מאמר שיטה

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/65211

⸱

10 במרץ 2023

 ,  ,  ,  , 
1National High-Throughput Crystallization Center, Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, The State University of New York

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט סינון התגבשות בתפוקה גבוהה, החל מהכנת 1,536 לוחות מיקרו-אסאי ועד לסוף חלון זמן ניסיוני של 6 שבועות. פרטים כלולים על הגדרת הדגימה, ההדמיה המתקבלת וכיצד משתמשים יכולים לבצע ניתוחים באמצעות ממשק משתמש גרפי התומך בבינה מלאכותית כדי לזהות במהירות וביעילות תנאי התגבשות מקרומולקולרית.

תקציר

קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן היא הטכניקה הנפוצה ביותר להבחנה במבנים מקרומולקולריים, אך השלב המכריע של גיבוש חלבון לסריג מסודר הניתן לעקיפה נותר מאתגר. התגבשות של ביומולקולות מוגדרת במידה רבה באופן ניסיוני, ותהליך זה יכול להיות עתיר עבודה ואוסר על חוקרים במוסדות מוגבלים במשאבים. במרכז הלאומי להתגבשות בתפוקה גבוהה (HTX), יושמו שיטות הניתנות לשחזור גבוה כדי להקל על צמיחת גבישים, כולל התקנה אוטומטית של לוחות מיקרו-אצווה מתחת לשמן בתפוקה גבוהה של 1,536 בארות שנועדה לדגום מגוון רחב של פרמטרים של התגבשות. לוחות מנוטרים באמצעות שיטות הדמיה חדישות במשך 6 שבועות כדי לספק תובנה לגבי צמיחת גבישים, כמו גם להבחין במדויק בין פגיעות קריסטל יקרות ערך. יתר על כן, יישום אלגוריתם ניקוד בינה מלאכותית מאומן לזיהוי פגיעות גבישיות, יחד עם ממשק קוד פתוח וידידותי למשתמש לצפייה בתמונות ניסיוניות, מייעל את תהליך ניתוח תמונות גידול הגבישים. כאן מתוארים נהלי המפתח והמכשור להכנת הקוקטיילים ולוחות ההתגבשות, הדמיה של הצלחות וזיהוי פגיעות באופן המבטיח יכולת שחזור ומגדיל את הסיכוי להתגבשות מוצלחת.

מבוא

אפילו בעידן של התקדמות עצומה בשיטות ביולוגיה מבנית, קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ממשיכה להיות שיטה אמינה ופופולרית ליצירת מודלים מבניים באיכות גבוהה של מקרומולקולות. מעל 85% מכל המודלים המבניים התלת-ממדיים המופקדים בבנק נתוני החלבונים (PDB) הם משיטות מבניות מבוססות גבישים (נכון לינואר 2023). 1 יתר על כן, קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן נותרה הכרחית לפתרון מבנים של ליגנד חלבון, מרכיב חיוני בתהליך גילוי ופיתוח התרופות2. למרות שהתגבשות חלבונים נותרה טכניקת הביולוגיה המבנית הדומיננטית במשך יותר מחצי מאה, שיטות לחיזוי סבירות התגבשות בהתבסס על תכונות פיזיקליות3 או רצף 4,5 עדיין בחיתוליהן.

החיזוי של תנאי התגבשות מעורפל עוד יותר; התקדמות מוגבלת נעשתה כדי לחזות תנאי התגבשות סבירים אפילו עבור חלבוני מודל 6,7. מחקרים אחרים ניסו לזהות תנאי התגבשות בהתבסס על הומולוגיה של חלבונים ותנאים שנכרו מה-PDB 8,9,10. עם זאת, כוח הניבוי שניתן למצוא ב-PDB מוגבל, מכיוון שרק תנאי ההתגבשות הסופיים והמוצלחים מופקדים, מה שמחמיץ בהכרח את ניסויי האופטימיזציה הנרחבים לעתים קרובות הנדרשים לכוונון עדין של גדילת הגבישים. יתר על כן, ערכי PDB רבים חסרים מטא-נתונים המכילים פרטים אלה, כולל נוסחאות הקוקטייל, פורמט ההתגבשות, הטמפרטורה והזמן להתגבשות11,12. לכן, עבור חלבונים רבים בעלי עניין, הדרך הנגישה ביותר לקבוע את תנאי ההתגבשות היא באופן ניסיוני, תוך שימוש בתנאים רבים ככל האפשר במגוון רחב של אפשרויות כימיות.

מספר גישות להפוך את סינון ההתגבשות לפורה ויסודי ככל האפשר נחקרו במידה רבה, כולל מטריצות דלילות 13, סינון פקטוריאלי לא שלם 14, תוספים 15,16, זריעה 17, וחומרי גרעין 18. מרכז HTX הלאומי במכון המחקר הרפואי האופטמן-וודוורד (HWI) פיתח צינור יעיל לבדיקת התגבשות באמצעות גישת מיקרו-אצווה מתחת לנפט19, המשתמשת בשיטות אוטומטיות לטיפול בנוזלים והדמיה כדי לייעל את הזיהוי של תנאי התגבשות ראשוניים באמצעות דגימות ונפחי קוקטייל מינימליים יחסית (איור 1). הסט של 1,536 קוקטיילים ייחודיים מבוסס על תנאים שנקבעו בעבר כתורמים לצמיחת גבישי חלבונים ומתוכנן להיות מגוון מבחינה כימית על מנת לדגום מגוון רחב של תנאי התגבשות אפשריים20,21,22. הדגימה הרחבה של תנאי התגבשות מגדילה את הסיכוי לצפות במוליך התגבשות אחד או יותר.

מעט ניתוחים רשמיים של מספר התנאים הדרושים לסינון הופיעו בספרות. מחקר אחד התמקד בפריסת הדגימה של מסכים שונים ומצא כי הדגימה האקראית של רכיבים (בדומה לפקטוריאל חלקי) מייצגת את שיטת הדגימה היסודית והיעילה ביותר23. מחקר אחר של בדיקות סקר ציין כי היו מקרים רבים שבהם מסך 1,536 יסודי מאוד הניב רק גביש אחד פגע24, ומחקר עדכני מאוד הדגיש כי רוב המסכים המסחריים דוגמים בחסר את מרחב ההתגבשות הידוע כקשור ללהיטי הקרנה25. לא כל מוליכי ההתגבשות יניבו גביש באיכות עקיפה המתאים לאיסוף נתונים עקב אי סדר מובנה בתוך הגביש, מגבלות עקיפה או פגמים גבישיים; לכן, ליציקת רשת רחבה יותר לתנאים יש יתרון נוסף של מתן צורות גבישיות חלופיות לאופטימיזציה.

