קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

הגנום של אורגניזם מכיל לא רק את כל הגנים הדרושים לתפקוד, אלא גם את כל ההוראות כיצד ומתי להשתמש בהם. זה הופך את ויסות הגישה לגנום לאחד התפקידים החשובים ביותר של התא. ישנם מנגנונים רבים לשליטה בתפקוד הגנים; עם זאת, ברמת הבסיס שלו, בקרת גנים מסתכמת ביכולתם של גורמי שעתוק רגולטוריים (טרנס-פקטורים) להיקשר לרצפי הדנ"א הספציפיים שלהם (רצפי CIS-Regulatory ). זו אינה יכולת מולדת; במקום זאת, הוא נשלט על ידי הארגון/המבנה של הגנום בגרעין, אשר שולט על זמינות/חשיפה של רצפי CIS-regulatory לגורמים טרנס-פקטוריים ^1,2,3. אם הגורמים הטרנס-פקטוריים אינם יכולים למצוא את הרצפים הרגולטוריים שלהם, אז הטרנס-פקטורים אינם יכולים לבצע את משימות הרגולציה שלהם. עובדה זו הפכה את הבנת האופן שבו גנומים מאורגנים בגרעין למקור חשוב לחקירה.

מקובל שבמהלך שלב הביניים, כרומוזומים אאוקריוטים בגרעין תופסים תחום משלהם המעוגן ללמינה הגרעינית ולמטריצה הגרעינית (איור 1), מה שהופך את הכרומוזום לדומה יותר לפרוסת פיצה, ולא לאטריות על צלחת ספגטי. הכרומוזומים מעובים חלקית על ידי אינטראקציות חלבון-דנ"א (כרומטין) המסובבות ולולאות חלקים של הכרומוזום. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, פלואורסצנטיות DNA תלת-ממדית בהכלאה באתרו (FISH), וטכניקות תיוג DNA (כלומר, מתילציה פלואורסצנטית ומלאכותית של DNA), נמצאו תחומים לא פעילים של כרומטין דחוסים בצפיפות לאורך הפריפריה הגרעינית 4,5,6, בעוד חלקים של כרומטין פעיל ופחות מעובה נמצאים בחלק הפנימי של הגרעין ^{7,8,9, 10}. ניסויים אלה מספקים זווית ראייה רחבה של דינמיקת הכרומוזומים, אך עושים מעט כדי ללכוד את השינויים המתרחשים באופן מקומי סביב מנועי הגן שנצפו במחקרי DNase^11,12 ונוקלאוזומים^13,14,15.

המפתח לשחרור דינמיקת כרומטין ברזולוציה גבוהה יותר היה ניסוח טכניקת מיפוי הכרומוזומים התלת-ממדית, 3C. טכניקת 3C עצמה כוללת ארבעה שלבים עיקריים: קישור צולב של כרומטין, עיכול כרומטין על-ידי אנזימי הגבלה, קשירת כרומטין וטיהור דנ"א (איור 2). לאחר מכן ניתן לאפיין את מקטעי הדנ"א המלאכותיים החדשים שנוצרו בתהליך זה כדי לחשוף את הקשר הפיזיקלי ההדוק בין פיסות דנ"א מרוחקות ליניארית¹⁶. טכניקת 3C הפכה לבסיס ליצירת טכניקות ספין-אוף מרובות המשתמשות בשלבים הראשונים של 3C כדי לשאול שאלות רחבות יותר ברחבי הגנום (למשל, Hi-C, 4C, ChIP-C). משפחה זו של טכניקות 3C זיהתה כי כרומוזומים מאורגנים במספר יחידות בדידות הנקראות תחומים הקשורים טופולוגית (TADs). TADs מקודדים בגנום ומוגדרים על ידי לולאות כרומטין שמשני צדיהן גבולות לא לולאתיים ^16,17,18,19. גבולות TAD נשמרים על ידי שני גורמים שמורים אבולוציונית הנמצאים בכל מקום, כולל גורם קשירת CCCT (CTCF) ולכידות, המונעים מלולאות בתוך TADs נפרדים מאינטראקציה^16,20. הלולאות מתווכות על ידי אינטראקציה של טרנס-פקטורים עם הרצפים הרגולטוריים שלהם, כמו גם CTCF ולכידות²¹.

