגנית.
    3. לאחר הומוגנית היטב, לדחוף את דגימת לשד הצמח לתוך המזרק ללא מסנן הרשת, ולנתק את צינור הגומי ואת המזרק עם המסנן מן המזרק עם הדגימה.
    4. יש להוציא את דגימת לשד הצמח מהמזרק לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 2 מ"ל, ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף. השתמש בטוש קבוע כדי לתייג את הדגימה במספר השקית.
      הערה: כעת ניתן לעבד את לשד דגימת הצמח משלב 4.6.5 עם כל אחת מחומצות הגרעין, הרנ"א או הדנ"א הזמינים, שיטות מיצוי המבוססות על פנול-כלורופורם, עמודת סיליקה או חרוזים מגנטיים 9,25,26,27 למיצוי וטיהור חומצות גרעין (ראה שלב 7) וזיהוי במורד הזרם של פתוגנים המועברים באמצעות שתלים של הדרים (ראה שלב 8).

5. חיטוי התא הנשלף BTE

אזהרה: אם החיץ ממערכת המזרקים עולה על התא או מחליק, יש לשטוף ולפעול לפי כל כללי הבטיחות של המעבדה לפני הניקוי. סט המזרקים מכיל guanidine thiocyanate. אם החיץ מסט המזרקים בא במגע עם אקונומיקה, הוא ייצור גז ציאניד.

  1. בצע את השלבים הבאים לאחר עיבוד הדגימה העשירית בתא. שים לב שהנורית הירוקה תמשיך להבהב במקום לעבור להבהוב כחול.
  2. לפרק את תא BTE כדי לנקות את כל המזהמים האפשריים; הסר את מכסה הפלסטיק השקוף, נקה את שקופית התא ונקה את יציאת הסתימה במגלשת התא.
  3. סובב את שסתום שחרור האוויר בתחתית התא למצב פתוח (סימן מנעול פתוח). הכניסו את רכיבי התא לשואב האולטרסוני המותקן (ראו שלב 3.1). הניחו את המכסה מתחת לתא כדי למנוע ממנו לצוף. הפעל את השואב העל-קולי למשך 15 דקות.
    הערה: אמבט הניקוי האולטרסוני (5 ליטר) יכול להכיל עד שני תאים.
  4. שטפו את רכיבי התא באמבט המים (שלב 3.4) במשך 30 שניות לפחות. העבר את רכיבי התא לתחנת הייבוש.
    זהירות: ייבוש יגרום לחלקים הנעים במהירות בתוך התא, לרעשים חזקים (~85 דציבלים [dB]) ולהתזה אפשרית. על כל המשתמשים להשתמש במשקפי מגן, מחממי אוזניים, מעילי מעבדה וכל ציוד הגנה אישי אחר כנדרש על פי כללי הבטיחות של מעבדת ההפעלה.
  5. יבש את תא BTE.
    1. מקם את אקדח האוויר בקו אחד עם החריץ של הפתח העליון של התא (היכן שהמגלשה תהיה בדרך כלל). לחץ על הדק האקדח כדי לשחרר אוויר עבור ~ 30 שניות.
      הערה: ודא שהפתח מרוחק מהמשתמש לכיוון הרקע. פעולה זו אמורה לסובב את מערך הלהבים כדי להסיר את הנוזל הכלוא מתחתיו.
    2. מקם את אקדח האוויר לכיוון החרירים העליונים של התא. לחץ על ההדק של אקדח האוויר, ועקוב באיטיות אחר שלושה עיגולים מלאים של כל כניסה לזרבובית.
    3. מקם את אקדח האוויר במרכז ה- BTE. החל מהנקודה הפנימית ביותר, החזק את ההדק לחוץ, ועבור עד שאקדח האוויר יצביע לעבר המקום שבו המגלשה תהיה.
    4. העבירו במהירות אוויר על פני כל התא, מלפנים ומאחור, כדי להרחיק את המים העיליים מבחוץ.
  6. יבש את מגלשת BTE.
    1. מקם את אקדח האוויר בחריץ הבוכנה של המגלשה, ולחץ על ההדק כדי להוציא מים מיציאת המגלשה.
    2. הפעל אקדח אוויר לאורך המשטח הפנימי של המגלשה כדי לייבש אותה.
    3. הפעל אקדח אוויר לאורך חריץ המגלשה כדי לדחוף החוצה מים.
    4. העבירו במהירות אוויר על כל החלק החיצוני כדי להסיר ממנו מים עיליים.
  7. יבשו את הרכיבים.
    1. החזיקו ביד את מכסה הבוכנה המחליק ואת טבעות ה-O ולחצו על ההדק.
    2. הפעל אקדח אוויר על פני השטח הפנימי של המכסה.
    3. הניחו את הרכיבים בתא והחליקו כדי להמשיך לייבש או להרכיב אותם מחדש.
      הערה: עבור סביבת עיבוד רקמות גבוהה עם BTE פונקציונליים מרובים, ניתן לספק מערכת חיטוי אצווה המסוגלת לטהר 10 תאים בו זמנית.