גם לפורמט של ניסויי התגבשות חלבונים יש השפעה על הצלחת המסך. פיזור אדים הוא ההגדרה הנפוצה ביותר עבור יישומי התגבשות בתפוקה גבוהה והוא משמש במרכזי התגבשות חדישים, כולל EMBL המבורג ומכון פסטר מרכזי הקרנה בתפוקה גבוהה26,27,28. מרכז HTX משתמש בשיטת מיקרו-אצווה מתחת לשמן; אמנם פחות נפוצה, אך זוהי שיטה חזקה הממזערת את צריכת בקבוקי הדגימה וההתגבשות20,21,22. אחד היתרונות של שיטת מיקרו-אצווה מתחת לשמן, במיוחד כאשר משתמשים בשמן פרפין בצמיגות גבוהה, הוא שרק אידוי קל מתרחש בתוך הטיפה במהלך הניסוי, כלומר ריכוז שיווי המשקל מושג בעת ערבוב טיפות. אם תוצאות התגבשות חיוביות נצפות בשיטת מיקרו-אצווה מתחת לנפט, הרבייה של תנאים אלה היא בדרך כלל פשוטה יותר מאשר במערכי דיפוזיה של אדים, שבהם ההתגבשות מתרחשת בנקודה לא מוגדרת כלשהי במהלך שיווי המשקל בין טיפת ההתגבשות לבין המאגר. יכולת השחזור של פגיעות רצויה עבור גישות התגבשות בעלות תפוקה גבוהה, המייצרות גבישי חלבון זעירים להחריד שבדרך כלל צריכים להיות מותאמים לניסויי רנטגן חד-גבישיים.

מסך ההתגבשות בתפוקה גבוהה עבור חלבונים מסיסים מורכב מקוקטיילים המוכנים בתוך הבית, מסכים מסחריים מוכנים, ומסכים מסחריים מותאמים בבית22. הקוקטיילים פותחו בתחילה תוך שימוש באסטרטגיה פקטוריאלית חלקית תוך שימוש בקוקטיילים של התגבשות מוצלחת בעבר20. הריאגנטים במסך הזמינים מסחרית כוללים מערכים של פולימרים, מלחי התגבשות, PEG ושילובי יונים ומסכים המשתמשים במטריצה דלילה ובגישות פקטוריאליות חלקיות. ישנם גם ריאגנטים המשתנים לפני הכללתם במסך: מסך תוספת, מסך pH וחיץ, מסך תוסף נוזלי יוני ומסך פולימר.

כוחם של תנאי ואסטרטגיות התגבשות ידועים מונף ב-1,536 קוקטיילים של התגבשות, יחד עם היתרונות של מערכת מיקרו-אצווה מתחת לנפט כדי ליצור צינור המשתמש בטיפול אוטומטי בנוזלים, הדמיה אוטומטית של שדה בהיר והדמיה לא ליניארית מסדר שני של גבישים כיראליים (SONICC). האוטומציה של הטיפול בנוזלים וההדמיה מספקת את היתרונות של פחות שעות מעבדה רטובות ויכולת שחזור גבוהה יותר. אופי התפוקה הגבוהה של סינון התגבשות אוטומטי מחייב אוטומציה של תהליך הניטור לגדילת גבישים. התקדמות זו מושגת באמצעות טכנולוגיות הדמיה חדישות המסייעות בזיהוי פגיעות גבישים חיוביות. גם דימות סטנדרטי של לוחות בשדה בהיר, וגם שיטות מרובות פוטונים לגילוי משופר, משמשות באמצעות מערכת דימות גבישי עם SONICC (איור 2). SONICC משלבת מיקרוסקופ דור הרמוני שני (SHG)29 ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מעורר אולטרה סגול של שני פוטונים (UV-TPEF)30 כדי לזהות גבישים קטנים מאוד, כמו גם כאלה המוסתרים על ידי משקע. ההדמיה של SONICC מודיעה אם הבארות מכילות חלבון (באמצעות UV-TPEF) וגבישים (באמצעות SHG). מעבר לזיהוי חיובי של גבישי חלבון, ניתן לקבל מידע נוסף גם בשיטות הדמיה מתקדמות. הדמיה של קוקטייל בלבד לפני הוספת הדגימה משמשת כבקרה שלילית; תמונות אלה יכולות לזהות את מראה הבאר לפני הוספת הדגימה, כולל במונחים של גבישי מלח ופסולת. בנוסף, הדמיית SHG ו- UV-TPEF מסייעת להבדיל גבישי חלבון מגבישי מלח וניתן להשתמש בה להדמיית חומר מורכב של חומצות גרעיןחלבוניות 31.

ניסויי התגבשות בתפוקה גבוהה העוברים ניטור חוזר ונשנה באמצעות הדמיה גורמים לכמות גדולה מאוד של תמונות הדורשות בדיקה. שיטות אוטומטיות לניקוד גבישים פותחו כדי להפחית את העומס על המשתמש ולהגדיל את ההסתברות לזהות פגיעות קריסטל חיוביות. מרכז HTX השתתף בפיתוח אלגוריתם הניקוד MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO), ארכיטקטורת רשת עצבית קונבולוציונית עמוקה מאומנת שפותחה על ידי קונסורציום של שותפים אקדמיים, ללא כוונת רווח, ממשלתיים ותעשייתיים כדי לסווג תמונות באר ברייטפילד32. האלגוריתם אומן על כמעט חצי מיליון תמונות שדה בהיר מניסויי התגבשות ממוסדות מרובים תוך שימוש בשיטות התגבשות שונות ובתמונות שונות. האלגוריתם מפיק ציון הסתברותי המציין אם תמונה נתונה נופלת לארבע מחלקות תמונה אפשריות: "קריסטל", "ברור", "משקע" ו"אחר". ל-MARCO יש דיוק סיווג מדווח של 94.5%. זיהוי קריסטלים משופר עוד יותר באמצעות תוכנה המיישמת את האלגוריתם ומספקת ממשק משתמש גרפי (GUI) לצפייה נגישה ופשוטה בתמונות, המתאפשרת עם יכולות ניקוד32,33 המבוססות על בינה מלאכותית. ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מתוכנן לעבוד בצורה חלקה עם התקנת מערכת ההדמיה וניהול הנתונים במרכז HTX כדי לזהות פגיעות במסך של 1,536 בארות, עם מעורבות אנושית לבחינת הפלט של רשימות ממוינות. בנוסף, כתוכנת קוד פתוח הזמינה ב- GitHub, ממשק המשתמש הגרפי זמין לשינוי כדי לשקף את הצרכים הספציפיים של קבוצות מעבדה אחרות.

כאן, מתואר התהליך של הקמת ניסוי מיקרו-אצווה תחת שמן בתפוקה גבוהה באמצעות טיפול רובוטי בנוזלים כדי לספק הן את הקוקטייל והן את החלבון. במרכז HTX מערך ייחודי של מכשור ומשאבים שאינם נמצאים במוסדות אחרים, במטרה לספק שירותי מיון ומשאבים חינוכיים למשתמשים המעוניינים. הדגמת השיטות והיכולות של טכניקות רובוטיקה בעלות תפוקה גבוהה תאפשר לקהילה לקבל ידע בטכנולוגיות זמינות ולקבל החלטות עבור מאמצי קביעת המבנה שלהם.