למרות שמחקרים רבים המשתמשים בטכנולוגיות 3C שואלים שאלות רחבות היקף בגנום ומשתמשים בטכניקות איסוף דגימות מסובכות, ניסוח טכניקת 3C מבוסס על טכניקות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית. זה הופך את 3C למסקרן לפריסה הן במעבדות מחקר לתואר ראשון והן במעבדות הוראה. ניתן להשתמש בטכניקת 3C עבור שאלות ממוקדות קטנות יותר והיא גמישה מטבעה להרחבה או למטה (גנים בודדים²², כרומוזומים¹⁶ ו / או גנומים¹⁸) בהתאם למיקוד ולכיוון של השאלות שנשאלו. טכניקה זו יושמה גם על מגוון רחב של מערכות מודל 7,16,19,23 והוכחה להיות תכליתי בשימוש בו. זה עושה 3C טכניקה מצוינת עבור סטודנטים לתואר ראשון כי התלמידים יכולים לצבור ניסיון בטכניקות ביולוגיה מולקולרית משותפת תוך גם צובר ניסיון רב ערך לענות על שאלות מכוונות.

מוצג כאן פרוטוקול מותאם להכנת ספריית 3C המבוסס על פרוטוקולים 24,25,26,27 שפורסמו בעבר. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לכ- 1 × 10⁷ תאים, אם כי הוא יצר ספריות 3C עם מעט כמו 1 × 10⁵ תאים. פרוטוקול זה הוכח כרב-תכליתי ושימש ליצירת ספריות 3C מעוברים של דגי זברה, קווי תאים של דגי זברה ותולעת עגולה (Caenorhabditis elegans) של מבוגרים צעירים (YA). הפרוטוקול צריך להתאים גם לשורות תאים של יונקים, ועם הסתגלות נוספת, שמרים.

מטרת התאמות אלה היא להפוך את 3C לנגיש יותר עבור סטודנטים לתואר ראשון. הקפיד להשתמש בטכניקות דומות לאלה שניתן להשיג במעבדת הוראה לתואר ראשון. טכניקת 3C מספקת הזדמנויות למידה רבות לסטודנטים לתואר ראשון ללמוד טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות שיועילו להתפתחותם על הספסל, בכיתה ובמאמציהם לאחר סיום הלימודים.

1. עיצוב פריימר

הערה: כלי העיצוב של פריימרים 3C זמינים באינטרנט²⁸. לחילופין, ניתן לעצב פריימרים מותאמים אישית על ידי התלמידים (ראו בהמשך).

1. זיהוי מיקומי פריימר
   1. פתח את דפדפן הגנום של UCSC (http://genome.ucsc.edu/), בחר את אורגניזם המחקר וחפש באזור הגנום שיש להעריך באמצעות 3C.
   2. בחלון הבא, הפעל את מסלול האנזימים בכרטיסייה מיפוי ורצף מתחת לדפדפן על ידי לחיצה על Restr Enzymes.
   3. הזן את אנזימי ההגבלה שבהם יש להשתמש והגדר את מצב התצוגה לארוז. לחץ על שלח.
   4. בווריאציה ובחזרות, ודא ש- RepeatMasker מוגדר לצפיפות.
   5. באמצעות אתרי ההגבלה כמדריכים, זהה אתרים מעניינים שאינם בתוך האזורים החוזרים במסכה (פסים שחורים). סמן 300 זוגות בסיסים (bp) המאגפים הן את רצף המעלה והן את הרצף במורד הזרם המקיף את אתר ההגבלה על ידי לחיצה על המיקום (הרצועה העליונה) וגרירה לאורך הרצוי (~ 600 bp).
   6. שחרר את העכבר ותופיע תיבה מוקפצת. שימו לב למיקום הגנומי, לחצו על התקרבות ותנו לדפדפן להתאים את עצמו לבחירה.
   7. רחף עם העכבר מעל הכרטיסיה תצוגה ברצועת הכלים העליונה של הדפדפן ובתפריט הנפתח, בחר DNA.
   8. השאר את אפשרות ברירת המחדל, שים לב לייעוד של רצפים מסיכה (יש אפשרות להפוך אותם N). לחץ על קבל DNA.
   9. לאחר מכן הרצף המסומן יוצג בחלון. העתק והדבק רצף זה לתוך Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
   10. באמצעות הגדרות ברירת המחדל של Primer3, צור פריימרים על ידי לחיצה על בחירת פריימרים.
   11. בתוצאות, שימו לב למיקום אנזים ההגבלה, ובחרו פריימרים שיוצרים מוצר PCR של 200-500 bp עם אתר ההגבלה הממוקם באמצע.
   12. לאחר שלבים אלה, בדיקת עיצוב פריימרים 1 קילו-בסיס (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb ו-20 kb מהאתר(ים) המעניינים.
   13. כדי לעצב את הפריימרים של בקרת הקלט, חזור על שלבים אלה עבור אתר 1-2 kB מהאתר המעניין שאין בו אתר הגבלה, כלומר הוא לעולם לא נחתך.
2. אימות פריימר פונקציונלי
   1. כדי לאמת את פונקציונליות הפריימר, הגדר תגובות PCR באמצעות ריכוזי פריימר מטוהרים ו- DNA גנומי מטוהר. בין אם באמצעים כמותיים או כמותיים למחצה, לקבוע אם פריימרים ליצור את המוצר הצפוי.
   2. עצבו מחדש פריימרים שנכשלים באימות.

