Method Article

שימוש בהליכון עכבר לכימות תפקוד לקוי של מנוע עכבר במודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צינור ניסיוני לתיאור כמותי של דפוס הלוקומוטור של עכברים ההולכים בחופשיות באמצעות ארגז הכלים MouseWalker (MW) מסופק, החל מהקלטות וידאו ראשוניות ומעקב ועד ניתוח לאחר כימות. מודל פגיעה בחוט השדרה בעכברים משמש כדי להדגים את התועלת של מערכת MW.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצוע תוכניות מוטוריות מורכבות ומתואמות מאוד, כגון הליכה וריצה, תלוי בהפעלה קצבית של מעגלים בעמוד השדרה ובמעגלים העל-שדרתיים. לאחר פגיעה בעמוד השדרה החזי, התקשורת עם מעגלים במעלה הזרם נפגעת. זה, בתורו, מוביל לאובדן קואורדינציה, עם פוטנציאל התאוששות מוגבל. לפיכך, כדי להעריך טוב יותר את מידת ההחלמה לאחר מתן תרופות או טיפולים, יש צורך בכלים חדשים, מפורטים ומדויקים יותר לכימות הליכה, תיאום גפיים והיבטים עדינים אחרים של התנהגות מוטורית במודלים של בעלי חיים של פגיעה בחוט השדרה. במהלך השנים פותחו מספר בדיקות להערכה כמותית של התנהגות הליכה חופשית במכרסמים; עם זאת, הם בדרך כלל חסרים מדידות ישירות הקשורות לאסטרטגיות הליכה צעד, דפוסי טביעת רגל וקואורדינציה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, מסופקת גרסה מעודכנת של MouseWalker, המשלבת מסלול הליכה מתוסכל של השתקפות פנימית כוללת (fTIR) עם תוכנת מעקב וכימות. מערכת קוד פתוח זו הותאמה לחילוץ מספר פלטים גרפיים ופרמטרים קינמטיים, ומערכת של כלים לאחר כימות יכולה להיות לנתח את נתוני הפלט שסופקו. כתב יד זה גם מדגים כיצד שיטה זו, בשילוב עם מבחנים התנהגותיים שכבר נקבעו, מתארת כמותית ליקויים מוטוריים בעקבות פגיעה בחוט השדרה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התיאום היעיל של ארבע גפיים אינו ייחודי לבעלי חיים מרובעים. תיאום פורלימב-גפיים אחוריות בבני אדם נותר חשוב לביצוע מספר משימות, כגון שחייה ושינויים במהירות תוך כדי הליכה1. קינמטיגפיים שונים 2 ותוכנית מוטורית 1,3,4, כמו גם מעגלי משוב פרופריוצפטיביים5, נשמרים בין בני אדם ליונקים אחרים ויש לשקול אותם בעת ניתוח אפשרויות טיפוליות להפרעות מוטוריות, כגון פגיעה בחוט השדרה (SCI)6,7,8.

על מנת ללכת, מספר קשרים בעמוד השדרה מהגפיים הקדמיות והאחוריות צריכים להיות מחווטים כראוי ומופעלים בקצב, מה שדורש קלט מהמוח ומשוב מהמערכת הסומטוסנסורית 2,9,10. קשרים אלה מגיעים לשיאם במחוללי הדפוסים המרכזיים (CPGs), הממוקמים ברמה צווארית ומותנית עבור הגפיים הקדמיות והאחוריות, בהתאמה 1,9,10. לעתים קרובות, לאחר SCI, שיבוש הקישוריות העצבית והיווצרות צלקת גלייה מעכבת12 מגבילים את התאוששות התפקוד המוטורי, כאשר התוצאות משתנות משיתוק מוחלט לתפקוד מוגבל של קבוצת גפיים בהתאם לחומרת הפציעה. כלים לכימות מדויק של תפקוד לוקומוטורי לאחר SCI הם קריטיים למעקב אחר התאוששות והערכת ההשפעות של טיפולים או התערבויות קליניות אחרות6.

המבחן המטרי הסטנדרטי עבור מודלים של קונטוזיה של עכבר SCI הוא סולם עכבר באסו (BMS)13,14, ציון לא פרמטרי הלוקח בחשבון את יציבות תא המטען, מיקום הזנב, דריכה פלנטרית וקואורדינציה בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות בזירת שדה פתוח. למרות BMS הוא אמין ביותר עבור רוב המקרים, זה דורש לפחות שני מעריכים מנוסים כדי לבחון את כל זוויות התנועה של בעלי חיים על מנת להסביר את השונות הטבעית ולהפחית הטיה.