פרוטוקול

1. הכנה או רכישה של קוקטיילים עבור שש עשרה בלוקים באר 96 באר עמוקה

  1. הכינו קוקטיילים כימיים שנוצרו במקום על ידי חלוקה לגושי באר עמוקה (DW) של 96 בארות. השתמש במטפל רובוטי בנוזלים כדי לחלק ולערבב תמיסות מלאי של מלחים, חוצצים, פולימרים ומים.
  2. הכינו קוקטיילים כימיים שעברו שינוי בבית באמצעות מטפל רובוטי בנוזלים או פיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף רכיבים נוספים למסכי בלוקים DW של 96 בארות שנרכשו באופן מסחרי.
  3. רכוש בלוקים DW זמינים מסחרית.
  4. אחסנו בלוקים עם תווית DW 96 באר בטמפרטורה של -20°C למשך 12-18 חודשים.
    הערה: הקוקטיילים שהוכנו בשלב 1.1. ו-1.2. מילוי 10/16 בלוקים DW 96 באר, ו 5/16 96 באר DW בלוקים משמשים כרכישות. בלוק DW אחד של 96 בארות במסך מוגדר בזמן חלוקת הלוח של 1,536 בארות כדי למנוע משקעים של מסך התוסף (ראה סעיף 3).

2. חלוקת הקוקטיילים לצלחות 384 בארות

  1. הפשיר את 96-באר DW בלוקים ב 4 °C (75 °F) במשך הלילה. מביאים לטמפרטורת החדר (20-23 מעלות צלזיוס) לפני תחילת הכנת הצלחות 384 באר.
    הערה: טמפרטורת החדר מתאימה להכנת צלחות הקוקטייל. הדאגה העיקרית בהכנת צלחות אלה היא להימנע משקעים, שעלולים לסתום מכשירים לטיפול בנוזלים ולהוביל לשינויים בלתי צפויים בריכוזי מרכיבי הקוקטייל.
  2. מערבבים היטב את הבלוקים על ידי היפוך לפי הצורך כדי להמיס כל שקע אטום מתמשך. אם בארות כלשהן מכילות שקע, חממו את הבלוקים ל -30 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס.
  3. ספק 50 מיקרוליטר של תמיסת קוקטייל מארבעה בלוקים של DW 96 בארות לצלחת אחת של 384 בארות באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים המצויד במזרק 96 או ראש פיפטור. ארבעת בלוקי ה-DW של 96 בארות מוטבעים בצלחת של 384 בארות כך שרבעים מלאים (לדוגמה, A1 של 96-DW1 עד A1 של 384-plate1, A1 של 96-DW2 עד B1 של 384-plate1 וכו'). (איור 3).
  4. ספק 15 מתוך 16 בלוקי DW של 96 בארות לצלחות של 384 בארות לאחסון.
  5. אחסנו את הצלחות בעלות 384 הקידוחים בטמפרטורה של 20°C למשך עד 6 חודשים לשימוש בהכנת הצלחות בעלות 1,536 הקידוחים.

3. הכנת 1,536 הצלחות עם שמן וקוקטיילי התגבשות

  1. ספק 5 μL של שמן פרפין לכל באר של צלחת 1,536 בארות באמצעות מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים עם יכולת שאיפה ואספקה איטיות. אחסנו את לוחות השמן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 6 חודשים.
  2. הפשירו את 384 הצלחות מקטע 2 ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הפוך את הלוחות כדי לערבב את התמיסות ולהמיס את המשקע. לדגור על הלוחות ב 30 ° C כדי להמיס משקעים קבועים.
  3. כדי להכין את רכיבי המסך התוסף, השתמש בבלוק DW הסופי של 96 בארות המכיל 0.1 M HEPES pH 6.8, 30% PEG3350 כדי לערבב עם מסך התוסף המסחרי באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים או פיפטה רב ערוצית.
  4. הכן את פתרונות המסך הנוסף על ידי ניפוק תערובת 1:1 של תמיסת PEG3350 האגירה שהוכנה בשלב 3.3 ומסך התוסף לנפח סופי של 50 μL בלוח המתאים של 384 בארות.
  5. השתמש ברובוט לטיפול בנוזלים המצויד במזרק 384 או ראש פיפטור כדי לספק 200 nL של תמיסת קוקטייל לכל באר של צלחת 1,536 בארות. החתימו ארבע צלחות של 384 בארות לתוך הלוח של 1,536 בארות כך שרבעים ימולאו (למשל, A1 של 384-לוחית1 עד A1 של צלחת 1,536 בארות, A2 של 384-לוחית1 עד A3 של צלחת 1,536 באר, וכו ') (איור 3).
  6. צנטריפוגה את הצלחות ב 150 × גרם במשך 5 דקות לפני אחסון ב 4 ° C עד 4 שבועות.

4. הגשת דוגמאות

  1. כדי לשלוח מדגם, שלח דוא"ל הזמנה לפני המועד האחרון להזמנה עבור ריצת הסינון הקרובה. כלול את מספר ניסויי הסינון, השם, ה- PI והמוסד, וכן דרישות טיפול מיוחדות עבור המדגם. ריצות הסינון מתבצעות בערך פעם בחודש, והתוצאה היא 12 ריצות בשנה.
  2. מלא טופס שליחת דוגמה לפני משלוח הדגימה.
    1. עבור משתמשים חדשים, בחר סיסמה שתשמש להורדת תמונות ההתגבשות בסעיף 7.
    2. עבור משתמשים מבוססים, השתמש בסיסמה קיימת או שנה את הסיסמה בשלב זה.
  3. שלח את הדגימה בצינור 1.5 מ"ל. ודא שהמקרומולקולה הומוגנית ומרוכזת מספיק כדי לקדם התגבשות. השתמש בבדיקת טרום התגבשות, המורכבת בדרך כלל מאמוניום סולפט או PEG 4,000, כדי לחקור את ריכוז הדגימה המתאים על ידי התבוננות אם ריכוזי הדגימה שנבדקו גורמים לטיפות ברורות או מזרזים34.
    הערה: בדיקות איכות מתאימות שניתן לבצע לפני שליחת הדגימה כדי לבדוק טוהר והומוגניות כוללות SDS-PAGE, סינון ג'ל ופיזור אור דינמי (DLS), בין היתר. התגבשות יכולה להיות מושפעת על ידי נוכחות של זיהומים קלים אפילו. נפח דגימה של 500 μL נדרש כיום כדי להקים צלחת אחת של 1,536 בארות. בדיקות מתבצעות כדי להקטין את דרישת נפח הדגימה.
    1. הימנע משימוש בריכוזי חיץ מעל 50 מילימול, כמו גם פוספטים, אשר עלולים להתגבש בתוך המסך.
    2. הימנע משימוש בחומרים מסיסים מדי, כולל ריכוזי גליצרול הגבוהים מ-10% w/v.
  4. ארוז את הדגימה כדי לשמור בבטחה על טמפרטורה מתאימה באמצעות קרח יבש, קרח רטוב או חבילות קירור במיכל אטום.
  5. עדיפות לדגימת אוניות במהלך הלילה בימים שני עד רביעי במהלך הריצה.
  6. שלח דוא"ל למספר המעקב לאחר שהדגימה נשלחה.