2. יום 1

הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול (להקפיא ב -20 ° C) לאחר קישור צולב כרומטין ולאחר איסוף גרעינים. הצעדים לוקחים, בממוצע, 5-6 שעות עם סטודנטים לתואר ראשון.

1. אוסף גרעיני C. elegans למבוגרים צעירים (מעובד מ-Han et ^al.29)
   1. קרוסלינקינג כרומטין
      1. אספו 5,000 תולעי YA ב-30 מ"ל של M9 בינוני בצינור חרוטי של 50 מ"ל, והסתובבו ב-400 × גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      2. שטפו את גלולת התולעת פי 3 יותר עם M9 כדי להסיר חיידקים.
      3. מוציאים את הסופרנטנט, משעים מחדש את גלולת התולעת ב-47.3 מ"ל של M9 המכיל 2.7 מ"ל של 37% פורמלדהיד (2% סופי), ודגרים עם תסיסה (נדנוד או אגוז) למשך 30 דקות ב-RT.
         אזהרה: יש לטפל בפורמלדהיד בזהירות, ולעבוד תחת מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל PPE-lab, כפפות מתאימות והגנה על העיניים). פורמלדהיד הוא חומר מגרה שמשפיע על העיניים, האף, הגרון והריאות.
      4. סובבו את התולעים ב 400 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
      5. הסר את supernatant, ו resuspend את גלולת התולעת ב 50 מ"ל של 1 M גליצין. סובבו את התולעים ב 400 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
   2. אוסף גרעינים
      1. יש להשהות מחדש את כדורית התולעת ב-6 מ"ל של מאגר NP מקורר (50 mM HEPES ב-pH 7.5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0.5mM EGTA, 0.1% Tween 20, 0.2 mM DTT, 0.5 mM זרע, 0.25 mM זרע, 1x מעכב פרוטאז מלא).
      2. מעבירים את מתלה התולעת ל-Dounce רופף בנפח 7 מ"ל על קרח. מקפיצים את הדגימה פי 15, ומחזיקים קרח למשך 5 דקות.
      3. מעבירים את מתלה התולעת ל-Dounce צמוד של 7 מ"ל על קרח. הקפיצו את הדגימה פי 20, והחזיקו קרח למשך 5 דקות.
      4. מעבירים את מתלה התולעת לצינור חרוטי נקי של 15 מ"ל, ומוסיפים חיץ NP ל-10 מ"ל בסך הכל (כ-4 מ"ל).
      5. מערבול את מתלה התולעת על הגדרה גבוהה במשך 30 שניות. לדגור את הדגימה על קרח במשך 5 דקות.
      6. חזור על השלב הקודם.
      7. סובב את תרחיף התולעת ב 100 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      8. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי טרי בנפח 15 מ"ל.
      9. בדוק את הדגימה עבור פסולת תולעת. דמיינו 10 μL של הדגימה עם מיקרוסקופ אור. אם קיימת פסולת תולעת, סובבו את הדגימה בטמפרטורה של 2,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C, השהו מחדש את הגלולה במאגר NP טרי של 10 מ"ל, וסובבו את הדגימה שוב ב-100 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השליכו את הכדורית, בדקו אם יש שאריות תולעים וחזרו על הפעולה עד שהדגימה נקייה משאריות תולעים.
         הערה: לחלופין, ניתן להסיר את פסולת התולעת גם על ידי מאמץ הדגימה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר (6x) ואחריה מסננת תאים של 20 מיקרומטר (6x).
      10. אם הדגימה נקייה מפסולת תולעים, קח 5 μL מהדגימה, הוסף 5 μL של פירונין ירוק מתיל (הגרעינים יהיו כחולים), וספור את הגרעינים עם המוציטומטר.
      11. סובבו את הדגימה בטמפרטורה של 2,000 × למשך 5 דקות ב-4°C
      12. הסר את supernatant, להניח את הדגימות על קרח, ולהמשיך; לחלופין, הקפיאו את הגרעינים בהצמדה, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
2. עיכול כרומטין
   1. להשהות מחדש את הגרעינים ב 450 μL של מים נקיים. מעבירים את הגרעינים לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל.
   2. לדגימה הצולבת, הוסף 60 μL של מאגר אנזים הגבלה 10x DpnII, וערבב היטב.
      הערה: ניתן להשתמש באנזימי הגבלה אחרים שעדיין חותכים DNA מוצלב.
   3. הוסף 15 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) כדי לחלחל את הגרעינים, ודגר עם תסיסה (נדנוד או אגוז) ב 37 ° C במשך 1 שעה.
      אזהרה: SDS הוא חומר מגרה והוא רעיל אם הוא נבלע או נספג דרך העור. יש לטפל בזהירות ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות מתאימות והגנה על העיניים).
   4. להרוות את SDS על ידי הוספת 75 μL של 20% Triton X-100 ולדגור עם תסיסה ב 37 ° C במשך 1 שעה.
   5. קח 10 μL מהדגימה כבקרה לא מעוכלת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   6. הוסף 400 U של DpnII, ודגור ב 37 ° C במשך הלילה עם תסיסה.

