מאמר שיטה

ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

DOI:

10.3791/65206

⸱

2 ביוני 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפות שומנים (LDs) הן אברונים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים וממלאים תפקיד חשוב מאוד בדיכוי רעילות ליפוטוקסית ובמניעת תפקוד לקוי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs). הכבד, בהתחשב בתפקידו הקריטי בחילוף החומרים של השומן בגוף, מאוים באופן מתמשך על ידי הצטברות תוך תאית של LDs בצורה של סטאטוזיס כבד microvesicular ו macrovesicular. האפיון ההיסטולוגי של LDs מבוסס בדרך כלל על צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון צביעת שמן אדום O (ORO), אך מספר חסרונות מעכבים באופן עקבי את השימוש בניתוח זה עם דגימות כבד. לאחרונה, פלואורופורים ליפופיליים 493/503 הפכו פופולריים להדמיה ואיתור LDs בשל קליטתם המהירה והצטברותם בליבת טיפת השומנים הניטרלית. למרות שרוב היישומים מתוארים היטב בתרביות תאים, יש פחות ראיות המוכיחות את השימוש האמין בבדיקות פלואורופור ליפופיליות ככלי הדמיה LD בדגימות רקמות. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול אופטימלי מבוסס בורון דיפירומתין (BODIPY) 493/503 להערכת LDs בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן (HFD). פרוטוקול זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, צביעת BODIPY 493/503, רכישת תמונה וניתוח נתונים. אנו מדגימים מספר מוגבר, עוצמה, יחס שטח וקוטר של LDs בכבד בעת הזנת HFD. באמצעות הקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה לצפות בתוכן המלא של שומנים ניטרליים בליבת LD, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, עם פלואורופור BODIPY 493/503, הצלחנו להבחין בין microvesicles (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), שלפוחיות ביניים (3 מיקרומטר < d ≤ 9 מיקרומטר) ו macrovesicles (d > 9 מיקרומטר), המאפשר הבחנה מוצלחת של סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular. בסך הכל, פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות זה הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD בכבד ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית 1,2,3.

ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה4. לאחר מכן, חלבונים מדו-שכבתיים של ER וציטוזול, במיוחד ממשפחת החלבונים פריליפין (PLIN), עוברים טרנסלוקציה לפני השטח של LDs כדי להקל על ניצנים 5,6,7,8,9.

באמצעות סינתזת חומצות שומן חדשות ואיחוי LD או התמזגות, LDs גדלים לגדלים שונים. בהתאם לכך, הגודל והמספר של LDs שונים במידה ניכרת בין סוגי תאים שונים. טיפות קטנות (בקוטר 300-800 ננומטר), הידועות בשם LDs ראשוניים (iLDs), יכולות להיווצר כמעט על ידי כל התאים4. מאוחר יותר בהיווצרות LD, רוב התאים מסוגלים להמיר iLDs מסוימים ל- LDs גדולים יותר המרחיבים (eLDs בקוטר >1 מיקרומטר). עם זאת, רק סוגי תאים ספציפיים, כגון אדיפוציטים והפטוציטים, יש את היכולת ליצור LDs ענקיים או גדולים (עד עשרות מיקרון קוטר)4,10.

LDs ממלאים תפקיד חשוב מאוד בוויסות חילוף החומרים של שומנים בתאים, דיכוי ליפוטוקסיות ומניעת לחץ בחדר המיון, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, מוות תאי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs)11,12,13,14. יתר על כן, LDs היו מעורבים גם בוויסות ביטוי גנים, שכפול נגיפים של חלבונים, וסחר בממברנות ואיתות15,16,17. לכן, הרגולציה השגויה של ביוגנזה LD היא סימן היכר של מחלות כרוניות הקשורות לתסמונת מטבולית, השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ו / או טרשת עורקים, אם להזכיר רק כמה 18,19,20.