בדיקות אחרות פותחו גם כדי להעריך את הביצועים המוטוריים לאחר SCI באופן כמותי. אלה כוללים את מבחן rotarod, אשר מודד את הזמן המושקע על גליל מסתובב15; הסולם האופקי, המודד את מספר המעקות שהוחמצו והסולם החיובי תופס16,17; ומבחן הליכת הקרן, המודד את הזמן שלוקח לבעל חיים ואת מספר הכשלים שהוא עושה בעת חציית קורה צרה18. למרות שהן משקפות שילוב של ליקויים מוטוריים, אף אחת מהבדיקות הללו אינה מייצרת מידע מוטורי ישיר על תיאום הגפיים הקדמיות-אחוריות.

כדי לנתח באופן ספציפי ויסודי יותר את התנהגות ההליכה, פותחו בדיקות אחרות כדי לשחזר מחזורי צעדים ואסטרטגיות הליכה. דוגמה אחת היא מבחן טביעת הרגל, שבו כפות הדיו של בעל חיים מציירות תבנית על גיליון נייר לבן19. למרות שהוא פשוט בביצועו, חילוץ פרמטרים קינמטיים כגון אורך צעד הוא מסורבל ולא מדויק. יתר על כן, היעדר פרמטרים דינמיים, כגון משך מחזור הצעדים או תיאום בתזמון רגליים, מגביל את יישומיו; ואכן, פרמטרים דינמיים אלה ניתן לרכוש רק על ידי ניתוח פריים אחר פריים קטעי וידאו של מכרסמים הולכים על משטח שקוף. עבור מחקרי SCI, החוקרים ניתחו התנהגות הליכה מנקודת מבט רוחבית באמצעות הליכון, כולל שחזור מחזור הצעדים ומדידת השינויים הזוויתיים של כל מפרק רגל 4,20,21. למרות שגישה זו יכולה להיות אינפורמטיבית ביותר6, היא נשארת ממוקדת בקבוצה ספציפית של גפיים וחסרה תכונות הליכה נוספות, כגון קואורדינציה.

כדי למלא את הפערים הללו, פיתחו המרס ועמיתיו מבחן כמותי המבוסס על חיישן מגע אופטי באמצעות fTIR (fTIR)22 מתוסכל. בשיטה זו, האור מתפשט דרך זכוכית באמצעות השתקפות פנימית, מתפזר בלחיצת כפות, ולבסוף נלכד על ידי מצלמה במהירות גבוהה. לאחרונה, גרסת קוד פתוח של שיטה זו, בשם MouseWalker, הפכה זמינה, וגישה זו משלבת מסלול fTIR עם חבילת תוכנת מעקב וכימות23. באמצעות שיטה זו, המשתמש יכול לחלץ קבוצה גדולה של פרמטרים כמותיים, כולל דפוסי צעד, מרחב והליכה, מיקום טביעת רגל ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, כמו גם פלטים חזותיים, כגון דפוסי טביעת רגל (המחקים את בדיקת כף הדיו6) או שלבי עמידה ביחס לציר הגוף. חשוב לציין, בשל אופי הקוד הפתוח שלו, ניתן לחלץ פרמטרים חדשים על ידי עדכון חבילת הסקריפט של MATLAB.

כאן, ההרכבה שפורסמה בעבר של מערכת MouseWalker23 מתעדכנת. תיאור כיצד להגדיר אותו מסופק, עם כל השלבים הנדרשים כדי להשיג את איכות הווידאו הטובה ביותר, תנאי מעקב ורכישת פרמטרים. כלים נוספים לאחר הכימות משותפים גם כדי לשפר את הניתוח של ערכת נתוני הפלט של MouseWalker (MW). לבסוף, התועלת של כלי זה מודגמת על ידי קבלת ערכים הניתנים לכימות עבור ביצועים מוטוריים כלליים, במיוחד מחזורי צעדים ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, בהקשר של פגיעה בחוט השדרה (SCI).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הטיפול, הניתוח והטיפול שלאחר הניתוח אושרו על ידי הוועדה הפנימית המולקולרית של המכון הרפואי (ORBEA) וועדת האתיקה הפורטוגזית לבעלי חיים (DGAV) בהתאם להנחיות הקהילה האירופית (הנחיה 2010/63/EU) והחוק הפורטוגלי לטיפול בבעלי חיים (DL 113/2013) תחת רישיון 0421/000/000/2022. נקבות עכברי C57Bl/6J בנות 9 שבועות שימשו במחקר הנוכחי. כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר בעלי החיים ולהפחית את סבלם של בעלי החיים ששימשו במחקר. סקריפט MATLAB והגרסה העצמאית של תוכנת MW הם קוד פתוח וזמינים ב- GitHub
מאגר (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). בעוד שתוכנת MW פותחה ב-MATLAB R2012b, היא הותאמה לפעול ב-MATLAB R2022b. איור 1 ממחיש את זרימת העבודה של ה-MW.