6. סילוק וחיטוי

  1. יש להשליך את המזרקים וצינורות הגומי למיכל הפסולת הייעודי של גואנידין.
  2. יש להשליך כל חומר צמחי למיכל הפסולת הביולוגית.
  3. הסר את תא BTE מבסיס BTE.
  4. לפרק את תא BTE ולהמשיך לטיהור שלהם, כמתואר בשלב 5.

7. הערכת עיבוד הרקמה ואיכות הרנ"א המטוהר מתמציות ניצני ההדרים BTE

הערה: בפרוטוקול זה, השתמשנו בדגימות של עצי ניצן מ-255 עצי הדר כדי להשוות את הזמן הדרוש לעיבוד רקמת ניצן הדרים ואת איכות הרנ"א שטוהר מתמציות רקמת קליפה שהוכנו על-ידי BTE (איור 2, צד ימין, שלב 1, שלב 5 ושלב 6) לעומת זה שהוכן בעקבות שיטת עיבוד רקמות ניצני הדרים שאושרה באופן רגולטורי תוך שימוש בקילוף וקיצוץ ידיים, ייבוש בהקפאה, כתישה וצנטריפוגה של רקמת הקליפה, כפי שמתואר על-ידי Dang et al.23 (איור 2, צד שמאל, שלבים 1-6).

  1. נוהל מעבדה נוכחי: הכנת דגימות עץ ניצן לעיבוד רקמות בהתאם לשיטה23 שאושרה על ידי הרגולטור.
    1. ביצוע קילוף ידני וקיצוץ של רקמת הקליפה, ייבוש בהקפאה, כתישת, צנטריפוגה והעברת לשד הצמח לצינור מיצוי הרנ"א, כפי שמתואר על-ידי Dang et al.23 (איור 2, צד שמאל, שלבים 1-6).
    2. לאחר קילוף ידני של שלוש עד ארבע דגימות עץ ניצן מכל עץ שנבדק, הניחו את כל עץ הניצן בתוך מנשא שקיות ניילון תואם BTE, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד BTE (שלב 7.2).
  2. הליך BTE: התחל את עיבוד רקמת ניצן ההדרים של BTE (סעיף 4, שלבים 4.1-4.6; איור 2, צד ימין, שלב 1, שלב 5 ושלב 6).
    1. השתמש בדגימות budwood המאוחסנות בתוך שקיות הנשיאה של BTE משלב 7.1.2.
  3. לחלץ ולטהר את הרנ"א מלשד הצמח המתקבל מהליך המעבדה הנוכחי (שלב 7.1.1) ומהליך BTE (שלב 7.2.2)באמצעות השיטה החצי-אוטומטית המבוססת על חרוזים מגנטיים 8,23,28 שאושרה באופן רגולטורי.
  4. להעריך את איכות הרנ"א על ידי מדידת ריכוזו, טוהרו ושלמותו 8,23,24,29,3 3,31.
    1. כדי לחשב את הריכוז, השתמש בספקטרופוטומטריה ובצפיפות אופטית (OD) באורך גל של 260 ננומטר.
    2. כדי להעריך את הטוהר, השתמש ביחס OD ספקטרופוטומטרי של 260/280.
    3. כדי לבדוק את התקינות, השתמש בתגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) בשעתוק לאחור (RT) המכוונת ל-mRNA של הגן NADH dehydrogenase citrus gene24,32.