הכבד, כמרכז מטבולי, אחראי בעיקר על חילוף החומרים של שומנים על ידי אחסון ועיבוד שומנים, ולכן, הוא מאוים כל הזמן על ידי lipotoxicity21. סטאטוזיס בכבד (HS) הוא מאפיין נפוץ של סדרה של מחלות כבד מתקדמות ומאופיין בהצטברות שומנים תוך-תאית מוגזמת בצורה של LDs ציטוסוליים, שבסופו של דבר עלולים להוביל לתפקוד מטבולי לקוי של הכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי22,23,24,25. HS מתרחש כאשר קצב החמצון והייצוא של חומצות שומן כטריגליצרידים בתוך ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDLs) נמוך מקצב ספיגת חומצות השומן בכבד מהפלזמה ומסינתזת חומצות השומן דה נובו 26. הצטברות הכבד של שומנים מתרחשת לעתים קרובות בשתי צורות - סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular - ואלה מציגים מאפיינים cytoarchitectonic מובהקים27. בדרך כלל, סטאטוזיס microvesicular מאופיין על ידי נוכחות של LDs קטנים מפוזרים ברחבי hepatocyte עם הגרעין ממוקם במרכז, ואילו סטאטוזיס macrovesicular מאופיין על ידי נוכחות של LD גדול אחד שתופס את החלק הגדול של hepatocyte, דוחף את הגרעין לפריפריה28,29. יש לציין כי שני סוגים אלה של סטאטוזיס נמצאים לעתים קרובות יחד, ועדיין לא ברור כיצד שני דפוסי LD אלה משפיעים על פתוגנזה של מחלות, שכן הראיות עדיין אינן עקביות 31,32,33,34. עם זאת, סוג כזה של ניתוח משמש לעתים קרובות כ"תקן ייחוס" במחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי להבין את ההתנהגות הדינמית של LDs ולאפיין סטאטוזיס בכבד 29,34,35,36.

ביופסיות כבד, תקן הזהב לאבחון ודירוג HS, מוערכות באופן שגרתי על ידי ניתוח היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין (H&E), שבו טיפות שומנים מוערכות כוואקולים לא מוכתמים במקטעי כבד מוכתמים H&E37. בעוד מקובל עבור הערכת סטאטוזיס macrovesicular, סוג זה של מכתים בדרך כלל מצמצם את ההערכה של סטאטוזיס microvesicular38. צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון Oil Red O (ORO), משולבים באופן קלאסי עם מיקרוסקופ brightfield כדי לנתח מאגרי שומנים תוך תאיים, אך עדיין יש להם מספר חסרונות: (i) השימוש באתנול או איזופרופנול בתהליך הצביעה, אשר לעתים קרובות גורם לשיבוש של LDs המקוריים ואיחוי מדי פעם למרות שהתאים קבועים39; (ii) האופי הגוזל זמן, שכן פתרון ORO דורש המסה וסינון של אבקה טרייה בשל חיי המדף המוגבלים, ובכך תורם לתוצאות פחות עקביות; (iii) והעובדה כי ORO מכתים יותר מאשר רק טיפות שומנים ולעתים קרובות מעריך יתר על המידה סטאטוזיסבכבד 38.

כתוצאה מכך, פלואורופורים ליפופיליים חדירים לתאים, כגון אדום הנילוס, שימשו בדגימות חיות או קבועות כדי להתגבר על חלק מהמגבלות שהוזכרו לעיל. עם זאת, האופי הלא ספציפי של תיוג אברוני שומנים בתאים מצמצם שוב ושוב את הערכות LD40. יתר על כן, התכונות הספקטרליות של אדום הנילוס משתנות בהתאם לקוטביות הסביבה, מה שלעתים קרובות יכול להוביל לשינויים ספקטרליים41.