3. יום 2

הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 5 שעות להשלים שלבים אלה.

1. עיכול כרומטין
   1. הוסף 200 U נוספים של DpnII, ודגר על הדגימות במשך 4 שעות ב 37 ° C עם תסיסה כדי להבטיח את העיכול המלא של הדגימה מוצלבת.
   2. קח aliquot 10 μL מן הדגימות כמו בקרת העיכול.
   3. נטרל בחום את אנזים ההגבלה על ידי דגירה של הדגימה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 65°C (או בהתאם להוראות היצרן). המשך לשלב 2.1.3.
   4. אם לא ניתן להשבית את האנזים על ידי חום, יש להוסיף 80 μL של 10% SDS, ולדגור על הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 65°C. לאחר מכן, הוסיפו 375 μL של 20% Triton X-100, וערבבו על ידי ערבול. לדגור את הדגימה במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס, ולהמשיך לשלב 2.2.
2. קשירת כרומטין
   1. מעבירים את הדגימה לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל, מתאימים את נפח הדגימה ל-5.7 מ"ל עם H₂O ברמה מולקולרית, ומערבבים על ידי ערבול.
   2. הוסף 700 μL של 10x T4 Ligase buffer, וערבב על ידי ערבול.
   3. הוסף 60 U של T4 DNA Ligase, וערבב על ידי ערבול.
   4. לדגור לילה ב 16 °C (75 °F).

4. יום 3

הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 15-30 דקות להשלים שלבים אלה. לאחר הדגירה הלילית ניתן להקפיא את הדגימות.

1. עיכול חלבונים וקישור הפוך
   1. הוסף 30 μL של proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) לדגימה 3C, ודגור ב 65 ° C לילה עם תסיסה. יש להוסיף 5 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) לבקרת העיכול והלא מעוכל, ולדגור ב-65°C למשך הלילה עם תסיסה.