8. הערכה של זיהום צולב וזיהוי של וירוסי הדרים ווירואידים באמצעות RNA מטוהר מתמציות BTE citrus budwood

הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו בדגימות ניצנים מ-72 עצי הדר לא נגועים ובתערובת עצים אחת הנגועים בנגיפים ווירואידים כדי להעריך את הפוטנציאל של זיהום צולב בין דגימות כאשר הן מעובדות על-ידי BTE (איור 2, צד ימין, שלב 1, שלב 5 ושלב 6) ואת ההתאמה של רנ"א מטוהר מתמציות רקמת קליפה שהוכנו על-ידי BTE כדי לשמש כתבנית לזיהוי RT-qPCR של נגיפי הדר ווירואידים.

  1. עיבוד דגימות BTE ראשון: ערוך ניסוי בסיסי עם 72 דגימות לא נגועות.
    1. הכינו שלושה תאי BTE (A-C) (שלב 4.1.1).
    2. הכינו את כל דגימות עצי ההדר הלא נגועים (1-72) בשקיות נשא BTE, והכינו מספר שווה (72) במערכת איסוף דגימות BTE בעלת שני מזרקים, עם מערכת מזרקים אחת לכל דגימה (שלב 2.4).
    3. הפרידו את שקיות הנשיאה של הדגימות ואת מזרקי איסוף הדגימות לשש אצוות (I-VI) של 12 דגימות כל אחת.
    4. התחל את עיבוד רקמת ניצן ההדרים BTE (שלב 4) לפי הרצף להלן (שלבים 8.1.4.1-8.1.4.6) (ראה טבלה 1, עיבוד דגימת BTE ראשונה).
      1. עבור אצווה I/דגימות 1-12, יש לעבד 12 דגימות באמצעות תא A. לחטא תא A לאחר מדגם 12 (שלב 5).
      2. עבור אצווה II/דגימות 13-24, יש לעבד 12 דגימות באמצעות תא B. לחטא את תא B לאחר מדגם 24 (שלב 5).
      3. עבור אצווה III/דגימות 25-36, יש לעבד 12 דגימות באמצעות תא C. לחטא את תא C לאחר מדגם 36 (שלב 5).
      4. עבור אצווה IV/דגימות 37-48, יש לעבד 12 דגימות באמצעות תא מחוטא A (שלב 8.1.4.1).
      5. עבור אצווה V/דגימות 49--60, עבד 12 דגימות באמצעות תא מחוטא B (שלב 8.1.4.2).
      6. עבור אצווה VI/דגימות 60-72, יש לעבד 12 דגימות באמצעות תא C מחוטא (שלב 8.1.4.3).
    5. אחסנו את שקיות הנשיאה של BTE עם כל הדגימות בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש בשלב 8.2.
    6. לחלץ ולטהר את הרנ"א מ-72 דגימות לשד צמחי שנוצרו בשלבים 8.1.4.1-8.1.4.6 באמצעות השיטה החצי-אוטומטית המבוססת על חרוזים מגנטיים 8,23,28 שאושרה באופן רגולטורי.
    7. בצע RT-qPCR לזיהוי נגיפי הדר ווירואידים,כפי שתואר קודם 8,33.
  2. עבור עיבוד דגימת BTE השני, בצע ניסוי זיהום צולב עם 70 דגימות לא נגועות ושתי דגימות נגועות מעורבות.
    1. הכינו שלושה תאי BTE (A-C) (שלב 4.1.1).
    2. הכינו את דגימת עץ ההדר הנגוע בתערובת (73) בשתי שקיות נשא BTE (שלב 1.3) למספר כולל של שתי דגימות נגועות.
    3. אסוף את שקיות נשא BTE עם דגימות עצי הדר לא נגועים משלב 8.1.5, למעט דגימה 3-אצווה I ומדגם 51-אצווה V (ראה החלפת דגימה בשלב 8.2.4), למספר כולל של 70 דגימות לא נגועות.
    4. כלול את שקית נשא ה- BTE הראשונה עם הדגימה הנגועה בתערובת 73 במקום מדגם 3 באצווה I ואת השנייה במקום מדגם 51 באצווה V למספר כולל של 72 דגימות.
    5. הכינו מספר שווה (72) במערכת איסוף דגימות BTE בעלת שני מזרקים, עם מערכת מזרקים כפולה אחת לכל דגימה (שלב 2.4).
    6. הפרידו את 72 שקיות הנשיאה לדוגמה ואת מזרקי איסוף הדגימות לשש אצוות (I-VI) של 12 דגימות כל אחת.
    7. התחל את עיבוד רקמת ניצן ההדרים BTE (שלב 4), לפי אותו רצף כמו בשלבים 8.1.4.1-8.1.4.6.
      הערה: ההבדל היחיד הוא החלפת מדגם 3 באצווה I ומדגם 51 באצווה V במדגם 73 הנגוע (שלב 8.2.4) (טבלה 1, עיבוד דגימת BTE שני).
    8. לחלץ ולטהר את הרנ"א מ-72 דגימות לשד צמחי שנוצרו בשלב 8.2.7 כמו בשלב 8.1.6.
    9. בצע RT-qPCR לזיהוי וירוסי הדר ווירואידים, כמו בשלב 8.1.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיצוי, טיהור ואיכות RNA באמצעות רקמת הדרים בודווד מעובדת BTE והערכת זמן לעיבוד רקמות
השתמשנו בדגימות ניצנים מ-255 עצי הדר מייצגים לצורך בדיקה זו כדי להשוות את איכות ה-RNA מה-BTE לעומת ההליך הסטנדרטי. הדגימות עובדו על-ידי מחלץ רקמת ניצן (BTE) (פרוטוקול שלבים 4.1-4.6 ואיור 2, צד ימין, שלב 1, שלב 5 ושלב 6) או הוכנו בהתאם לשיטת עיבוד רקמת ניצן ההדרים שאושרה באופן רגולטורי, המשתמשת בקילוף וקיצוץ ידני, ייבוש בהקפאה, כתישה וצנטריפוגה של רקמת הקליפה, כפי שמתואר על-ידי Dang et