5. מערך לדוגמה בצלחות המוכנות של 1,536 בארות

  1. יש לפרוק דגימות ולדגור מיד בטמפרטורה שהמשתמש ביקש.
  2. לאחר ההפשרה, צנטריפוגה את הדגימה ב 10,000 × גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. התבונן חזותית בדגימה כדי לזהות משקעים, צבע ומצב הדגימה לפני ההגדרה.
  3. מחממים צלחת של 1,536 בארות ל-23°C וצנטריפוגה ב-150 × גרם למשך 5 דקות. דמיינו את צלחת הקוקטייל בלבד באמצעות הדמיה של brightfield כבקרה שלילית.
    הערה: כל הלוחות מצולמים עם הדמיית שדה בהיר לפני הגדרת הדגימה, המאפשרת זיהוי בארות שכבר יש בהן גבישים או פסולת לפני הוספת הדגימה כבקרה שלילית. יתר על כן, הוא מאפשר זיהוי בארות שבהן קוקטייל ההתגבשות לא נמסר. חימום הצלחת לטמפרטורת החדר מבטל את העיבוי על פני הצלחת, מה שמוביל לתמונות ברורות.
  4. יש לחלק 200 nL של דגימה לכל באר בצלחת של 1,536 בארות באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים. צלחת צנטריפוגה ב 150 × גרם ולוחות לדגור ב 4 ° C, 14 ° C, או 23 ° C.
    הערה: ניתן להגדיר ניסויי מיקרו-אצווה תחת שמן באופן ידני על ידי חלוקת החלבון והקוקטייל תחת השמן הרצוי. עם זאת, מומלץ להשתמש בלא פחות מ-1 מיקרוליטר של כל חלבון וקוקטייל כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור.

6. עקוב אחר לוחות 1,536 בארות ליצירת גבישים

  1. לאחר הוספת הדגימה ללוחות של 1,536 בארות, התמונה עם הדמיית שדה בהיר ביום 1 ובשבוע 1, בשבוע 2, בשבוע 3, בשבוע 4 ובשבוע 6.
  2. בצע הדמיה SONICC עם SHG ו- UV-TPEF בנקודת הזמן של 4 שבועות עבור צלחות מודגרות ב 23 ° C ובנקודת הזמן של 6 שבועות עבור צלחות מודגרות ב 14 ° C או 4 ° C.
    הערה: העיתוי להדמיית SONICC מתוכנן לנקודות זמן של 4 שבועות ו-6 שבועות עבור לוח המיקרו-אסאי בעל התפוקה הגבוהה של 1,536 מכיוון שבדרך כלל, גבישים יופיעו בנקודות זמן אלה. לצורך שינוי מיקרו-אצווה של 96 בארות תחת ניסויי דיפוזיה של שמן או אדים, מומלץ לבצע את הדמיית SONICC מוקדם יותר בחלון הזמן.
  3. גש לתמונות הניסיוניות שהועברו באופן אוטומטי לחשבון המשתמש באמצעות מערכת LIMS פנימית. הודע למשתמשים באמצעות daemon דוא"ל htslab אוטומטי כי ההדמיה התרחשה.