1. הגדרת מנגנון MouseWalker (MW)

  1. להרכיב את מנגנון MW כפי שתואר קודם לכן23, או להתאים לצרכים הספציפיים של תכנון הניסוי (ראה טבלת חומרים ואיור משלים 1 לפרטים נוספים על ההתקנה).
    הערה: ניתן להרחיב את זירת ההליכה כדי להכיל בעלי חיים גדולים יותר, כגון חולדות.
  2. ודאו שהפרספקס שבו החיות הולכות נקי וללא שריטות. השתמשו במטלית ניקוי חלקה, וצמצמו את השימוש בממסים אורגניים כגון אמוניה או אתנול בריכוזים גבוהים, העלולים לפגוע בפרספקס (מומלץ 3% מי חמצן, 7% אתנול או כל חומר חיטוי תואם ומתאים לפרספקס). במידת הצורך, החלף את הפרספקס.
  3. הגדר את המצלמה במהירות גבוהה עם עדשה מהירה וצמצם גדול (כלומר, ערכי F-stop קטנים יותר) כדי ללכוד כמות גדולה של אור, מכיוון שהדבר מסייע להקליט את אותות fTIR (ראה רשימת חומרים).
    הערה: העדשה לא אמורה ליצור עיוותים אופטיים, במיוחד בקצות התמונה. ניתן לבדוק עיוותים אופטיים על ידי הקלטת תבנית ידועה (למשל, פסים או ריבועים) ולאחר מכן מדידת גודל הבלוקים ב- ImageJ/FIJI24 (השתמש בכלי הקו ולאחר מכן לחץ על נתח > מדידה). לדוגמה, ריבוע בגודל 1 ס"מ צריך להיות בעל מידות פיקסלים זהות הן במרכז התמונה והן בקצוות. הווריאציות צריכות להיות קטנות מ-5%.
  4. האירו את פס תאורת ה-LED הצבעוני מקופסת תאורת הרקע.
  5. האירו את פס תאורת הלד הלבן מקופסת תאורת השביל.
    הערה: ניתן להשתמש גם בנורית LED צבעונית25 כדי להקל על ההבחנה בין טביעת הרגל/גוף/רקע.
  6. כאשר אורות החדר כבויים, ודא את עוצמת האור של תיבת תאורת הרקע והשביל. התאימו את העוצמה, במידת הצורך, באמצעות פוטנציומטר או פלסטיק אטום למחצה. אלה חייבים להיות ממוטבים כך שעוצמת הפיקסלים תגדל בסדר הבא: גוף החיה < רקע < טביעות רגל.
    1. כדי לבדוק את עוצמת הפיקסלים של הגוף/רקע/טביעות הרגל של החיה, פתחו את רצף התמונות ב-ImageJ/FIJI24 ולחצו על Analyze > Measure. אות טביעת הרגל לא צריך להיות רווי יתר על המידה, שכן זה ימנע את הגדרת גבולות טביעת הרגל (כלומר, בהונות וכריות כף הרגל) (איור משלים 2).
  7. התאם את ניגודיות התמונה של השביל בתוכנת הקלטת הווידאו. ניתן לכוונן את הניגודיות בשתי דרכים: על ידי עמעום או הגדלת התאורה על פס ה-LED או על ידי התאמת מפתח הצמצם של עדשת המצלמה.
  8. מקם את העדשה בצורה נכונה כך שתהיה באותו גובה ובמרכז המראה המשקפת 45° ובניצב (90°) לשביל. זה ייצור תמונה פרופורציונלית כל הזמן לאורך שביל שמאל-ימין.
    הערה: הימנע משינוי מיקום המצלמה (מרחק, גובה וכיוון) במהלך הפעלות ההקלטה המרובות. במידת הצורך, סמנו את הרצפה שבה יש להציב את החצובה. פעולה זו תשמור על תכונות התמונה.
  9. מקדו את העדשה על פני הפרספקס. ניתן לבדוק זאת באמצעות חפץ שאינו מזיק הנוגע בפני השטח של הפרספקס.
    הערה: עם ערכי עדשת F-stop נמוכים יותר, עומק השדה יקטן יותר, ובכך יקשה על המיקוד.
  10. ודא שכל ההגדרות נשארות ללא שינוי במהלך הבדיקה, מכיוון שהן עשויות לשנות את עוצמת הפיקסלים של הסרטונים המוקלטים.