5. יום 4

הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 4-5 שעות להשלים שלבים אלה.

1. טיהור ספריית 3C
   1. הוסף 30 μL של RNase A (10 מ"ג / מ"ל) לדגימה 3C, ומערבל כדי לערבב. לדגור את הדגימה במשך 45 דקות ב 37 ° C.
   2. מוסיפים 7 מ"ל פנול-כלורופורם לדגימה, ומערבבים על ידי ניעור.
      אזהרה: פנול-כלורופורם מגרה את העור ואת העיניים ועלול לגרום לכוויות אם לא מטפלים במגע. יש להשתמש בפנול-כלורופורם במכסה אדים עם הגנה מתאימה לעיניים וכפפות (ניטריל).
   3. צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את הפאזה המימית, ולהעביר צינור חרוטי נקי 50 מ"ל. מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם, ומערבבים את הדגימה על ידי ניעור.
   4. צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את הפאזה המימית, ולהעביר צינור חרוטי נקי 50 מ"ל. הוסף 7.5 מ"ל של H₂O ברמה מולקולרית, 35 מ"ל של 100% אתנול, ו (אופציונלי) 7 מיקרוליטר של גליקוגן (1 מ"ג / מ"ל). מערבבים על ידי ניעור, ודגרים ב -80 מעלות צלזיוס עד הדגימה מוקפאת.
      הערה: ייתכן שיחלפו שעה או יותר עד שהדגימה תקפא. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
      1. בזמן שדגימת 3C קופאת, טהרו את דגימות הבקרה. לדגימות הבקרה, כוונן את עוצמת הקול ל- 500 μL באמצעות מים ברמה מולקולרית, והוסף 2 μL של תערובת RNase A (10 מ"ג / מ"ל) על ידי הזזת הצינור.
      2. סובב בקצרה כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור. לדגור את הדגימות במשך 45 דקות ב 37 ° C.
      3. לדגימות הבקרה, להוסיף 1 מ"ל של פנול-כלורופורם, ולערבב על ידי ניעור הצינורות. צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את השלב המימי של הפקדים, ומניחים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי 1.5 מ"ל.
      4. מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם, ומערבבים את הדגימה על ידי ניעור. צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את השלב המימי של הפקדים, ומניחים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי 1.5 מ"ל.
      5. הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול ו 2 מיקרוליטר של גליקוגן (1 מ"ג / מ"ל). מערבבים על ידי ניעור ודגרים בטמפרטורה של -80°C למשך 30 דקות.
      6. צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 750 μL של אתנול 70% מקורר.
      7. צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנטנט, ומייבשים את הדגימות באוויר. השהה מחדש את הגלולה ב 50 μL של כיתה מולקולרית H₂O. להקפיא, או להמשיך לשלב 6.
   5. צנטריפוגה את הדגימה במשך 60 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 10 מ"ל של אתנול 70% מקורר. לשבש ולפרק את גלולת הדנ"א על ידי ניעור הדגימה כדי לערבב.
   6. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולאפשר את הדגימה להתייבש חלקית באוויר ב RT. להשהות מחדש את הגלולה ב 150 μL של 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) על ידי pipeting למעלה ולמטה. זוהי "ספריית 3C".
      הערה: הקפא את הדגימה או המשך לניתוח.

6. יום 5

הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 1-2 שעות להשלים שלבים אלה.