7. ניתוח תמונות

  1. אחזר את תמונות ההקרנה מאתר HWI ftp עבור כל קובץ .rar.
    הערה: פלט התמונה ממסך 1,536 יוצר מספר קבצים הכוללים תמונות שדה בהיר, תמונות SHG ותמונות UV-TPEF. כל שיטת הדמיה או נקודת זמן היא קובץ .rar נפרד. כל קובץ .rar, כאשר הוא נפרק, מכיל תמונה מכל באר של לוח 1,536 בארות בנקודת זמן מסוימת באמצעות שיטת הדמיה ספציפית.
    1. השתמש בלקוח FileZilla או באפשרויות אחרות כדי לגשת לנתוני FTP.
      הערה: לקוח FileZilla הוא הדרך המומלצת לניהול אמצעי האחסון הגדול של העברת קבצים כדי למזער קריסות חישוביות.
      1. אם יש להתקין את לקוח FileZilla במחשב המשתמש, הורד את תוכנת FileZilla.
      2. אם לקוח FileZilla כבר מותקן או בעת ההתקנה, לחץ על סמל FileZilla כדי לפתוח את התוכנה.
      3. היכנס לשרת ftp מרוחק מ- FileZilla על ידי הזנת אתר האינטרנט של FTP המארח, שם המשתמש והסיסמה.
      4. הורד את קבצי .rar לספרייה הרצויה.
  2. השתמש בממשק המשתמש הגרפי בקוד פתוח התומך בבינה מלאכותית כדי להציג, להבקיע ולנתח את תמונות ההתגבשות.
    הערה: ניתן להשתמש בממשק המשתמש הגרפי ברוב מערכות ההפעלה (OS) של Windows, Mac ו- Linux, והוראות ספציפיות למערכת ההפעלה להורדה נמצאות באתר GitHub. MARCO Polo הוא ממשק משתמש גרפי בקוד פתוח המשלב מטא נתונים ממסך התגבשות 1,536 בתפוקה גבוהה המיושם במרכז HTX. זה זמין לכל אחד להוריד מ- GitHub לשינוי כדי לשקף את הצרכים הספציפיים של קבוצות מעבדה אחרות.
    1. פתח את קובץ .rar בממשק המשתמש הגרפי לאחר הורדת הקובץ (ראה איור משלים S1).
      1. לחץ על ייבוא, בחר תמונות מהתפריט הנפתח ולאחר מכן בחר מארכיון/ספרייה של Rar.
      2. לחץ על Browse for Folder בחלון הקופץ, ולאחר מכן נווט אל התיקיה המכילה את התמונות.
      3. בחר את הקבצים הרצויים וייבא לממשק המשתמש הגרפי על ידי לחיצה על פתח. המתן עד שהקבצים יופיעו בחלון ' נתיבים שנבחרו' . בחר קובץ אחד או יותר להורדה לממשק המשתמש הגרפי ולחץ על ייבוא הפעלות.
    2. הצג את התמונה עבור הבאר הראשונה בחלון של מציג השקופיות בממשק המשתמש הגרפי על ידי לחיצה על סמל > משמאל לשם המדגם ולאחר מכן בחירת הקריאה המתאימה על ידי לחיצה כפולה עליו (קריאות מפורטות לפי תאריך וסוג של תמונה-brightfield, UV-TPEF או SHG).
    3. הגדל את התמונה על-ידי שינוי גודל החלון כולו. התיבה פרטי תמונה כוללת מידע אודות התמונה, כולל נתוני הניקוד (ריקים עד לציון הנקרא). התיבה פרטי קוקטייל מכילה מטא-נתונים אודות רכיבי הקוקטייל.
    4. עבור לבאר הבאה על ידי לחיצה על הלחצן הבא בחלונית הניווט או לחיצה על מקש חץ ימינה במקלדת. נווט לבאר ספציפית על-ידי הזנת מספר הבאר בחלון לפי מספר באר .
    5. הצג את כל הקריאות (של אלה שיובאו לממשק המשתמש הגרפי) על-ידי סימון התיבה הצג את כל התאריכים .
    6. הצג את כל הספקטרום (של אלה שיובאו לממשק המשתמש הגרפי) על-ידי סימון התיבה הצג את כל הספקטרה . לחץ על כפתור Swap Spectrum כדי להציג כל תמונת ספקטרום בנפרד.
  3. הניקוד של תמונות הגביש באמצעות אלגוריתם MARCO על-ידי הדגשת ריצה ספציפית מהרשימה בצד שמאל של החלון. לאחר מכן, לחץ על סווג הפעלה שנבחרה לחצן. הצג את נתוני הניקוד של MARCO בחלון פרטי תמונה לאחר קריאת הדמיה עבור כל 1,536 הבארות.
    הערה: הסיווג יימשך בדרך כלל בין 2-5 דקות, בהתאם למהירות המחשב ולזיכרון הזמין. האלגוריתם מייצר ציונים המסווגים את התוכן למחלקות "גביש", "ברור", "מזרז" או "אחר". הערכים המספריים המשויכים לסיווג של כל באר משקפים את הסבירות של הבאר המכילה אובייקטים מאותה קבוצה.
    1. הצג תת-ערכה של התמונות שקיבלו ניקוד על-ידי סימון התיבות הרצויות בחלונית Image Filtering ולחיצה על הלחצן Submit Filters . לדוגמה, הצג רק את התמונות המסווגות על ידי MARCO כגבישים על-ידי סימון התיבות גבישים ו- MARCO ולחיצה על שלח מסננים.
  4. הניקוד ידני של תמונות הגביש כדי ליצור את ערכת "הניקוד האנושי". הקצה ציון לבאר על ידי לחיצה על הכפתור המתאים (הלחצנים "קריסטל", "ברור", "מזרז" או "אחר" ממוקמים בחלונית סיווג בתחתית החלון). לחלופין, השתמש במקלדת הנומרית כדי להקצות את הניקוד (1 = "קריסטל", 2 = "ברור", 3 = "מזרז", 4 = "אחר"). להגדיר תמונה שקיבלה ניקוד אנושי כ"מועדפת" על ידי סימון המועדפת? תיבה.
    הערה: הצג רק את התמונות המסווגות על-ידי אדם כגבישים על-ידי סימון התיבות קריסטלים ואנושי ולחיצה על שלח מסננים. לחיצה על התיבה Favorites בחלונית Filtering מצמצמת עוד יותר את התמונות שהוחזרו, ומחזירה רק את תמונות הגביש שקיבלו ניקוד אנושי שגם הן מועדפות.
  5. השתמש בכרטיסייה Plate Viewer כדי להציג בארות מרובות בו זמנית. בכרטיסייה השניה Plate Viewer בחלונית Controls , בחר 16, 64 או 96 תמונות מהתפריט הנפתח במקטע Images Per Plate . השתמש בכרטיסיה סינון תמונות כדי לאפור תמונות שאינן מעניינות. בחרו בתיבה 'החל מסנן' כדי לסנן את התמונות.
    הערה: לדוגמה, בחר את התיבות "אדם" ו"קריסטל", ורק הבארות שאדם הבקיע כגביש ייראו בקלות.
    1. נווט בכרטיסייה מציג הצלחות , על ידי לחיצה על הבא כפתור כדי להציג את הקבוצה הבאה של תמונות 16/64/96. כברירת מחדל, תמונות שקיבלו ניקוד כקריסטלים הן אדומות, התמונות שקיבלו ניקוד ברור הן כחולות, התמונות שקיבלו ניקוד כמשקע הן ירוקות, והתמונות שקיבלו ניקוד כתמונות אחרות הן בצבע כתום. שנה את הצבעים באמצעות התפריטים הנפתחים.
    2. בחר את המידע שיוצג על הבארות על-ידי סימון תיבות שונות בכרטיסיה תוויות .
    3. לחץ על שמור תצוגה כדי לשמור קובץ תמונה של התצוגה הנוכחית.
    4. לחץ על Swap Spectrum כדי לעבור בין תמונות brightfield, SHG ו- UV-TPEF לקבלת התמונה מרובת הקידוחים.
  6. לחץ על יצוא ובחר את סוג הקובץ המתאים מהתפריט הנפתח כדי לייצא את הקבצים הניקוד לשימוש בתוכניות אחרות.
    הערה: קובצי CSV (ערכים מופרדים באמצעות פסיקים) תואמים לתוכניות גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel או Google Sheets. ניתן לפתוח קובצי JSON (JavaScript Object Notation) עם רוב עורכי הטקסט. ניתן להשתמש ב- PPTX (מצגת PowerPoint) להצגת תמונות מ- Polo, כולל השוואה של תמונות brightfield, UV-TPEF ו- SHG. הקבצים נשמרים בתבנית .xtal לפתיחה מחדש בממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo.
    1. שמור קובץ בתבנית .xtal על-ידי לחיצה על קובץ בחלק העליון של הדף ולאחר מכן בחירה באפשרות שמור הפעלה או שמור הפעלה בשם. ספק שם קובץ ומיקום ספריה.
    2. פתח קבצים בתבנית .xtal על-ידי לחיצה על ייבוא ובחירה בתמונות ולאחר מכן מהפעלה שמורה. אתר את מיקום הקובץ המתאים, לחץ על שם הקובץ ולאחר מכן לחץ על פתח.

תוצאות

התוצאות של ניסוי סינון גבישי בן 1,536 בארות מורכבות משבע מערכות שלמות של תמונות שדה בהיר שנאספו ביום 0 (בקרה שלילית), יום 1, שבוע 1, שבוע 2, שבוע 3, שבוע 4 ושבוע 6 (איור 4). תמונות SONICC נאספות בנקודת הזמן של 4 שבועות עבור צלחות מודגרות ב -23 ° C ובנקודת הזמן של 6 שבועות עבור צלחות מודגרות ב -4 ° C או 14 ° C. בסך הכל, לאחר שדגימה נשלחה, משתמשים יכולים לצפות להגדרת הצלחות שלהם תוך יום אחד מההגעה. התמונות יועלו תוך כדי איסוף. ניסוי סינון ההתגבשות מסתיים לאחר 6 שבועות.