2. רכישת וידאו

  1. ודאו שהעכברים מכירים את החדר ואת המכשיר לפני הבדיקה. שמור לפחות יום אחד להרגלה (יום 0). כדי להימנע מאימון מוגזם, בצעו את מבחן MW ביום שונה משאר מבחני ההתנהגות (רצוי ביום שאחרי).
  2. בתוכנת הקלטת הווידיאו, ודא שלפחות 50 ס"מ מהשביל גלוי.
  3. התאם את הגדרות ההקלטה כדי לחתוך את אזור השביל. פעולה זו תקטין את גודל הווידיאו ותייעל את רכישת הווידאו.
  4. צלם תמונה או סרטון וידאו קצר של סרגל רגיל לפני כל הפעלה. מספר הפיקסלים לסנטימטר ישמש מאוחר יותר ב"חלון ההגדרות "כדי לכייל את הסרטונים.
  5. התחל את רכישת הווידאו, והנח את בעל החיים על קצה השביל על ידי אחיזה בבסיס הזנב כדי למנוע פציעות. ודא שבעלי החיים נעים קדימה לקצה הקיצוני של הרציף. בצע את הקלטות הווידאו עם לפחות 100 פריימים לשנייה כדי להבטיח מעברי הליכה חלקים.
    1. במידת הצורך, הניעו את בעלי החיים לנוע על ידי הקשה עדינה על קיר השביל או הצמדה/מחיאת כפיים באצבעות. עם זאת, הימנע נדנוד פיזי, שכן זה עלול להשפיע על התוצאות.
    2. שמור את הסרטונים ישירות כרצפי תמונות בתבנית TIFF (עם דחיסת LZW), JPEG או PNG. במקרה שהמצלמה מקליטה כקובץ MOV גולמי, המירו את הסרטונים לרצפי תמונות על ידי פתיחת הקובץ ב- ImageJ / FIJI24 ולחיצה על קובץ > שמירה כרצף תמונה > (או באמצעות תוכנה אחרת, כגון LosslessCut25).
      הערה: רוב בעלי החיים מתחילים ללכת מיד לאחר שהוכנסו לשביל; לכן, מומלץ להתחיל את רכישת הווידאו לפני הצבת החיה.

3. הכנת הסרטונים לתוכנת המעקב MW

  1. צלם מספיק ריצות שלמות של כל עכבר בודד. מספר בעלי החיים שיש לצלם בכל מצב ומספר הריצות השלמות חייבים להיקבע בהתאם לכל תכנון ניסוי. ריצה מלאה היא כאשר העכבר הולך את כל 50 הס"מ של השביל ללא עצירות ממושכות (בניסוי זה נבחרו שלוש ריצות שלמות).
    הערה: בהתאם לתוכנה לרכישת תמונות, ייתכן שיהיה צורך לחתוך סרטונים להחזר ההשקעה הקטן ביותר. זה יגדיל את מהירות המעקב וייצור הפלט.
  2. ב- ImageJ/FIJI24, בחר את המסגרות שבהן העכבר נמצא על המסך על-ידי לחיצה על Image > Stack > Tools > Make a substack. המעקב על MW דורש את הראש ואת הזנב להיות גלוי בכל המסגרות. ניתן, עם זאת, ליצור מספר ערימות משנה מהקלטת וידאו אחת, שתייצג מאוחר יותר כל ריצה.
  3. שמור כל ערימת משנה בנפרד בתיקיות שונות על-ידי לחיצה על File > Save as > Image sequence. תוכנת MW יוצרת מאוחר יותר תיקיית משנה באופן אוטומטי בכל ספרייה בכל פעם שמתחילים לנתח ריצה.