הגשושית הפלואורסצנטית הליפופילית 1,3,5,7,8-פנטמתיל-4-בורה-3a,4adiaza-s-indacene (אורך גל עירור: 480 ננומטר; פליטה מרבית: 515 ננומטר; BODIPY 493/503) מציג מאפיינים הידרופוביים המאפשרים ספיגה מהירה שלו על ידי LDs תוך תאי, מצטבר בליבת טיפת השומנים, ולאחר מכן, פולט פלואורסצנטיות ירוקה בהירה12. שלא כמו אדום הנילוס, BODIPY 493/503 אינו רגיש לקוטביות הסביבה והוכח כסלקטיבי יותר, מכיוון שהוא מציג בהירות גבוהה עבור הדמיית LD. על מנת להכתים LDs ניטרליים, ניתן להשתמש בצבע זה בתאים חיים או קבועים ולשלב בהצלחה עם שיטות צביעה ו / או תיוג אחרות42. יתרון נוסף של הצבע הוא שהוא דורש מאמץ מועט כדי להכניס לתמיסה והוא יציב, ובכך מבטל את הצורך להכין אותו טרי לכל ניסוי42. למרות שהגשושית BODIPY 493/503 שימשה בהצלחה כדי להמחיש את הלוקליזציה והדינמיקה של LDs בתרביות תאים, דיווחים מסוימים הדגימו גם את השימוש האמין בצבע זה ככלי הדמיה LD ברקמות, כולל שריר vastus lateralis43 האנושי, שריר סוליאוסחולדה 42 ומעי עכבר44.

בזאת, אנו מציעים פרוטוקול מותאם מבוסס BODIPY 493/503 כגישה אנליטית חלופית להערכת מספר, שטח וקוטר LD בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד. הליך זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, תנאי צביעה, רכישת תמונה וניתוח נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי מכון קוימברה למחקר קליני וביו-רפואי (iCBR) הגוף לרווחת בעלי חיים (ORBEA, #9/2018) ועמדו בהנחיות הלאומיות והאירופיות לטיפול בבעלי חיים ובהנחיות ARRIVE.

1. תכנון ניסיוני

  1. זוג חולדות וויסטאר זכרים בני 13 שבועות בכלובים מאווררים בתנאים סביבתיים מבוקרים של טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס), לחות (50%-60%) ואור (מחזור אור-חושך של 12 שעות) ועם גישה למי ברז וצ'או מכרסמים סטנדרטי.
  2. לאחר תקופה של שבועיים של התאקלמות, הקצו את החולדות באופן שרירותי לשתי קבוצות.
  3. האכילו את קבוצת הביקורת (CTRL, n = 6) ואת קבוצות הדיאטה עתירות השומן (HFD, n = 6) בצ'או סטנדרטי ובתזונה עתירת שומן (45% קק"ל / שומן), בהתאמה, במשך 24 שבועות.
  4. עקוב אחר משקל הגוף (BW) מדי שבוע. תעד את צריכת המזון והמשקאות היומית בכל כלוב.