מערך הלוחות בן 1,536 הקידוחים מאפשר לבצע את כל ניסויי הסינון בתוך אותה לוחית, ובכך להגביל את צריכת הדגימה ולהקל על הדמיה והשוואה ישירה בין שיטות ההדמיה. תוצאות מייצגות עבור מהלך הזמן של גדילת גבישים עבור קוקטייל יחיד מוצגות באיור 4. הדמיית לוחות אוטומטית במהלך הניסוי מאפשרת זיהוי של גבישים הגדלים במהירות ובאיטיות על ידי הדמיה של שדה בהיר. הדמיית UV-TPEF ו-SHG מאפשרת אימות צולב של הפגיעות שנצפו על-ידי הדמיה של שדה בהיר ומצביעות על כך שהגבישים שנצפו הם חלבוניים וגבישיים, בהתאמה (איור 5A,B). יתר על כן, הדמיה של SONICC מאפשרת זיהוי של גבישים שמוסתרים חזותית על-ידי משקעים או יריעות (איור 5C) או מיקרו-גבישים שאחרת עלולים להיחשב בטעות כמשקעים (איור 5D). עבור גבישים מסוימים, היעדר אות SHG אינו פוסל, מאחר שקבוצות נקודתיות מסוימות אינן מייצרות אות SHG35,36, כפי שמדגים גביש התאומטין הטטרגונלי באיור 5C. לעומת זאת, יש לצפות לחוסר אות UV-TPEF עבור חלבונים חסרי שאריות טריפטופן. התצפית של אותות UV-TPEF ו-SHG גם מאפשרת זיהוי של גבישי מלח שאינם חלבונים, אשר יופיעו בשדה בהיר ויציגו אות SHG חיובי חזק, אך יחסרו אות UV-TPEF (איור 5E).

ניתוח תמונה עבור הגדרת הצלחת הוא יעיל עם MARCO פולו GUI, אשר גם מאגד את העברת הנתונים ftp משרתי HWI (כחלופה להעברת קבצים עם FileZilla). ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מאפשר צפייה קלה בלוחות ובתמונות ומבצע ניקוד תמונה חישובי באמצעות אלגוריתם MARCO, כך שניתן להוריד, להציג ולנתח במהירות את תוצאות התמונה ממרכז HTX. אלגוריתם הניקוד של MARCO, כפי שהוא מיושם בממשק המשתמש הגרפי של MARCO Polo, מסוגל להבקיע תמונות מכל הלוח בן 1,536 הבארות בפחות מ-5 דקות. תמונות המסומנות כגבישיות על-ידי אלגוריתם MARCO ניתנות למיון לאחר מכן על-ידי ממשק המשתמש הגרפי של Polo לתצוגה. מכיוון שאלגוריתם MARCO הותאם לזיהוי גבישים ולמזעור שליליים כוזבים כדי לא לפספס פגיעות חיוביות, הניקוד יכול לגרום לדגלים חיוביים כוזבים. עם זאת, היכולת של MARCO להגביל את קבוצת התמונות שיש לבחון על ידי מיקוד תשומת הלב בבארות עם סבירות גבוהה להכיל גבישים מביאה להפחתה משמעותית בנטל עיבוד הנתונים עבור המשתמשים. היישום הנוח של האלגוריתם בפלטפורמת הצפייה הידידותית למשתמש MARCO Polo, עם היכולת למיין תמונות על בסיס ציוני MARCO, משפר מאוד את יכולת המשתמש לנתח את מערך הנתונים במהירות ולקבוע במדויק פגיעות קריסטל.

דיאגרמת התגבשות חלבונים: תהליך התקנה והדמיה עם מטפלים רובוטיים, אנליזה של MARCO Polo.
איור 1: סכמטי של ניסוי סינון התגבשות של 1,536 בארות בתפוקה גבוהה שבוצע במרכז HTX. (1) בשלב זה מוסיפים לכל באר 5 מיקרוליטר שמן פרפין ו-200 ליטר קוקטייל (שלב פרוטוקול 3.1 ושלב 3.5). איור מצויר של באר אחת המכילה רק שמן וקוקטייל ותמונה מייצגת מוצגים מימין. (2) הדגימות מגיעות למרכז HTX (שלב פרוטוקול 5.1). 3) בשלב זה, 200 nL של מדגם מתווסף לכל באר (פרוטוקול שלב 5.4). (4) כל 1,536 הבארות מנוטרות לאורך זמן באמצעות הדמיית שדה בהיר, 5) וכן שיטות UV-TPEF ו-SHG (שלב פרוטוקול 6). 6) ממשק המשתמש הגרפי בקוד פתוח התומך בבינה מלאכותית משמש לצפייה, ניקוד וניתוח של תמונות ההתגבשות (שלב פרוטוקול 7). קיצורים: HTX = התגבשות בתפוקה גבוהה; UV-TPEF = UV-שני פוטון פלואורסצנטי מעורר; SHG = דור הרמוני שני; AI = בינה מלאכותית; GUI = ממשק משתמש גרפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיית מיקרופלייט: שיטות UV-TPEF, SHG גלויות פי 7 לניתוח חומרים ועירור אופטי.
איור 2: לוחות בודדים של 1,536 בארות המכילים ניסויי הקרנה, שצולמו באמצעות הדמיה של שדה בהיר, UV-TPEF ו-SHG. הצלחות בנות 1,536 הבארות מוצגות עם פרוטה אמריקאית לקנה מידה (למעלה). כל ניסוי סינון מצולם פעם אחת לפני ההתקנה ושש פעמים לאחר הוספת הדגימה עם הדמיית שדה בהיר (שבע ערכות תמונה כוללות של שדה בהיר, משמאל). הלוחות עוברים הדמיה UV-TPEF (במרכז) ו-SHG (מימין) לאחר 4 שבועות או 6 שבועות. קיצורים: UV-TPEF = UV-two-photon excited fluorescence; SHG = דור הרמוני שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תהליך העברת צלחות 96, 384 ו-1536 בארות; דיאגרמה המציגה הגדרת מיקרו-לוחות ומיפוי נתונים.
איור 3: סכמטי המראה כיצד נוצרים לוחות של 1,536 בארות. שישה עשר בלוקים של 96 בארות DW משמשים להחתמת ארבע צלחות של 384 בארות, כאשר כל רביע מכל צלחת של 384 בארות ממולא על ידי חלוקת קוקטיילים של התגבשות. ארבעה בלוקים DW של 96 בארות ממלאים צלחת אחת של 384 בארות (באמצע). ארבע צלחות בנות 384 בארות משמשות להטבעה של צלחת בודדת בת 1,536 בארות (מימין). קיצור: DW = באר עמוקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח צמיחה במיקרוסקופיה של ברייטפילד, תמונות פלואורסצנטיות SHG ו-UV-TPEF, השוואה שבוע אחר שבוע.
איור 4: מהלך זמן מייצג של באר בודדת בניסוי סינון של 1,536 בארות. הלוחות מצולמים לפני הגדרת הדגימה (יום 0), כמו גם עם הדמיה של שדה בהיר ביום 1, שבוע 1, שבוע 2, שבוע 3, שבוע 4 ושבוע 6. הלוחות המודגרים בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס מצולמים עם SONICC בשבוע 4. פסי קנה מידה = 80 מיקרומטר (שדה בהיר), 200 מיקרומטר (SHG, UV-TPEF). קיצורים: SONICC = הדמיה לא ליניארית מסדר שני של גבישים כיראליים; UV-TPEF = UV-שני פוטון פלואורסצנטי מעורר; SHG = דור הרמוני שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מחקר השוואתי של מיקרוסקופיה של גבישים; שיטות brightfield, UV-TPEF ו-SHG; קנה מידה 200 מיקרומטר.
איור 5: תוצאות הדמיה מייצגות עבור ניסויי הקרנת גבישים HT 1,536. תוצאות הדמיה של Brightfield, UV-TPEF ו- SHG מוצגות עבור חמש בארות לדוגמה. (א,ב) גבישי חלבון שנצפו על ידי הדמיה של brightfield, UV-TPEF ו- SHG נראים בבירור בכל שלושת אופני ההדמיה. (C) גביש חלבון המוסתר על ידי סרט צילום בדימות שדה בהיר נראה על ידי הדמיית UV-TPEF; הגביש אינו נצפה על ידי הדמיית SHG עקב חוסר תאימות של קבוצת נקודות. (D) דוגמה למיקרו-גבישים שאומתו על ידי הדמיית UV-TPEF ו-SHG שאחרת עשויים להיחשב כמזרזים. (E) דוגמה לגבישי מלח שנראים גבישיים על ידי הדמיית שדה בהיר ו-SHG אך אינם מציגים אות UV-TPEF. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קוטר באר = 0.9 מ"מ. קיצורים: UV-TPEF = UV-two-photon excited fluorescence; SHG = דור הרמוני שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: פתיחת קובצי תמונה ב-MARCO Polo. ניתן לפתוח קובצי תמונה בתוך ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo על-ידי ניווט אל ייבוא |הכרטיסיה 'תמונות' בחלק העליון (א). שים לב שניתן להעביר קבצים גם באמצעות הכלי From FTP ישירות ב- MARCO Polo (a) או שניתן להעביר אותם באמצעות FileZilla כמתואר בפרוטוקול שלב 7.2. כדי לייבא קבצים שכבר הורדו, בחר תמונות | מתוך ארכיון Rar / ספרייה. בחלון המוקפץ שמופיע, בחר אתר תיקייה (b) ונווט אל ספריית הקבצים שבה נשמרים קובצי תמונת הלוחות. לאחר שהקבצים נמצאים בחלון נתיבים נבחרים (c), סמן קובץ ולחץ על Import Runs (d). ממשק המשתמש הגרפי של MARCO Polo יזהה את המטא-נתונים הנכונים של קובץ קוקטייל לייבוא עם התמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