4. מעקב

  1. פתח את MATLAB, הוסף את התיקיה המכילה את סקריפט MW לספריית העבודה והפעל את "MouseWalker.m" בשורת הפקודה הראשית.
    הערה: השימוש בתוכנת MW תחת MATLAB מאפשר להציג הודעות שגיאה עוקבות במסוף הראשי של MATLAB ולבחור את נתוני הפלט הרצויים (על ידי פתיחת קובץ הסקריפט הראשי "MouseEvaluate.m" ושינוי היציאות ל- 1 או 0: קובץ Excel, תרשימי צעד, עקבות עמידה ודפוסי הליכה).
  2. טען את תיקיית הווידאו כ"ספריית קלט". אפשר גם לבחור את תיקיית הפלט; עם זאת, זו אינה דרישה מכיוון שתוכנת MW יוצרת תיקייה חדשה בשם "תוצאות" באופן אוטומטי בתוך "ספריית הקלט".
  3. באמצעות החצים "<<", "<", ">>" ו- ">" בדוק אם מסגרות הווידאו נטענות כראוי בתוך תוכנת MW.
  4. עבור אל "חלון הגדרות" שבו נמצאים כל פרמטרי הכיול והסף. הגדרות אלה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת הפיקסלים של הרקע וטביעות הרגל, כמו גם לגודל המינימלי של הגוף וטביעות הרגל, בין גורמים אחרים (ראו דוגמה באיור משלים 2). בדוק את ההשפעה של שינוי פרמטרים מסוימים על ידי לחיצה על תצוגה מקדימה לחצן.
    1. השתמש בסגנונות העלילה השונים, כולל "גוף + רגליים + זנב", "גוף בלבד", "רגליים בלבד" ו"זנב בלבד", כדי לסייע בהבחנה בין חלקי גוף לאחר התאמת פרמטרי הסף.
    2. נצל את הכלים בחלונית הימנית כדי למדוד את הבהירות או הגודל (באמצעות לחצני "בהירות" ו"סרגל", בהתאמה). ניתן לשמור את כל ההגדרות כ"ברירת מחדל" כל עוד מרחק המצלמה נשאר זהה.
  5. לאחר התאמת פרמטרי הסף, בדוק שהסרטון מוכן למעקב אוטומטי. עבור למסגרת הראשונה ולחץ על אוטומטי כדי להתחיל לעקוב. ניתן לבצע שלב זה בזמן אמת, והוא אורך מספר דקות, בהתאם לגודל הווידאו וביצועי המחשב.
    1. אם המעקב האוטומטי מתייג באופן שגוי את תכונות הגוף, בטל את המעקב האוטומטי, הזן הגדרות חדשות והפעל מחדש את התהליך.
  6. לאחר השלמת המעקב, בדוק אם יש צורך בתיקון ידני. לתיקון, השתמש בחלונית האמצעית כדי לבחור או לבטל את הבחירה, וציין את המיקום של טביעות כף הרגל הימנית הקדמית (RF), האחורית הימנית (RH), השמאלית הקדמית (LF) והשמאלית האחורית (LH), הראש, האף, הגוף (מחולקים לשני מקטעים) ומיקום הזנב (מחולק לארבעה מקטעים). שמור את השינויים על-ידי לחיצה על להציל לחצן.
    הערה: כל הלחצנים ורוב הפקודות כוללים קיצור מקשים (עיין במדריך המשויך לקבלת פרטים23). כדי להקל על גלילת וידאו וביצוע קיצורי מקשים, ניתן להשתמש בבקר חומרה עם לחצנים הניתנים לתכנות וגלגל מעבורת כמו Contour ShuttlePro V2.
  7. לחץ על הערכה כדי ליצור את קבצי הפלט מהסרטון במעקב. בהתאם לפלט הרצוי שנבחר (ראה שלב 4.1), שלב זה עשוי להימשך מספר דקות.
  8. ודא שכל חלקות נתוני הפלט הגרפיות נשמרות בתיקייה "תוצאות". ודא את דיוק המעקב על ידי בחינת חלק מהיציאות הגרפיות, כגון "עקבות עמידה", שם ניתן לבדוק אם כל תנוחות הכפות עקביות.
    1. אם מזוהה שגיאה, תקן ידנית את המעקב (אם ניתן; אחרת, בטל את התיקיה "תוצאות" ובצע שוב את המעקב האוטומטי עם הגדרות חדשות) ולחץ שוב על הפקודה הערכה .
  9. בדוק שכל המדידות הכמותיות שנוצרו על ידי תוכנת MW נשמרות בגיליון אקסל ומסוכמות ב- "1. Info_Sheet". ודא שאפשרויות Excel עבור תיחום הנוסחאות תואמות לקובץ ה- Script. המפריד העשרוני חייב להיות ",", ומפרידי אלף חייב להיות ";".
  10. השתמש בסקריפט "MouseMultiEvaluate.m" כדי לרכז את המדידות מכל הריצות לקובץ חדש לניתוח.
    1. כדי להתחיל, צור קובץ .txt המכיל את נתיבי התיקיות עבור כל הסרטונים (לדוגמה, "Videofiles.txt"). ודא שכל שורה תואמת לסרטון יחיד.
    2. לאחר מכן, כתוב "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" בשורת הפקודה. קובץ Excel בשם "ResultSummary.xls" ייווצר בספריית העבודה (ראה דוגמה במאגר GitHub).
      הערה: איור 2 מייצג את התפוקות הגרפיות המתקבלות על-ידי תוכנת MW מסרטוני הווידיאו של חיה מוקלטת אחת.