2. הכנת דגימת כבד

  1. דיסקציה של הכבד
    1. הכינו את המשאבה הפריסטלטית: העבירו 70% אתנול דרך הצינור, חברו מחט 27 G לקצה היציאה של הצינור, והפעילו את הצינור במי מלח קרים כקרח (4°C) 1x מלוחים חוצצי פוספט (PBS, pH ~7.4) (למשל, 200 סל"ד על משאבה פריסטלטית עם צינורות סיליקון 1.6 מ"מ I.D, סט טפטוף מיני IV). התאימו את עצמכם למשקל הגוף (למשל, עבור חולדה של 100-150 גרם, השתמשו בקצב זרימה של כ-10-12 מ"ל/דקה).
    2. מרדימים את החולדה בזריקה תוך צפקית באמצעות פרוטוקול הרדמה (הריכוז הסופי של קטמין = 75 מ"ג/ק"ג, והריכוז הסופי של מדטומידין = 1 מ"ג/ק"ג).
      הערה: ודאו שהחולדה מורדמת לחלוטין בשיטת התגובה לצביטה בבוהן.
    3. הניחו את החולדה על מגש הנתיחה.
    4. לחטא את הפרווה ביסודיות עם אתנול 70%, ולייבש אותו עם מגבת נייר.
    5. בעזרת מספריים, לבצע חתך בצורת "U" דרך העור, לחתוך פתוח מתחת לסרעפת. לאחר מכן, לחתוך את כלוב הצלעות rostrally על הקצוות כדי לחשוף את הלב.
    6. בזמן שה-PBS 1x פועל, העבירו את המחט דרך החדר השמאלי לתוך אבי העורקים העולה, ומהדקים. לאחר מכן, חותכים את האטריום הימני כדי לאפשר ניקוז לאחר תחילת הזילוח.
      הערה: הכבד אמור להתחיל להתכווץ כאשר הדם מוחלף ב-PBS.
    7. בעזרת מספריים ומלקחיים של Dumont, מוציאים את הכבד בזהירות ושוטפים עם 1x PBS.
    8. מעבירים את הכבד לצלוחית פטרי ושוקלים אותו.
    9. באמצעות אזמל, לאסוף דגימות רקמת כבד של 5 מ"מ עובי מן הצד לרוחב (1 ס"מ מן הקצה) של האונה השמאלית של הכבד עבור תהליך הטבעה.
      הערה: ניתן לאחסן את הרקמה הנותרת בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
  2. הטבעה של רקמת כבד
    1. הכינו מיכל קרח יבש, ותייגו כראוי קריומולדים עם מזהה הדגימה והכיוון.
    2. הניחו כמה טיפות של מטריצת הטבעה של קריומולד על מרכז הקריומולד כדי ליצור את טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT).
    3. ודא שדגימת הרקמה מכוונת כראוי לחתך רוחבי.
      הערה: ודא שהצד הנוגע בתחתית הקריומולד הוא הצד שיחתך ראשון.
    4. בזהירות לטפטף עוד OCT על cryomold עד שהוא מכוסה לחלוטין. נסו להימנע מהיווצרות בועות אוויר. במידת הצורך, בעזרת מלקחיים פשוטים, הסירו את כל הבועות בתוך ה-OCT.
    5. הניחו במהירות את הקריומולד עם הדגימה המכוסה ב-OCT במיכל קרח יבש.
      הערה: ניתן לאחסן את הרקמות בטמפרטורה של -80°C למשך 3 שנים.

3. חתך רקמות קפואות

  1. כוונן את טמפרטורת ההקפאה (תא: -21 ° C; דגימה: -18 ° C), והכנס להב סטרילי חדש.
  2. הניחו את הדגימות בהקפאה למשך 30 דקות לפני שתאפשרו לטמפרטורה להתאזן.
  3. צור שכבה אחת של OCT על דיסק הדגימה כדי לאפשר הדבקת דגימה. אפשר ל-OCT לקפוא, והרכיב את דגימת הרקמה בכיוון הרצוי.
    הערה: משטח החיתוך צריך להיות מקביל ללהב. כדי לשמור על הדבקה טובה, הניחו את מחלץ החום על החלק העליון של הדגימה. השלבים הקודמים יכולים להתבצע גם במיכל קרח יבש עם קרח יבש.
  4. מניחים את הדגימה בראש הדגימה, וחותכים את פני הרקמה (כמה קטעי דגימת רקמה של 30 מיקרומטר).
  5. ברגע שאזור העניין נגיש לחתך, חתכו מקטעים בעובי 12 מיקרומטר, והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופ מסומנות הנשמרות בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: כדי לאסוף את המקטע, הזז באיטיות את השקופית לכיוון מקטע הרקמות. כל שקופית יכולה לאסוף שני חלקי כבד.
  6. אפשר לשקופיות להתייבש במשך 10 דקות ב- RT.
    הערה: ניתן לאחסן את השקופיות ב -20 ° C במשך 6-12 חודשים או ב -80 ° C עד 3 שנים.