השיטה מתארת צינור בתפוקה גבוהה לבדיקת התגבשות חלבונים הדורש דגימה של 500 מיקרוליטר בלבד עבור 1,536 ניסויי התגבשות בודדים בפורמט מיקרו-אצווה מתחת לנפט. הצינור מסתמך על רובוטיקה לטיפול בנוזלים כדי לסייע במהירות ובשחזור למערך הניסוי, כמו גם על משאב ניתוח התמונה החישובי MARCO Polo, המותאם אישית לניתוח תמונות לוחות של 1,536 בארות באמצעות אלגוריתם MARCO כדי לזהות ולבודד פגיעות גבישיות.

הנפח הקטן של טיפות סינון בודדות (400 nL סה"כ עם יחס של 1:1 של דגימה:קוקטייל) פירושו שנפחי מדגם קטנים במיוחד נדרשים כדי לזהות תנאי התגבשות חיוביים. גודל טיפות קטנות אלה מייצר בהכרח גבישים קטנים שלא ניתן לדוג בלולאה מסורתית. פותחו שיטות לקציר מתוך 1,536 צלחות37; בנוסף, הלוחות עם הגבישים שימשו ישירות במקורות סינכרוטרון לאיסוף נתונים באתרם 38. אם תפותח שיטה חזקה לקצירת גבישים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית הסינכרוטרון והאלומות הממוקדות במיקרו יאפשרו עוד יותר להשיג מערכי נתונים שימושיים. בנוסף, הגבישים המתקבלים יכולים לשמש כזרעים למאמצי אופטימיזציה.

להדמיית SONICC יש יתרון ברור בזיהוי גבישי חלבון קטנים וגבישי חלבון החבויים מתחת לשקע. למרות יתרונות אלה, לא כל סוגי הדגימות מקובלים על הדמיה SHG ו- UV-TPEF. לדוגמה, חלבונים עם מעט או ללא שאריות טריפטופן ארומטיות יציגו אות UV-TPEF מעורפל. יתר על כן, גבישים בקבוצות מרחב ספציפיות, כולל קבוצות צנטרוסימטריות או קבוצת נקודה 432, לא יתגלו על ידי הדמיית SHG. דגימות עם פלואורופורים לפעמים מפריעות לאות SHG, וכתוצאה מכך ביטול האות או עוצמה מוגברת, כלומר פרשנות זהירה של אותות SHG נדרשת עבור חלבונים המכילים מתכת וחלבונים המכילים moieties פלואורסצנטי. עם זאת, במקרים רבים, ניתן לתרץ את היעדר אות SHG או UV-TPEF, והיעדר אותות אלה לא בהכרח צריך לשלול את נוכחותו של גביש חלבון.

פורמט מיקרו-אצווה מתחת לשמן מספק חלופה לשיטת פיזור האדים הנפוצה יותר המשמשת לקריסטלוגרפיה בתפוקה גבוהה. חשוב לציין כי פורמט ההתגבשות משפיע על זיהוי פגיעות39, המספק רציונל לשימוש בפורמטים שונים של התגבשות למאמצי סינון בעלי תפוקה גבוהה. הדמיה אוטומטית ושיטות התומכות ב-SONICC מסייעות בזיהוי מהיר של גבישי חלבונים במהלך קורס זמן ניסויי בן 6 שבועות. לבסוף, ממשק המשתמש הגרפי MARCO Polo מאפשר למשתמשים לנתח במהירות תמונות מ-1,536 תנאים כדי לזהות בארות פגיעה מבטיחות לצורך אופטימיזציה. היכולות במרכז HTX, כולל מערך ניסויי בתפוקה גבוהה התומך ברובוטיקה, יחד עם כלי הדימות והחישוב המתקדמים ביותר לניתוחים, מספקים תרומה משמעותית לקהילת הביולוגיה המבנית על ידי העצמת החוקרים לטפל ביעילות בצוואר בקבוק עיקרי בעבודה מבנית מבוססת גביש: מציאת תנאי התגבשות.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