5. זרימת עבודה של ניתוח נתונים קינמטיים

  1. ערוך את גיליון Excel שנוצר בשלב 4.10, המכיל את הנתונים לעיבוד באמצעות סקריפטים Python שסופקו, בהתאם לדרישות המוקדמות הבאות.
    1. בכותרת העמודה הראשונה, ציין את תנאי הניסוי. תן שם לכל שורה לאחר שם הקבוצה/תנאי (אנשים מאותן קבוצות חייבים להיות בעלי שם זהה). הקבוצה הראשונה חייבת להיות הבקרה או הבסיס (זה חובה רק עבור התוויית מפת חום, שלב 5.6).
    2. בעמודה השניה, ציין את מזהה החיה. זה חובה, אם כי מידע זה לא ישמש ליצירת העלילה.
    3. בעמודה השלישית ואילך, בחר את הפרמטרים המוטוריים שישמשו לניתוח. ודא שהשורה הראשונה היא שם הפרמטר (שמות אלה יופיעו מאוחר יותר בחלקות).
  2. פתח את Anaconda Navigator, והפעל את Spyder כדי לפתוח את סקריפטי Python שסופקו.
    הערה: כל הסקריפטים פותחו עם Python 3.9.13, בוצעו עם Spyder 5.2.2 ב- Anaconda Navigator 2.1.4, והם זמינים בטבלת החומרים ובמאגר GitHub (שם כלולים חומרים נוספים, כגון דוגמת וידאו, קובץ דוגמה של Excel ומסמך שאלות נפוצות). ניתן לבצע את הסקריפטים מחוץ לנווט אנקונדה; עם זאת, ממשק משתמש גרפי זה ידידותי יותר למשתמש.
  3. השתמש ב- "Rawdata_PlotGenerator.py" כדי ליצור את חלקות הנתונים הגולמיים. זה יאפשר הדמיה של כל פרמטר כפונקציה של מהירות.
    1. פתח את "Rawdata_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. תרשימי הנתונים הגולמיים יופיעו במסוף ההתוויית (הלוח הימני העליון). כדי לשמור את המגרשים, לחץ על שמור תמונה או שמור את כל התמונות כפתור במסוף העלילה.
  4. השתמש בסקריפט "Residuals_DataAnalysis" כדי לחשב את השאריות לניתוח נתונים. סקריפט זה ייצור קובץ CSV עם חישובי השאריות עבור כל הפרמטרים המוטוריים.
    הערה: רבים מפרמטרי ההליכה הנמדדים על ידי MW משתנים עם המהירות (למשל, מהירות נדנדה, אורך צעד, משך עמידה, ישר עמידה ומדדי הליכה). לכן, מומלץ לבצע מודל רגרסיה המתאים ביותר של כל פרמטר בודד לעומת מהירות עבור הניסוי הבסיסי ולאחר מכן לקבוע את הערכים השיוריים עבור כל קבוצת ניסוי ביחס למודל רגרסיה זה. הנתונים מבוטאים אז כהפרש מהקו השיורי המנורמל26.
    1. פתח את "Residuals_DataAnalysis.py" בספיידר והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. שמור את קובץ ה- CSV באותה תיקיה שבה נמצאים הנתונים. חובה שהפקד (או תוכנית הבסיס) יהיה הקבוצה הראשונה בקובץ Excel.
  5. השתמש בסקריפט "PCA_PlotGenerator.py" כדי לבצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA).
    הערה: שיטת הפחתת ממדיות בלתי מפוקחת זו משמשת ליצירת ייצוג תמציתי יותר של 27,28,29 מהנתונים (איור 3A, B). קובץ ה-script של PCA כולל את השלבים הבאים. הנתונים מעובדים תחילה מראש על ידי מרכוז וקנה מידה, ולאחר מכן אלגוריתם PCA מחשב את מטריצת השונות המשותפת כדי לקבוע את המתאמים בין המשתנים ולחשב את הווקטורים העצמיים והערכים העצמיים של מטריצת השונות המשותפת כדי לזהות את המרכיבים העיקריים. שניים או שלושה המרכיבים העיקריים הראשונים נבחרים לייצוג הנתונים במגרשים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, בהתאמה. כל נקודה בחלקות מתאימה לחיה ומייצגת משתנה מופשט אחר. נקודות מקודדות בצבע משמשות להבחנה בין הקבוצות הספציפיות. ככאלה, אשכולות של נקודות משקפים דפוסי הליכה דומים המשותפים לאנשים המתאימים.
    1. פתח את "PCA_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. ודא שהתרשימים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של PCA מופיעים במסוף ההתוויית (לוח ימני עליון). כל צבע מייצג קבוצה אחרת, והמקרא מופיע ליד העלילה. כדי לשמור את העלילה, לחץ על שמור תמונה במסוף העלילה.