4. צביעת BODIPY

  1. הפשירו את המגלשות במערכת צביעת שקופיות ב-RT למשך 30 דקות.
  2. יש לשטוף עם 1x PBS (3x למשך 5 דקות כל אחד).
  3. הקיפו את הקטע בשכבה הידרופובית באמצעות עט מחסום.
  4. הכינו תמיסת מלאי BODIPY 493/503 של 500 מיקרוגרם/מ"ל: המסו 1 מ"ג של BODIPY 493/503in 2 מ"ל של ממס (90% DMSO; 10% 1x PBS). יש להגן מפני אור. סוניק באמבטיה קולית במשך 1 שעות (9.5-10 W) ב 37 ° C.
    הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 יום לפחות.
  5. הכינו את תמיסת הצביעה BODIPY (1 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי BODIPY 493/503 ו-0.1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל) ל-997.9 מיקרוליטר של 1x PBS.
  6. דגור על המגלשות (75 מיקרוליטר/מגלשה) עם BODIPY 493/503 (1 מיקרוגרם/מ"ל) ו-DAPI (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-RT למשך 40 דקות.
    הערה: השאר את השקופיות בחושך משלב זה ואילך.
  7. שטפו את המגלשות עם 1x PBS (3x למשך 5 דקות כל אחת).
  8. הרכיבו את המגלשות עם כיסויים באמצעות אמצעי הרכבה פלואורסצנטי, אפשרו להן להתייבש במשך 30 דקות ואטמו אותן בלק.
    הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.

5. כימות שומנים

  1. מדדו את רמות הכולסטרול הכולל והTG בסרום באמצעות שיטה וציוד אוטומטיים ומתוקפים.
  2. למדוד את רמות TG בכבד באמצעות ערכת בדיקה קולורימטרית טריגליצרידים (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן.

6. רכישת תמונות

  1. הנח את השקופית על מחזיק השקופיות של המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק בלייזר.
  2. להדמיה ורכישה של תמונה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה אובייקטיבית של 20x (plan-apochromat: 20x/0.8).
  3. כדי למנוע דיבור צולב בין BODIPY 493/503 ו- DAPI, השתמש במצב סריקה רציף (האות הטוב ביותר) בתוכנת קונפוקל.
  4. הפעל את BODIPY 593/503 באמצעות קו לייזר ארגון 488 ננומטר ואת DAPI באמצעות קו לייזר 405 ננומטר. הגדר את טווחי הפליטה על 493-589 ננומטר עבור BODIPY 493/503 ועל 410-464 ננומטר עבור DAPI.
  5. השתמש בהגדרות הבאות: חור סיכה: 1 AU, רזולוציה: 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים, עומק סיביות: 12, גודל פיקסל: 0.415 מיקרומטר, מצב דו-כיווני, מהירות סריקה: 7 (~ 1.58 μs לפיקסל למטרה של 20x), ממוצע קו: 2x וזום דיגיטלי: 1.
    הערה: פרמטרי הסריקה הנ"ל חייבים להיות מותאמים לכל מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה בשימוש.
  6. הגדר את הרווח ואת הרווח הדיגיטלי כראוי כך שלא יזוהו פיקסלים רוויים במחוון הטווח.
    הערה: תקן את אות הרקע על-ידי התאמת ההסטה.
  7. לאחר זיהוי נכון של ה- LDs, רכוש את התמונה עם ערוצי BODIPY ו- DAPI.
    הערה: יש לרכוש את כל התמונות באותם תנאים (חשיפה והגדרות כלליות) עבור כל ערוץ צבע.
  8. ליצירת תמונות בשטח רחב (איור 2), שנו את המטרה לעדשה אובייקטיבית a10x (plan-neofluar: 10x/0.3).
  9. בחר במצב סריקת אריחים וצור פסיפסים של 5 לכל 5 תמונות.
    הערה: בעבודה זו, לכל אריח הייתה חפיפה של 10% כדי למזג כראוי את האריחים לניתוח.
  10. כדי ליצור תצוגות תלת-ממדיות ואורתוגונליות (איור 3A), הניחו טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי, ושנו את המטרה לעדשה אובייקטיבית של 40x (שמן plan-neofluar: 40x/1.30).
  11. בחר במצב Z-Stack, ועל-ידי התאמת מישור Z, הגדר את המיקום הראשון והאחרון לרכישה באמצעות פרוסה אופטית בעובי אופטימלי (~0.5 מיקרומטר) כדי להבטיח שכל הטיפות יילכדו.
    הערה: כדי להאיץ את רכישת התמונה ולהימנע מהלבנה, ניתן לכוונן את הפרוסה האופטית לגודל לא אופטימלי, מה שמבטיח דגימת יתר של לפחות 30% לשחזור תלת-ממדי טוב.
  12. בחר במודול Ortho וצור תצוגות אורתוגונליות.
  13. קבל תמונות תלת-ממדיות על-ידי בחירת מודול התלת-ממד הבא אחר מצב עיבוד שקיפות עם תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי.