תודות

ברצוננו להביע את תודתנו למשתמשים שלנו על שהפקידו בידינו את הדגימות היקרות שלהם לבדיקת קריסטלים, כמו גם על מתן משוב קריטי ובקשות שעזרו לנו לחדד ולפתח את המשאבים שלנו כדי לשרת טוב יותר את קהילת הביולוגיה המבנית. ברצוננו להודות גם לאיתן הולמן, ד"ר ליסה ג'יי קיף וד"ר אריקה דוגויד, שהניעו את הפיתוח של ממשק המשתמש הגרפי של מרקו פולו. ברצוננו להודות לעמיתי HWI על תמיכתם והצעותיהם, במיוחד לד"ר דיאנה CF מונטיירו. אנו מאשרים תמיכה במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות, R24GM141256.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1536 באר Imp@ct LBR LoBaseGreiner Bio-One790 801
חומצה אצטיתמחקר המפטוןHR2-853
AlumaSeal II סרט איטוםהמפטון מחקרHR8-069
אמוניום ברומידמידות מולקולריותMD2-100-247
אמוניום כלורידהמפטון מחקרHR2-691
אמוניום הידרוקסידהמפטון מחקרHR2-855
אמוניום חנקתיהמפטון מחקרHR2-665
אמוניום פוספט דו-בסיסיהמפטון מחקרHR2-629
אמוניום פוספט מונו-בסיסיהמפטון מחקרHR2-555
אמוניום גופרתיהמפטון מחקרHR2-541
אמוניום תיוציאנטמידות מולקולריותMD2-100-301
ביצין pH 9.0המפטון מחקרHR2-723
ביס-טריס פרופאן pH 7.0המפטון מחקרHR2-993-08
סידן אצטטהמפטון מחקרHR2-567
סידן כלוריד דיהידרטהמפטון מחקרHR2-557
CAPS pH 10.0ריאגנטים של ריגאקואף אחד לא ניתן
ClearSeal FilmHampton ResearchHR4-521
קובלט סולפט heptahydrateמידות מולקולריותMD2-100-42
מסך קריסטל HT מסךהמפטון מחקרHR2-130
פורמולטורFormulatrix
גליצרולהמפטון מחקרHR2-623
רובוט לטיפול בנוזלי גריפוןארט רובינס מכשירים
HEPES pH 7.0Hampton ResearchHR2-902-03
HEPES pH 7.5Hampton ResearchHR2-902-08
HWI HTX Center טופסהגשת מדגםhttps://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
חומצה הידרוכלוריתהמפטון מחקרHR2-581
אינדקס HT מסךהמפטון מחקרHR2-134
מסך נוזלי יוניהמפטון מחקרHR2-214
ליתיום ברומידמידות מולקולריותMD2-100-312
ליתיום כלורידהמפטון מחקרHR2-631
ליתיום סולפט מונוהידראטהמפטון מחקרHR2-545
מגנזיום אצטט טטרהידרטהמפטון מחקרHR2-561
מגנזיום כלוריד הקסהידרטהמפטון מחקרHR2-559
מגנזיום חנקתי הקסהידרטהמפטון מחקרHR2-657
מגנזיום גופרתי הפטאהידרטהמפטון מחקרHR2-821
מנגן כלוריד טטרהידראטMillipore Sigma63535-50G
מנגן גופרתי מונוהידראטמידות מולקולריותMD2-100-310
MARCO Polo GUI להורדהhttps://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Matrix Platemate 2 x 3 נוזל טיפול רובוטThermo Scientific
MES pH 6.0Hampton ResearchHR2-943-09
רובוט לטיפול בנוזלי יתושיםSPTLabtech
שמן פרפין/שמן מינרלי לבן Saybolt צמיגות 340-365 ב-100 מעלות; F סיגמא אולדריץ'PX0045-3
PEG 1000המפטון מחקרHR2-523
PEG 2000המפטון מחקרHR2-592
PEG 20000המפטון מחקרHR2-609
PEG 3350המפטון מחקרHR2-527
PEG 400המפטון מחקרHR2-603
PEG 4000המפטון מחקרHR2-529
PEG 6000המפטון מחקרHR2-533
PEG 8000המפטון מחקרHR2-535
PEG/יון HT מסךהמפטוןמחקר HR2-139
PEGRx HT מסךהמפטון מחקרHR2-086
הזמנותhtslab@hwi.buffalo.edu
אשלגן אצטטהמפטון מחקרHR2-671
אשלגן ברומידהמפטון מחקרHR2-779
אשלגן פחמתימידות מולקולריותMD2-100-311
אשלגן כלוריהמפטון מחקרHR2-649
אשלגן חנקתיהמפטון מחקרHR2-663
אשלגן פוספט dibasicHampton ResearchHR2-635
אשלגן פוספט-מונו-בסיסיHampton ResearchHR2-553
אשלגן פוספט-טריביסיקמידות מולקולריותMD2-100-309
אשלגן תיוציאנטHampton ResearchHR2-695
Rock Imager 1000 עם SONICCFormulatrix
Rock Imager 54Formulatrix
Rubidium chlorideMillipore SigmaR2252-10G
SaltRx HT screenHampton ResearchHR2-136
Silver Bullets screenHampton ResearchHR2-096
פרוסה מסך pHהמפטון מחקרHR2-070
נתרן אצטט pH 5.0המפטון מחקרHR2-933-15
נתרן ברומידהמפטון מחקרHR2-699
נתרן כלוריהמפטון מחקרHR2-637
נתרן ציטראט pH 4.2המפטון מחקרHR2-935-01
נתרן ציטראט pH 5.6המפטון מחקרHR2-735
נתרן הידרוקסידהמפטון מחקרHR2-583
נתרן מוליבדט דיהידראטמידות מולקולריותMD2-100-207
נתרן חנקתיהמפטון מחקרHR2-661
נתרן פוספט מונו-בסיסיהמפטון מחקרHR2-551
נתרן תיוסולפט פנטהידראטמידות מולקולריותMD-100-307
StockOptions מסך פולימרהמפטון מחקרHR2-227
Tacsimate pH 7Hampton ResearchHR2-755
TAPS pH 9.0bioWORLD40121071
Tris pH 8Hampton ResearchHR2-900-11
Tris pH 8.5Hampton ResearchHR2-725
ViaFLO 384Integra
ViaFLO 384 384 ראש פיפטור תעלות (0.5-12.5µ L)פיפטור Integra
ViaFLO 384 96 ערוצים (300µ L)אינטגרה
אבץ אצטט דיהידרטהמפטון מחקרHR2-563
צלחת ראש

מקורות

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030(2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95(2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024(2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091(2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451(2019).
  28. Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883(2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סינון בתפוקה גבוהה להשגת פגיעות קריסטליות לקריסטלוגרפיה של חלבונים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.