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם הופעתה של מחלת ההדרים HLB, כדי להפחית הפסדים, תעשיית ההדרים, סוכנויות רגולטוריות ומעבדות אבחון נקראו להסתמך על שיטות מיצוי חומצות גרעין בתפוקה גבוהה בשילוב עם עיבוד דגימות ידני בתפוקה נמוכה ומבחני זיהוי פתוגנים כגון qPCR34 לבדיקת עצים בודדים, בשילוב עם שיטות ניהול מחלות35. שיעור החיוביות ב-HLB בקליפורניה עלה מ-0.01% ב-2012 ל-1.2% ב-2020. למרות ש- qPCR הוא כלי רב עוצמה ואמין לזיהוי פתוגנים, הטכנולוגיות הזמינות כיום אינן מאפשרות לדגום ולעבד נפח מספיק של רקמת צמחים, וכתוצאה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים באנשי קאווילה כאפוטרופוסים המסורתיים של הארץ שעליה הושלמה העבודה הניסיונית. אנו אסירי תודה לפרופסור נורמן אלסטרנד מאוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, על שסיפק שטח מעבדה לביצוע פעילויות מחקר עבור פרויקט זה במסגרת יוזמת UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). מחקר זה נתמך על ידי CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (מענק מס' 18-0001-055-SC). תמיכה נוספת ניתנה גם על ידי פרויקט CRB 6100; המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA, פרויקט Hatch 1020106; ו-National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148 &AP20PPQS&T00C049) שהוענק לגאורגיוס וידאלאקיס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
קו גוזם משושה בגודל 0.08 אינץ'דרוש PowerCareFPRO07065להחלפת להבים.
1 כ"ס, מדחס אוויר 8 גלקליפורניה אייר טולס8010ייבוש מהיר של תאים לאחר שטיפה
של צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לגלובוס סיינטיפיק111558Bאחסן דגימה לאחר שטיפה עם syinges
10 מ"ל סט מזרקיםטכנולוגיה פתרונות מתפתחיםTE006-F1-10A-G1000-E1חומר מזרק נחתך. בקבוק 1 ליטר עם מאגר גואנידין תיוציאנט. אזהרה - מכיל גואנידין תיוציאנט, נדרש שירות פסולת מסוכנת - אין לערבב עם אקונומיקה
12 אינץ' RulerWestcott‎ 16012למדידת קו גוזם לפני חיתוך
12% נתרן היפוכלוריטHasa1041מחטא תאים לאחר עיבוד-20
C מקפיאInsigniaNS-CZ70WH0אחסן מדגם לאחר עיבוד
שקיות ניילון בגודל 4 אינץ' x 12 אינץ'PlymorFP20-4x12-10שקיות להחזקת ענפים במהלך המשלוח. טבעות O מצמידות שקית לתא BTE כדי לאטום
ספוגית כותנה 6 אינץ'Puritan806-PCLספוגית להסרת סתימות
ליטר אחסון תיקHDX206152מחזיק תמיסת נתרן היפוכלוריט לחיטוי תאים ומים לשטיפת תאים
אקדח מכת אווירJASTIND‎ JTABG103Aמכוון אוויר לתאים בלחץ גבוה
Black SharpieSharpie  S-19421Mark 1.5 מ"ל צינורות כך שתוכל לזהות מדגם מאוחר יותר
מתקן בקבוק עליוןמותג Z627569מתקן בקבוק מתכוונן להפצת גונדין למזרק