  6. השתמש "Heatmap_PlotGenerator.py" כדי ליצור מפת חום. ודא שמחולל מפת החום יוצר טבלה המציגה את ההבדלים הסטטיסטיים בין קבוצת הבסיס (או קבוצת הביקורת) לבין הקבוצות האחרות עבור כל פרמטר מוטורי27 (איור 4). כל עמודה מתארת קבוצה אחת, וכל שורה מתייחסת לפרמטר מוטורי מסוים.
    הערה: ניתוח סטטיסטי נערך עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey (עבור התפלגויות נורמליות) או ANOVA Kruskal-Wallis ואחריו מבחן פוסט-הוק של דאן (עבור התפלגות לא נורמלית). חריגים לא נכללו בניתוח. ערכי P מיוצגים על-ידי קוד צבע, כאשר גווני אדום וכחול מציינים עלייה או ירידה ביחס לבקרה (או לקו הבסיס), בהתאמה. גוון הצבע מייצג את המובהקות הסטטיסטית, כאשר צבעים כהים יותר מציגים מובהקות גבוהה יותר, וצבעים בהירים יותר מציגים מובהקות נמוכה יותר. מתאים P < 0.001; ** מתאים ל - P < 0.01; ו- * מתאים ל - P < 0.05. לבן מציין שאין וריאציה.
    1. פתח את "Heatmap_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. בחר את סוג הנתונים בחלון האוטומטי השני: נתונים גולמיים או נתונים שיוריים. אם אפשרות לא נבחרה, נתוני השארית הם ברירת המחדל.
    4. מפת החום תופיע במסוף העלילה (פאנל ימני עליון). כדי לשמור את העלילה, לחץ על שמור תמונה במסוף העלילה.
      הערה: חובה שהפקד (או התוכנית הבסיסית) יהיה הקבוצה הראשונה בקובץ Excel.
  7. השתמש "Boxplots_PlotGenerator.py" כדי ליצור את boxplots. כלי זה יאפשר יצירת קופסאות המייצגות את התפלגות הערכים עבור כל הפרמטרים המוטוריים עבור כל קבוצה (איור 5, איור 6 ואיור 7).
    הערה: כל תיבה מכילה את החציון כקו האמצעי, והקצוות התחתונים והעליונים של התיבות מייצגים את הרבעונים 25% ו- 75%, בהתאמה. השפם מייצג את טווח הנתונים המלא, למעט חריגים. חריגים מוגדרים ככל ערך שהוא פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני מתחת או מעל הרבעונים 25% ו-75%, בהתאמה.
    1. פתח את "Boxplots_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. בחר את סוג הנתונים בחלון האוטומטי השני: נתונים גולמיים או נתונים שיוריים. אם אפשרות לא נבחרה, נתוני השארית הם ברירת המחדל.
    4. הקופסאות יופיעו במסוף העלילה (פאנל ימני עליון). כדי לשמור את המגרשים, לחץ על שמור תמונה או שמור את כל התמונות כפתור במסוף העלילה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת BMS סטנדרטית מתארת את הגירעונות המוטוריים ברוטו לאחר SCI14. בשל אופיו הסובייקטיבי, בדיקות כמותיות אחרות מבוצעות בדרך כלל לצד BMS כדי לייצר הערכה מפורטת ועדינה יותר של תנועה. עם זאת, בדיקות אלה אינן מראות מידע ספציפי על מחזורי צעדים, דפוסי דריכה ותיאום בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות, שהוא חשוב ביותר להבנת האופן שבו מעגלי עמוד השדרה שומרים על תפקוד ומסתגלים למדע בדיוני חלקי. סעיף זה מראה כיצד ארגז הכלים של MW יכול לסייע בניטור התאוששות תפקוד המנוע לאחר SCI ולהוסיף מידע רלוונטי על התנהגות ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, הפוטנציאל של שיטת MouseWalker מודגם על ידי ניתוח התנהגות לוקומוטורית לאחר SCI. הוא מספק תובנות חדשות לגבי שינויים ספציפיים בדפוסי דריכה, טביעת רגל והליכה שאחרת היו מתפספסים במבחנים סטנדרטיים אחרים. בנוסף לאספקת גרסה מעודכנת של חבילת MW, כלי ניתוח נתונים מתוארים גם באמצעות סקריפטים Python שסופקו (ראה שלב 5).