1. קביעת איכות הדגימה באמצעות העקומה הסטנדרטית של פריימר הבקרה
   1. לכמת את ריכוז הדנ"א עבור דגימת 3C, כמו גם את כל הבקרות, ולהתאים את הדגימות ל 30 מיקרוגרם / μL (אם הריכוזים מאפשרים זאת). באופן סדרתי הדגימות המדוללות פעמיים ארבע פעמים, והתוצאה היא חמישה דילולים לכל דגימה (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
      הערה: אם לא ניתן לבצע כימות בקלות, דלל סדרתית את הדגימות כפי שצוין לעיל והמשך.
   2. הגדר תגובות PCR עבור 3C, בקרה גנומית ובקרה מעוכלת עבור כל דגימה מדוללת עם פריימרים בקרה: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 10 mM פריימר בקרה (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
   3. בהתאם להוראות עבור התוכנה הספציפית למכונת ה- PCR, הגדר את תוכנית PCR העקומה הסטנדרטית באמצעות תנאי רכיבה כדלקמן: 30 שניות ב- 98 ° C; 30 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
   4. באמצעות התוכנה, ליצור את העקומות הסטנדרטיות עבור הדגימות. לאחר שהתוכנה יוצרת את העקומה, שים לב ליעילות PCR ולערך R² .
2. קביעת ריכוז ה- DNA
   1. כדי לקבוע את ריכוז הדנ"א של דגימות 3C, השוו את הדגימות לדגימת DNA גנומית בריכוז ידוע. דללו את הדגימות ל-30 ננוגרם/מיקרוליטר, ודללו סדרתית את הבקרה הגנומית מ-10 ננוגרם/מיקרוליטר ל-0.01 ננוגרם/מיקרוליטר בצעדים כפולים ליצירת עקומה סטנדרטית.
      הערה: אם לא ניתן לבצע כימות בקלות, דלל את הדגימה ביחס 1:10 והמשך.
   2. הגדר את תגובות ה- PCR עבור 3C, בקרה גנומית ובקרה מעוכלת עבור כל דגימה מדוללת עם פריימרים של הבקרה: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 10 mM פריימר בקרה (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
   3. בהתאם להוראות עבור התוכנה הספציפית למכונת PCR, הגדר את תוכנית PCR העקומה הסטנדרטית באמצעות תנאי הרכיבה כדלקמן: 30 שניות ב- 98 ° C; 30 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
   4. באמצעות התוכנה, ליצור את העקומות הסטנדרטיות עבור הדגימות, שרטוט דגימות 3C על העקומה. השוו את מיקום שפע דגימות 3C לעקומה הסטנדרטית שנוצרה על ידי תגובות הדנ"א הגנומי בריכוז ידוע, והתאימו את דגימות 3C ל-30 ננוגרם/מיקרוליטר.
3. קביעת נוכחות או היעדר אינטראקציה כרומטין
   1. הגדר תגובות qPCR עם 30 ng של דגימת 3C, דגימת בקרה גנומית ודגימת בקרה מעוכלת: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של פריימר 10 mM (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
      הערה: יש להגדיר את התגובות באמצעות פריימר הבקרה, פריימרים לבדיקה עבור loci גנומי בודד, ושילובים רצויים של פריימרים לבדיקה (אתר "a" קדימה ואתר "b" הפוך) המשמשים לקביעת אינטראקציית הכרומטין (איור 3).
   2. בהתאם להוראות התוכנה של מכונת ה- PCR, הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 30 שניות ב- 98 °C; 40 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
   3. לאחר הפעלת ה- PCR, בדוק את חלקת ההגברה. ודא שתגובות ה-PCR מציגות הגברה אקספוננציאלית, המכפילה את עצמה בכל מחזור.
      הערה: תגובות שאינן מציגות הגברה מעריכית אינן ניתנות לניתוח נוסף.
   4. בהתאם להוראות התוכנה של מכונת ה- PCR, הגדר את סף ניסוי ה- qPCR.
   5. יצא את ערכי Ct עבור כל הדגימות.
   6. קבע את יעילות העיכול באמצעות פריימר הבדיקה (TP) ופריימר הבקרה (CP) ערכי Ct מדגימות הבקרה הלא מעוכלת (UC) והבקרה המעוכלת (DC) באמצעות משוואה (1).