7. ניתוח תמונות

  1. עבד ונתח את התמונות במישור יחיד (הגדלה של פי 20) באמצעות CellProfiler (גרסה 4.2.5).
    הערה: הצינור ששימש בעבודה זו הותאם מ- Adomshick et al.45.
  2. לחץ על מודול התמונות בפינה השמאלית העליונה של חלון CellProfiler, והעלה את התמונות כקבצי .tiff.
  3. השתמש במודול NamesAndTypes כדי למיין בין תמונות מוכתמות BODIPY (droplet) ו- DAPI (גרעינים) בהתבסס על שמות הקבצים. בצע את ניתוח LD רק עם תמונות מוכתמות BODIPY.
  4. כדי להתחיל את קונסטרוקציית הצינור, לחץ על התאמת מודולים, ובחר את המודול ColorToGray כדי להמיר את התמונות לתמונות בגווני אפור.
    הערה: כדי לזהות אובייקטים, נדרשות תמונות בגווני אפור.
  5. זהה טיפות על-ידי שימוש במודול IdentifyPrimaryObjects באמצעות התמונה בגווני אפור.
    הערה: יש להתאים את הפרמטרים במודול זה כדי להשיג זיהוי LD טוב. בעבודה זו, הגדרת LDs בגודל שבין 6 פיקסלים ל-300 פיקסלים ומקדם תיקון סף של 1.0 הובילה לזיהוי המדויק ביותר.
  6. למדידת עוצמת הפיקסלים של טיפות השומנים שזוהו, הוסיפו מודול MeasureObjectIntensity .
  7. הוסף מודול FilterObjects נוסף כדי להבטיח שרק האותות החזקים ביותר מכומתים בעוד שאותות פחות אינטנסיביים אינם נכללים בניתוח טיפות השומנים הסופי (עוצמה מינימלית: 0.15; עוצמה מרבית: יחידה שרירותית אחת).
  8. כדי למדוד את רכיבי LD הקשורים לנתוני הפלט, הוסף את מודול MeasureObjectSizeShape .
  9. הוסף מודול OverlayOutlines בשלב זה כדי לכסות את הטיפה המזוהה על התמונה המקורית, ובכך להבטיח שהסגמנטציה תיראה מדויקת גם בתמונה הלא מעובדת.
    הערה: זהו שלב אופציונלי (בקרת איכות).
  10. הוסף מודול ExportToSpreadsheet בסוף ולחץ על כפתור ניתוח תמונות בפינה השמאלית התחתונה.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. בטא את התוצאות כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (S.E.M.) באמצעות כל יישום תוכנה לניתוח סטטיסטי.
    הערה: במחקר זה, תוכנת GraphPad שימשה לניתוח סטטיסטי.
  2. לנתח את התפלגות הערכים באמצעות מבחן Kolmogorov-Smirnov כדי להעריך סטיות משמעותיות מן הנורמליות. נתח את הנתונים הפרמטריים באמצעות מבחן t לא מזווג של התלמיד.
    הערה: ערכים של p < 0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הביצוע המוצלח של טכניקה זו אמור לגרום לצביעת טיפות שומנים ברורות לצורך אפיון סימולטני של מורפולוגיית LD (צורה וצפיפות ליבת שומנים בהתבסס על שחזור תלת-ממדי) יחד עם הפיזור המרחבי שלהם, מספר לשטח כולל וגודל ממוצע (מוערך עם הצינור המתואר לעיל, איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות להערכת LD נועד לפתח גישת הדמיה חדשה להערכת סטאטוזיס בכבד. בהתחשב בקורלציה החזקה בין השמנת יתר למחלת כבד שומני, הדיאטה עתירת השומן בסגנון מערבי שימשה לביסוס מודל חייתי של סטאטוזיס כבד26. עלייה חזקה בתכולת TG בכבד אושרה על ידי ערכת בדיקה כמותית של טריגליצרידים קולורימטריים, אשר הציעה תרחיש ליפידוזיס מוגבר בכבד בבעלי חיים הניזונים מ- HFD. לאחר מכן, מידת הצטברות LD הודגמה על ידי הבדיקה הפלואורסצנטית BODIPY 493/503 תחת הגדלה נמוכה. כצפוי, צביעת BODIPY 493/503...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי קרנות לאומיות ואירופיות באמצעות קרן המדע והטכנולוגיה הפורטוגזית (FCT), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ו- POCI-01-0145-FEDER-007440. המחברים רוצים להודות על התמיכה של iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, מתקן של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קוימברה וחבר בתשתית הלאומית PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), כמו גם תמיכה של FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות סיליקון 1.6 מ"מ I.D, סט טפטוף מיני IVפישר סיינטיפיק