BTE ChamberTechnology פתרונות מתפתחיםTE002BB-A05-E1משמש לעיבוד ניצנים. כולל טבעות O, שקופית BTE, בוכנת החלקה, שסתום ניקוז, מכסה, סט להבים וכלי להסרת סט להבים
סבון כליםDawn57445CTSurfectant לשיפור חדירת נתרן היפוכלוריט לתא
מכסה אדים עם מסנן hepaAir ScienceP5-36XT-Aמכסה אדים עם מסנן hepa (ASTS-030)  כדי להגביל זיהום אפשרי ולהגן מפני שפיכת כימיקלים
מיכלמשלוח קצף מבודדPolarTech261/J50Cמיכל משלוח מבודד למשלוח דגימות על קרח לאחר שנאספו
ציפוי מעבדהRed KapKP14WH LN 46Lab כדי להגביל זיהום אפשרי ולהגן מפני דליפות כימיות
מחשב ניידMicrosoftSurfaceWifi להפעלת TES GUI. נחוץ להגדרה ראשונית ומספק מידע מעמיק יותר על בסיס עיבוד הרקמות
טלפון בעל יכולת NFCSamsungGalaxy S9להורדה ושימוש באפליקציית טלפון TES
תג קליפ NFCEvolving SolutionsTE005-Clip-E1תג לדוגמה שניתן לקשר עם עצים. נועד לתפקד עם אפליקציית הטלפון של TES
NFC Collar TagTechnology Evolving SolutionsTE005-Collar-E1Tag המחובר לעץ. נועד לתפקד עם אפליקציית הטלפון TES
כפפות ניטריל"ב סיינטיפיק3915-4400כפפות להגבלת זיהום אפשרי והגנה מפני דליפות כימיות
אטם אוזניים להפחתת רעש3M90565-4DC-PSהגן על האוזניים בזמן הפעלת מדחס אוויר ובסיס עיבוד רקמות
צינור אוויר רתיעת פוליאוריטןFYPower‎ 510019מחבר אקדח אוויר למדחס
משקפי SafteySolidworkSW8329-USהגן על העיניים מפני סכנות כימיות ופיזיקליות
בקבוק ריסוסJohnBeeB08QM81BJVריסוס אקונומיקה לניקוי משטחים
מחלץ רקמות טכנולוגיית בסיספתרונות מתפתחיםTE001-A-E1מערכת לעיבוד רקמת צמחים זקוק לתאי BTE או LTE כדי לתפקד. כולל כבל חשמל, מתאם להב ומפתח אלן בגודל 8/32 אינץ'
רקמות טכנולוגיית סולם משקל בסיספתרונות מתפתחיםTE003-A05-200G-01-E1200 גרם, סולם משקל ברזולוציה 0.01 המתחבר לבסיס עיבוד רקמות כדי לאכוף טווחי משקל ו/או לקשר משקולות עם מדגם. כולל משקל, כבל חשמל, כבל חיבור, מחזיק מזרק 5 מ"ל, מגן אוויר במגדל 
ורמיקוליטEasyGoמוצריםB07WQDZGRPדרושים להובלת פסולת מסוכנת (גואנידין תיוציאנט) באמצעות שירות פינוי פסולת מסוכנת
חותך חוטיםBoenfu‎ BOWC-06002-USחותכי חוטים לחיתוך קו גוזם
7 טלפון Technology ארה עיבוד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366(2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170(2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281(2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367(2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088(2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Tags

Citrus Budwood ProcessingPathogen DetectionBudwood Tissue ExtractorNucleic Acid ExtractionCitrus Virus DetectionHigh Throughput ScreeningPlant Tissue HomogenizationPCR AssaysPhloem Rich TissueMolecular Diagnostics

Related Articles