      אחוז מעוכל = 100 - (1)
   7. ערכים אלה צריכים להיות בטווח של 80%-90% עיכול. רשום את הערכים האלה (איור 4A).
   8. קבע את אינטראקציית הכרומטין היחסית באמצעות שילוב פריימר הבדיקה (TPC) ופריימר הבקרה (CP) ערכי Ct מדגימות הבקרה הלא מעוכלת (UC) ומדגימות 3C (3C) באמצעות משוואה (2).
      אינטראקציה כרומטין = 100 - (2)
   9. התווה את הערכים של כל דגימה בתרשים עמודות לכל שילוב פריימר בדיקה.
   10. השווה את האות של דגימות 3C לדגימות הבקרה כדי לקבוע אם לדגימת 3C יש העשרה של אינטראקציה כרומטין מסוימת על דגימות הביקורת. דגימות 3C שמראות העשרה על פני הבקרה יכולות להיחשב חיוביות מותנות ודורשות אימות באמצעות ריצוף Sanger (איור 4B).
       הערה: בעת ניתוח נתוני הגרף, חשוב לזכור כי אם לא נעשה שימוש ב"תבנית בקרה" (ראה דיון), לא ניתן להשוות את השפע בין תגובות (כלומר, מקבוצת פריימרים אחת לאחרת).
4. זיהוי מוצרי 3C
   1. הפעל את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1.5%.
   2. דמיינו את הג'ל לגודל הנכון של מוצרי ה-PCR באמצעות קופסת אור UV או מערכת תיעוד ג'ל.
      הערה: ספריות 3C בנויות היטב יכילו מגוון רחב של מקטעי דנ"א, ולמרות אימות קודם של הפריימרים לספציפיות, לתגובות PCR מספריות 3C יש פוטנציאל להכיל פסים רבים (איור 5A). זה לא מונע את הניתוח של ספריות 3C.
   3. הבלו את רצועות המוצרים המתאימות לגודל הקטע הצפוי, ובצעו מיצוי ג'ל של מוצרי PCR בהתאם להוראות ערכה מסחרית או פרוטוקול תוצרת בית המפורט להלן.
      זהירות: אור UV הוא מסרטן ידוע, ויש לנקוט בזהירות רבה כדי להגביל את זמן החשיפה לאור UV. יש ללבוש מגן עיניים עמיד בפני UV, מגן דגימה, כפפות ומעיל מעבדה.
      1. כדי לבנות מחסנית טיהור תוצרת בית, לדקור חור בתחתית של צינור 0.5 מ"ל עם מחט.
      2. ארוז כמות קטנה של כותנה מכדור צמר גפן לתוך החלק התחתון של צינור 0.5 מ"ל, מילוי לא יותר ממחצית הצינור.
      3. מקם את הצינור 0.5 מ"ל לתוך צינור 1.5 מ"ל; ודא שהצינור הקטן יותר מונח על שפת הצינור הגדול יותר, ולא בתוך הצינור.
      4. בזהירות לחתוך קטע ג'ל לחתיכות קטנות יותר, ומניחים אותו בצינור 0.5 מ"ל של המחסנית.
      5. הכניסו את המכלול למקפיא בטמפרטורה של 20°C למשך 5 דקות. סובב את ההרכבה במשך 3 דקות ב- 13,000 × גרם ב- RT.
      6. שמור את הצינור 1.5 מ"ל עם ה- DNA שחולץ בחיץ, והפטר את הצינור 0.5 מ"ל המכיל את פסולת האגרוז.
      7. ניתן לשלוח דנ"א מטוהר לריצוף סנגר באמצעות פריימרים קדימה ואחורה עבור מקטע 3C.
   4. זיהוי מגעי כרומטין באמצעות Blat
      1. עם השלמת הריצוף, יש לקבוע אם הדגימות עומדות בתקני בקרת האיכות כפי שמצוין בדו"ח הריצוף.
      2. עבור רצפים העוברים את ה- QC, פתח קבצי .seq ו- .ab1 (מעקב) בתוכנית עריכת רצף כגון Another Plasmid Editor (ApE), בדוק את קובץ ה- .ab1 לאיתור פסגות קריאות בסיסיות ברורות, וערוך את הפסגות שנקראו בטעות בקובץ .seq.
      3. באמצעות קובץ ה- .seq הערוך, חפש את אתר DpnII. בהתאם לתוצאת הרצף, זה צריך להיות באמצע הדרך לתוך הרצף המדווח.
      4. כדי לקבוע אם הרצף הוא רצף המטרה הצפוי, סמן את אתר DpnII ועוד 30-50 bp של הרצף במעלה הזרם המתאים לפריימר הקדמי של האתרים הגנומיים שנבדקו עבור 3C. בצע חיפוש של רצף זה כנגד מין היעד. ודא שהאתרים הגנומיים תואמים לאלה של הפריימר.
      5. חזור על השלב לעיל עבור רצף הפריימר ההפוך, וודא שהמוקד הגנומי שהוחזר תואם לזה של הפריימר ההפוך.