4,4-דיפלואורו-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, ליון, צרפתD3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)בדיקות מולקולריות בע"מ, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70% אתנולHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.משמש לעיצוב הדמויות
מנתח אוטומטי היטאצ'י 717Roche Diagnostics Inc., מנהיים, גרמניה8177-30-0010
עט מחסום (חוסם נוזלים סופר פאפ עט)Daido Sangyo Co., Ltd, Japon_
BladeLeica221052145בשימוש בפרופיל תא קריוסטט
גרסה 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/משמש לניתוח התמונות
CoverslipsMenzel-Glaser, Germany_
CryomoldsTissue-Tek_
Cryostat (כולל דיסק דגימה ומחלץ חום) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, ליון, צרפתD-8418משמש להמסת Bodipy לתמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל. זהירות: רעיל
ודליק. אדים עלולים לגרום לגירוי
. מניפולציה במכסה מנוע אדים
. הימנע ממגע ישיר עם העור.
יש ללבוש כפפות גומי, משקפי מגן לעיניים
.
מיכל קרח יבש (מצנן קלקר)NovolabA26742
מלקחיים DumontFine Science Tools, גרמניה11295-10
צלחת פטרי מזכוכית (H 25 מ"מ, ø
150 מ"מ)		Thermo Scientific150318משמש לשקילת הכבד לאחר דיסקציה
GlycergelDAKO OmnisS303023
תוכנת GraphPad Prism, גרסה 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ארה"ב
דיאטה עתירת שומןEnvigo, ברצלונה, ספרדMD.08811
קטמין (Nimatek  100 מ"ג/מ"ל)Dechra791/01/14DFVPTבשימוש בריכוז סופי של 75 מ"ג/ק"ג
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי  (יחידת גילוי קוואזר; )Carl Zeiss, גרמניהLSM 710 Axio Observer Z1 מיקרוסקופ
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTבשימוש בריכוז סופי של 1 מ"ג/ק"ג
מחט BD מיקרולנס300635
מס' 15 אזמל פלדת פחמן סטרילית
להב		Swann-Morton205
מטרות 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) ו-40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  קרל זייס, גרמניה
מברשות צבעואן בלייסוויק אמזון B07W7KJQ2X  משמש לטיפול בחתכים
משאבה פריסטלטית (Minipuls 3)Gilson1004170
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH ~ 7.4)Sigma-Aldrich, ליון, צרפתP3813
ידית אזמל, 125 מ"מ (5 אינץ'), מס' 3Swann-Morton0208
מערכת צביעת שקופיות StainTraySimport ScientificM920
תזונה סטנדרטית  Mucedola4RF21
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותMenzel-Glaser, גרמניהJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT הרכבה מדיהVWR CHEMICALS361603E
טריגליצרידים ערכת בדיקה קולורימטריתקיימן כימי10010303
אמבט אולטרסאונדBandelin Sonorex TK 52
Vannas Spring מספריים - 3 מ"מ
חדשני Fine Science Tools, גרמניה15000-00
ZEN Black softwareZeiss
שנרכשוקרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128(2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224(2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242(2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092(2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768(2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42(2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358(2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774(2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808(2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718(2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BODIPYCell Profiler

מאמרים קשורים