מכיוון שה- MW מייצר מערך נתונים גדול ואוסף של פרמטרים קינמטיים המשקפים תהליך לוקומוטורי ממדי מאוד, נעשה שימוש ב- PCA; ואכן, PCA נמצא בשימוש נרחב במערכי נתונים קינמטיים אחרים הדומים לזה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ללאורה טאקר ונטשה לונקרביץ' על הערותיהם על כתב היד ועל התמיכה שניתנה על ידי מתקן המכרסמים של המכון המולקולרי לרפואה ז'ואאו לובו אנטונס. המחברים רוצים להודות על תמיכה כספית מ- Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) ל- L.S. ו- C.S.M. עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 ו- UIDP/04462/2020) ו- LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ל- C.S.M. L.S. נתמכה על ידי חוזה חוקר ראשי פרטני של CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ FCT (2020.08168.BD). A.M.M. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מ-FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (SFRH/BD/138636/2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>45º מראה 
2 שחול אלומיניום (2X2 ס"מ), גובה 16 ס"מ, 1 מכל צדשחול אלומיניום Misumi
2 (2X2 ס"מ), 23 ס"מ, @ 45° , 1 מכל צדשחול אלומיניום Misumi
1 (2X2 ס"מ), אורך 83 ס"מMisumi
מראה 87X23 ס"מ ספקזכוכית כללי 
מילוי קרטון שחור נייר מכתבים כלליהשתמשנו ב -2, אחד עם 69 x 6 ס"מ והשני עם 69 x 3 ס"מ כדי להגביל את ההשתקפות על המראה
< חזקה>תאורת רקע אחורית < / חזקה >
פרספקס 109 x 23 ס"מ (עובי 0.9525 ס"מ)ספק
2 שחול אלומיניום לרוחב (4 x 4 ס"מ), אורך 20 ס"מ, 1 מכל צדMisumi
רצועת LED צבעוניתחומרה כללי
נייר אטום לבן לכיסוי פרספקסספק נייר מכתבים כללי <
strong>fTIR בסיס תמיכה ועמודים
2 שחול אלומיניום (4 x 4 ס"מ), גובה 100 ס"מMisumi
60 x 30 ס"מ לוח לחם מטריEdmund Optics #54-641
ברגים M6 12 מ"מ אופטיקהאדמונד 
אגוזי משושה M6Edmund Optics 
<שביל חזק>fTIR 
109 x 8.5 ס"מ פרספקס (עובי 1.2 ס"מ)ספקפרספקס 109 x 8.5 ס"מ (עובי 1.2 ס"מ)
אורך 109 ס"מ אלומיניום תעלת U בסיסית עם 1.6 ס"מ גובה x 1.9 ס"מ עומק קיפולים (להחזקת הפרספקס)ספק
2 שחול אלומיניום לרוחב (4X4 ס"מ) אורך 20 ס"מ, 1 מכל צדMisumi
מילוי קרטון שחור ספק נייר מכתבים כלליהשתמשנו בשני חומרי מילוי מכל צד כדי לכסות את גבולות הפרספקס, תוך הימנעות מקצוות בהירים
<מצלמה חזקה>מהירה (על חצובה)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-Cזוהי המלצה. הדרישה היא להקליט לפחות 100 פריימים לשנייה
<חזק>Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor דיוק מערכות ומכשור בע"מ.#0400
<חזק>עדשה
Nikon AF זום-Nikkor 24-85 מ"מNikon#1929עדשה זו מומלצת, אולם ניתן להשתמש בעדשה אחרת. ודא שהוא מכיל צמצם גדול (כלומר, ערכי F-stop קטנים יותר), כדי ללכוד אותות fTIR
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 התוכנה Python
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
ספיידר - Spyder 5.1.5 לפרויקט ספיידר
<קיר שביל>חזק 
2 אקריליקה רקטלרית גדולה עם 100 על 15 ס"מכל חנות
2 אקריליק טרפזי לרוחב באורך 6-10 על גובה 15 ס"מכל חנות
'GitHub חומרים
שם תיקייהURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsScript ליצירת Boxplots
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docsמסמכים נוספים
מפת חוםhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsScript ליצירת מפת חום
סקריפט Matlathttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Scriptסקריפט Matlab של MouseWalker PCA
https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript לביצוע ניתוח רכיבים ראשיים
עלילות נתונים גולמיותhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plotsסקריפט ליצירת עלילות נתונים גולמיים
ניתוח שיוריhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysisקוד לחישוב שאריות מנתונים גולמיים
ספק חומרה כללי ספק חומרה כללי חומרה כלליברגים M6 12 מ"מ Edmund Optics קרן תורמים נוחות בריקולאז' נוחות בריקולאז

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MouseWalker SystemSpinal Cord InjuryLocomotor DysfunctionGait QuantificationMouse ModelMotor CoordinationKinematic AnalysisBehavioral AssaysOpen Source ToolsFootprint Patterns

Related Articles