הליך זה יפיק דגימת 3C ניסיונית אחת ושתי דגימות ביקורת (לא מעוכלות ומעוכלות). באמצעות שלוש דגימות אלה, qPCR בוצע. מתוצאות אלה חושבה יעילות העיכול (משוואה 1) ונרשמה (טבלה 1). מחישובים אלה נקבע כי לדגימת 3C הייתה יעילות עיכול של כ-88% (ממוצע של טבלה 1) בשבעת האתרים הגנומיים שנבדקו.

לאחר מכן, הדגימות נבדקו לנוכחות של מגעי כרומטין ארוכי טווח בין האתרים הגנומיים השונים באמצעות שילובים של פריימרים ספציפיים ללוקי (טבלה 2) ו-qPCR. באמצעות תוצאות אלה חושבו כמויות המכפלה ביחס לערכת פריימר בקרה (משוואה 2) וגרפים להשוואה (איור 4). נתונים אלה הצביעו על כך ש-8 מתוך 10 התגובות היו חיוביות מותנות לאינטראקציות ארוכות טווח.

תגובות ה-PCR הופעלו אז על ג'ל אגרוז. מוצר ה-PCR הצפוי עבור שמונת החיוביים המותנים ותגובה שלילית אחת טוהר בג'ל ונשלח לריצוף סנגר. התוצאות עבור תגובות חיוביות מייצגות (חץ כחול, תיבה כחולה) ושליליות (חץ אדום, תיבה אדומה) מוצגות (איור 5).

איור 1: מבנה הכרומוזומים בגרעין. ארגון כרומוזומים היפותטי בתוך הגרעין. (א) מעטפת גרעינית, קווים שחורים; (ב) למינה גרעינית, כתומה; (C) הטרוכרומטין, קווים דחוסים; (D) אוכרומטין, לולאות רופפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סכמה של פרוטוקול 3C. חלקים מרוחקים של כרומוזומים ליניאריים (כחול, צהוב וורוד) מתקרבים זה לזה בתוך הגרעין באמצעות לולאות רגולטוריות. (A) מבני הלולאה מתווכים על ידי גורמי שעתוק (עיגול אפור וכוכב שחור); אינטראקציות אלה נשמרות באמצעות הצלבה כימית. (B) הלולאות נשברות באמצעות עיכול אנזימטי (קווים שחורים). (C) חתיכות כרומטין מרוחקות קשורות זו לזו דרך הקצוות הדביקים שנוצרו על-ידי העיכול. (D) דנ"א מטוהר מחלבון. (E) הרצף בתוך המקטעים מזוהה וממופה חזרה לגנום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סכימת פריימר 3C. פריימרים 3C מתוכננים סביב אתרי הגבלה במרחקים משתנים מהמיקום הגנומי המעניין. החצים הוורודים מייצגים את ערכות הפריימר הניסיוניות המקיפות אתר DpnII. ניתן לערבב ולהתאים את הפריימרים הניסיוניים כדי להעריך את לולאת הכרומטין באזור. הפריימרים הכתומים מייצגים בקרה שלילית ללא אתר DpnII. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נתוני qPCR מייצגים עבור ניסוי 3C. שפע יחסי של ערכות פריימר מבחן 3C. (A) גרף בקרה המציג את השפע היחסי של המוצר בדגימת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). (ב) ניסוי 3ג; השפע היחסי של המוצר משילובים של פריימרים לבדיקה בקבוצת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הדמיה של מוצרי 3C qPCR. למעלה, ג'ל עם מוצרי נקודת הקצה qPCR עם הדגימות שצוינו. למטה, מייצג קבצי מעקב רצף Sanger עבור התגובות שצוינו. הדגימה הכתומה היא דוגמה לתוצאה חיובית כוזבת (ראו איור 4, r38/34), והמדגם הכחול הוא דוגמה לתוצאה חיובית אמיתית עם אתר DpnII המצוין מעל העקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: יעילות עיכול מחושבת.

טבלה 2: פריימרים לניסוי 3C מייצג.

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.